Her præsenterer vi en protokol til at teste effekten af målrettede behandlinger udvalgt baseret på den genomiske makeup af en tumor. Protokollen beskriver identifikation og validering af strukturelle DNA-rearrangements, indpodning af patienters tumorer i mus og test reaktioner på tilsvarende lægemidler.
Vi præsenterer her en integrativ tilgang til test af effekten af målrettede behandlinger, der kombinerer den næste generation sekventering technolo-gies, terapeutiske målanalyser og lægemiddelrespons overvågning ved hjælp af patient afledte xenografts (PDX). Denne strategi blev valideret ved hjælp af ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair næste generation sekventering (parlamentsmedlemmereq) protokol blev brugt til at identificere strukturelle ændringer og efterfulgt af analyse af potentielt målbare ændringer. Humane tumorer dyrket i immunkompromitterede mus blev behandlet med lægemidler udvalgt baseret på de genomiske analyser. Resultaterne viste en god sammenhæng mellem de forventede og de observerede svar i PDX-modellen. Den præsenterede tilgang kan bruges til at teste effekten af kombinationsbehandlinger og støtte personlig behandling for patienter med tilbagevendende kræft, specielt i tilfælde, hvor standardbehandling mislykkes, og der er behov for at bruge lægemidler off label.
Patient-afledte xenografts (PDXs), som er genereret fra implantation af patienten tumor stykker i immundefekt mus, har vist sig som en kraftfuld præklinisk model til støtte personlig anti-cancer pleje. PDX modeller er blevet udviklet med succes for en række menneskelige maligniteter. Disse omfatter brystkræft og kræft i æggestokkene, maligne melanom, kolorektal cancer, pancreas adenocarcinom, og ikke-småcellet lungekræft1,,2,,3,,4,5. Tumorvæv kan implanteres ortopisk eller heterotopisk. Førstnævnte, betragtes som mere præcise, men teknisk vanskeligt, indebærer transplantation direkte ind i orgel af tumor oprindelse. Disse typer af modeller menes at præcist efterligne histologi af den oprindelige tumor på grund af den “naturlige’ mikromiljø for tumor6,7. For eksempel, orthotop transplantation i bursa af mus æggestok resulterede i tumor formidling i bughulen og produktion af ascites, typisk for kræft i æggestokkene8. Tilsvarende, injektion af bryst tumorer i brystkassen i stedet for abdominal mælkekirtlen påvirket PDX succesrate og adfærd9. Men, orthotop modeller kræver avancerede billeddannelse systemer til at overvåge tumorvækst. Heterotopisk implantation af solid tumor udføres typisk ved at implantere væv i den subkutane flanke af en mus, som giver mulighed for lettere overvågning af tumorvækst og er billigere og tidskrævende7. Men, tumorer vokset subkutant sjældent metastasere i modsætning til som observeret i tilfælde af orthotop implantation10.
Succesraten for engraftment har vist sig at variere og i høj grad afhænge af tumortype. Mere aggressive tumorer og væv prøver, der indeholder en højere procent af tumorceller blev rapporteret at have bedre succesrater12,,13. I overensstemmelse med dette, tumorer stammer fra metastatiske steder blev vist sig at indpode ved frekvenser på 50-80%, mens dem fra primære steder engraft ved frekvenser så lavt som 14%12. I modsætning hertil, væv, der indeholder nekrotiske celler og færre levedygtige tumorceller indpode dårligt. Tumorvækst kan også fremmes ved tilsætning af kældermembran matrix proteiner i vævsblandingen på tidspunktet for injektionen imus 14 uden at gå på kompromis med egenskaberne af den oprindelige tumor. Størrelsen og antallet af vævsstykker beregnet til implantation viste sig også at påvirke succesraten for engraftment. Større tumor take-rates blev rapporteret til implantation i sub-renal kapsel sammenlignet med subkutan implantation på grund af evnen af sub-renal kapsel til at opretholde den oprindelige tumor stroma og give værten stromale cellersamt 15.
De fleste undersøgelser bruger NOD / SCID immundefekt mus, som mangler naturlige dræberceller16 og har vist sig at øge tumor engraftment, vækst og metastase sammenlignet med andre stammer14. Men, yderligere overvågning er nødvendig, da de kan udvikle thymiske lymfomer så tidligt som 3-4 måned i alderen13. I ovarietumor transplantationer dyrket i SCID mus, udvækst af B-celler blev med held hæmmet af rituximab, forhindrer udviklingen af lymfomer, men uden at påvirke engraftment af æggestokkene tumorer17.
For nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus, der transporterer en null mutation i genet kodning interleukin 2 receptor gamma kæde18, blev en hyppigt anvendt stamme til generering af PDX modeller. Tumorer fra etablerede PDX modeller passageet til fremtidige generationer af mus er rapporteret at bevare histologiske og molekylære egenskaber for 3 til 6 generationer19,20. Talrige undersøgelser har vist, at behandlingsresultaterne i PDX-modeller efterligner resultaterne af deres tilsvarende patienter2,,3,,4,,21,,22,23. Responsraten på kemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekræft og kolorektal karcinomer svarede til responsraten i kliniske forsøg med de sammelægemidler 24,25. Undersøgelser udført i PDX-modeller, der blev udviklet til patienter, der indgik i kliniske forsøg, viste respons på testede lægemidler svarende til dem, der blev observeret klinisk hostilsvarende patienter 2,,3,,4.
High-throughput genomiske analyser af en patient tumor i forbindelse med PDX modeller giver et kraftfuldt værktøj til at studere korrelationer mellem specifikke genomiske ændringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i nogle få publikationer26,27. For eksempel, terapeutiske reaktioner på EGFR-hæmmer cetuximab i et sæt af kolorektal PDX modeller transporterer EGFR forstærkning, parallelle kliniske reaktioner på cetuximab hos patienter28.
Der er et par udfordringer forbundet med udvikling og anvendelse af PDX-modeller. Blandt dem er tumor heterogenitet29,30, der kan kompromittere nøjagtigheden af behandling respons fortolkning som en enkelt celle klon med højere proliferativ kapacitet inden for en PDX kan vokse de andredem 31, hvilket resulterer i et tab af heterogenitet., Derudover, når enkelt tumor biopsier bruges til at udvikle PDX, nogle af de cellepopulationer kan blive savnet og vil ikke være repræsenteret i den endelige graft. Flere prøver fra samme tumor anbefales til implantation for at løse dette problem. Selvom PDX tumorer tendens til at indeholde alle de celletyper af den oprindelige donor tumor, disse celler er gradvist erstattet af dem af murine oprindelse3. Samspillet mellem murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX modeller er ikke godt forstået. Ikke desto mindre, stromale celler blev vist sig at opsummere tumor mikromiljø33.
På trods af disse begrænsninger er PDX-modeller fortsat blandt de mest værdifulde værktøjer til translationel forskning samt personlig medicin til udvælgelse af patientbehandlinger. Større anvendelser af PDXs omfatter biomarkør opdagelse og drug test. PDX-modellerne anvendes også med succes til at undersøge lægemiddelresistenssmekanismer og identificere strategier til at overvinderesistens 34,35. Denfremgangsmåde, der er beskrevet i dette manuskript gør det muligt for forskeren at identificere potentielle terapeutiske mål i menneskelige tumorer og til at vurdere effekten af tilsvarende lægemidler in vivo , i mus huser indkapslet tumorer, som oprindeligt var genomisk karakteriseret. Protokollen bruger ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gælder for enhver form for tumor tilstrækkeligt aggressiv til at vokse i mus2,,3,12.
Vi beskriver den tilgang og protokoller, vi brugte til at gennemføre en “klinisk forsøg” i PDX modeller, der udnytter molekylære egenskaber af tumoren som opnået ved genomisk profilering at bestemme det bedste valg af lægemidler til test. Flere sekventering platforme er i øjeblikket anvendes til genomisk karakterisering af primære tumorer, herunder hele genom sekventering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høj kvalitet serøs ovariekarcinom, ParPseq at identificere strukturelle ændringer, DNA rearrangements o…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmerne af Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang og Faye R. Harris, MS, for hjælpen til at udføre eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af Mr. og Mrs Neil E. Eckles ‘Gave til Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |