Her presenterer vi en protokoll for å teste effekten av målrettede terapier valgt basert på genomisk sminke av en svulst. Protokollen beskriver identifisering og validering av strukturelle DNA-omorganiseringer, engraftment av pasientenes svulster i mus og testing av tiltak mot tilsvarende legemidler.
Vi presenterer her en integrerende tilnærming for testing av effekt av målrettede terapier som kombinerer neste generasjons sekvensering av technolo-gies, terapeutiske målanalyser og overvåking av legemiddelrespons ved hjelp av pasientavledede xenografts (PDX). Denne strategien ble validert ved hjelp av ovarietumorer som et eksempel. Mate-pair neste generasjon sekvensering (MPseq) protokollen ble brukt til å identifisere strukturelle endringer og etterfulgt av analyse av potensielt målrettede endringer. Menneskelige svulster dyrket i immunkompromitterte mus ble behandlet med legemidler valgt basert på genomiske analyser. Resultatene viste en god sammenheng mellom de forventede og observerte svarene i PDX-modellen. Den presenterte tilnærmingen kan brukes til å teste effekten av kombinasjonsbehandlinger og hjelpe personlig behandling for pasienter med tilbakevendende kreft, spesielt i tilfeller der standardbehandling svikter, og det er behov for å bruke legemidler av etiketten.
Pasientavledede xenografts (PDXs), som genereres fra implantasjon av pasientsvulststykker til immundefeksiale mus, har dukket opp som en kraftig preklinisk modell for å hjelpe personlig anti-kreftbehandling. PDX-modeller er utviklet for en rekke menneskelige maligniteter. Disse inkluderer brystkreft og eggstokkreft, malignt melanom, kolorektal kreft, bukspyttkjertelanokarsinom og ikke-småcellet lungekreft1,,2,,3,,4,5. Tumorvev kan implanteres ortopotopisk eller heterotopisk. Den tidligere, ansett som mer nøyaktig, men teknisk vanskelig, innebærer transplantasjon direkte inn i organet av tumoropprinnelse. Disse typer modeller antas å nøyaktig etterligne histologi av den opprinnelige svulsten på grunn av den “naturlige” mikromiljø for svulsten6,7. For eksempel resulterte ortotopisk transplantasjon i bursa av mus eggstokken i tumorspredning i bukhulen og produksjon av ascites, typisk for eggstokkreft8. På samme måte påvirket injeksjon av brystsvulster i thoraxen i stedet for bukm mammarykjertelen PDX-suksessraten ogatferden 9. Imidlertid krever ortotopiske modeller sofistikerte bildesystemer for å overvåke tumorvekst. Heterotopisk implantasjon av solid svulst utføres vanligvis ved å implantere vev i den subkutane flanken av en mus som gir lettere overvåking av tumorvekst og er billigere og tidkrevende7. Imidlertid dyrket svulster subkutant sjelden sjelden i motsetning til som observert i tilfelle av ortotopisk implantasjon10.
Suksessraten for engraftment har vist seg å variere og er sterkt avhengig av tumortypen. Mer aggressive svulster og vevsprøver som inneholder en høyere prosentandel av tumorceller ble rapportert å ha bedre suksessrater12,13. I samsvar med dette ble svulster avledet fra metastatiske steder vist å engraft ved frekvenser på 50-80%, mens de fra primære steder engraft på frekvenser så lavt som 14%12. I motsetning, vev som inneholder nekrotiske celler og færre levedyktige tumorceller engraft dårlig. Tumorvekst kan også fremmes ved tilsetning av kjellermembranmatriseproteiner i vevsblandingen på tidspunktet for injeksjonen i mus14 uten at det går på bekostning av den opprinnelige svulstens egenskaper. Størrelsen og antall vevsbiter beregnet for implantasjon ble også funnet å påvirke suksessraten for engraftment. Større tumor take-rater ble rapportert for implantasjon i sub-nyrekapselen sammenlignet med subkutan implantasjon på grunn av evnen til sub-nyrekapselen for å opprettholde den opprinnelige svulst stroma og gi verten stromal celler samt15.
De fleste studier bruker NOD/SCID immundefeksinasjonsmus, som mangler naturlige morderceller16 og har vist seg å øke tumoren, veksten og metastasen sammenlignet med andre stammer14. Ytterligere overvåking er imidlertid nødvendig da de kan utvikle thymiske lymfomer så tidlig som 3-4 måneder i alderen13. I ovarietumortransplantasjoner dyrket i SCID-mus, ble utveksten av B-celler vellykket hemmet av rituksimab, og forhindret utvikling av lymfomer, men uten å påvirke engraftment av ovarietumorer17.
Mer nylig, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mus, bærer en null mutasjon i genet koding interleukin 2 reseptor gamma kjede18, ble en ofte brukt belastning for generering av PDX-modeller. Svulster fra etablerte PDX-modeller som er til fremtidige generasjoner av mus, rapporteres å beholde histologiske og molekylære egenskaper i 3 til 6 generasjoner19,,20. Tallrike studier har vist at behandlingsutfallene i PDX-modeller etterligner de av deres tilsvarende pasienter2,3,4,21,22,23. Responsraten på kjemoterapi i PDX-modeller for ikke-små lungekreft- og kolorektalkarsinomer var lik den i kliniske studier for de samme legemidlene24,25. Studier utført i PDX-modeller, utviklet for pasienter som er inkludert i kliniske studier, viste respons på testede legemidler som ligner de som ble observert klinisk hos tilsvarende pasienter2,,3,,4.
Genomiske analyser med høy gjennomstrømning av en pasientsvulst sammen med PDX-modeller gir et kraftig verktøy for å studere korrelasjoner mellom spesifikke genomiske endringer og en terapeutisk respons. Disse er beskrevet i noen få publikasjoner26,27. For eksempel, terapeutiske responser på EGFR-hemmeren cetuximab i et sett med kolorektal PDX-modeller som bærer EGFR-forsterkning, parallelle kliniske responser på cetuximab hos pasienter28.
Det er noen utfordringer knyttet til utvikling og anvendelse av PDX-modeller. Blant disse er tumor heterogenitet29,30 som kan kompromittere nøyaktigheten av behandling respons tolkning som en enkelt celle klone med høyere proliferativ kapasitet i en PDX kan vokse de andre31, og dermed resulterer i tap av heterogenitet. I tillegg, når enkelt tumorbiopsier brukes til å utvikle PDX, kan noen av cellepopulasjonene bli savnet og vil ikke bli representert i det endelige transplantatet. Flere prøver fra samme svulst anbefales for implantasjon for å løse dette problemet. Selv om PDX svulster har en tendens til å inneholde alle celletyper av den opprinnelige donorsvulsten, blir disse cellene gradvis erstattet av de av murin opprinnelse3. Samspillet mellom murine stroma og menneskelige tumorceller i PDX-modeller er ikke godt forstått. Likevel ble stromale celler vist å rekapitulere tumor mikromiljø33.
Til tross for disse begrensningene er PDX-modellene fortsatt blant de mest verdifulle verktøyene for translasjonell forskning samt personlig medisin for valg av pasientbehandling. Store anvendelser av PDXs inkluderer biomarkør oppdagelse og narkotikatesting. PDX-modeller brukes også med hell til å studere resistensmekanismer og identifisere strategier for å overvinne resistens34,35. Tilnærmingen som er beskrevet i det nåværende manuskriptet gjør det mulig for forskeren å identifisere potensielle terapeutiske mål i menneskelige svulster og å vurdere effekten av tilsvarende legemidler in vivo, hos mus som huser transplanterte svulster som i utgangspunktet var genomisk karakterisert. Protokollen bruker ovarietumorer engrafted intraperitoneally men gjelder for alle typer svulster tilstrekkelig aggressiv til å vokse i mus2,3,12.
Vi beskriver tilnærmingen og protokollene vi brukte til å gjennomføre en “klinisk studie” i PDX-modeller som utnytter molekylære egenskaper av svulsten som oppnådd ved genomisk profilering for å bestemme det beste valget av legemidler for testing. Flere sekvenseringsplattformer brukes for tiden til genomisk karakterisering av primære svulster, inkludert hele genomsekvensering, RNAseq og tilpassede genpaneler. For høygradig serøs ovariekarsinom er parlamentsmedlemmer for å identifisere strukturelle endringer, DN…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmene av Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr. Lin Yang og Faye R. Harris, MS, for hjelpen til å gjennomføre eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av Mr. og Mrs. Neil E. Eckles’ Gift til Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |