Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att testa effekten av riktade terapier som valts ut baserat på genomisk makeup av en tumör. Protokollet beskriver identifiering och validering av strukturella DNA-omorganiseringar, engraftment av patienternas tumörer i möss och testa svar på motsvarande läkemedel.
Abstract
Vi presenterar här en integrativ metod för att testa effekten av riktade terapier som kombinerar nästa generations sekvensering technolo-gies, terapeutiska mål analyser och läkemedelsrespons övervakning med hjälp av patienten härledda xenografts (PDX). Denna strategi validerades med hjälp av äggstockscancer tumörer som ett exempel. Mate-pair nästa generations sekvensering (MPseq) protokollet användes för att identifiera strukturella förändringar och följt av analys av potentiellt targetable ändringar. Mänskliga tumörer som odlas i immunkomprometterade möss behandlades med läkemedel som valts ut baserat på de genomiska analyserna. Resultaten visade ett bra samband mellan de förväntade och de observerade svaren i PDX-modellen. Den presenterade metoden kan användas för att testa effekten av kombinationsbehandlingar och stöd personlig behandling för patienter med återkommande cancer, särskilt i de fall då standardbehandling misslyckas och det finns ett behov av att använda läkemedel off label.
Introduction
Patient-derived xenografts (PDXs), som genereras från implantation av patienten tumör bitar i immunodeficient möss, har dykt upp som en kraftfull preklinisk modell för att hjälpa personlig anti-cancer vård. PDX-modeller har framgångsrikt utvecklats för en mängd olika mänskliga maligniteter. Dessa inkluderar bröstcancer och äggstockscancer, malignt melanom, kolorektal cancer, bukspottskörteln adenokarcinom, och icke-småcellig lungcancer1,2,3,,4,5. Tumörvävnad kan implanteras ortopotopically eller heterotopically. Den förra, anses mer exakt men tekniskt svårt, innebär transplantation direkt i organ tumör ursprung. Dessa typer av modeller tros exakt efterlikna histologi av den ursprungliga tumören på grund av den “naturliga” mikromiljö för tumören6,7. Till exempel, orthotopic transplantation i bursa av musen äggstock resulterade i tumör spridning i bukhålan och produktion av ascites, typiska för äggstockscancer8. På samma sätt påverkade injektion av brösttumörer i bröstkorgen i stället för buken bröstkörteln PDX framgång och beteende9. Men orthotopic modeller kräver sofistikerade bildsystem för att övervaka tumörtillväxt. Heterotopic implantation av solid tumör utförs vanligtvis genom implantering vävnad i subkutan flanken av en mus som möjliggör enklare övervakning av tumörtillväxt och är billigare och tidskrävande7. Tumörer som odlas subkutant sällan metastaserar dock till skillnad från vad som observerats vid tandpetitisk implantation10.
Framgången för engraftment har visat sig variera och i hög grad beror på tumörtypen. Mer aggressiva tumörer och vävnadsprover som innehåller en högre procent av tumörceller rapporterades ha bättre framgångpriser 12,13. Överensstämmer med detta, tumörer som härrör från ögonbevarande platser visade sig engraft vid frekvenser på 50-80%, medan de från primära platser engraft vid frekvenser så lågt som 14%12. Däremot vävnad som innehåller nekrotiska celler och färre livskraftiga tumörceller engraft dåligt. Tumörtillväxt kan också främjas genom tillsats av källarmembranmatrisproteiner i vävnadsblandningen vid tidpunkten för injektionen i möss14 utan att kompromissa med egenskaperna hos den ursprungliga tumören. Storleken och antalet vävnadsbitar avsedda för implantation befanns också påverka framgången för engraftment. Större tumör ta-priser rapporterades för implantation i sub-renal kapseln jämfört med subkutan implantation på grund av förmågan hos sub-renal kapseln för att upprätthålla den ursprungliga tumör stroma och ge värden stromal celler samt15.
De flesta studier använder NOD/SCID immunbrist möss, som saknar naturliga mördarceller16 och har visat sig öka tumör engraftment, tillväxt och metastasering jämfört med andra stammar14. Ytterligare övervakning krävs dock eftersom de kan utveckla thymic lymfom så tidigt som 3-4 månaders ålder13. Vid äggstockstumörtransplantationer som odlas i SCID-möss hämmades utväxten av B-celler framgångsrikt av rituximab, vilket förhindrade utvecklingen av lymfom men utan att påverka instämningen av äggstockstumörer17.
På senare tid har NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) möss, bär en null mutation i genen kodning interleukin 2 receptorn gamma kedjan18, blev en ofta använd stam för generering av PDX modeller. Tumörer från etablerade PDX modeller passage till framtida generationer av möss rapporteras att behålla histologiska och molekylära egenskaper för 3 till 6 generationer19,20. Många studier har visat att behandlingsresultaten i PDX-modeller efterliknar behandlingsresultaten hos deras motsvarande patienter2,,3,,4,,21,22,23. Svarsfrekvensen på kemoterapi i PDX-modeller för icke-små lungcancer och kolorektal carcinom liknade den i kliniska prövningar för samma läkemedel24,25. Studier som utförts i PDX-modeller, utvecklade för patienter som rekryterats i kliniska prövningar, visade på svar på testade läkemedel liknande dem som observerats kliniskt hos motsvarande patienter2,,3,4.
Genomiska analyser med hög genomströmning av en patienttumör tillsammans med PDX-modeller ger ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationer mellan specifika genomiska förändringar och ett terapeutiskt svar. Dessa har beskrivits i några publikationer26,27. Till exempel, terapeutiska svar på EGFR-hämmare cetuximab i en uppsättning kolorektal PDX modeller som bär EGFR förstärkning, parallella kliniska svar på cetuximab hos patienter28.
Det finns några utmaningar i samband med utveckling och tillämpning av PDX-modeller. Bland dessa är tumör heterogenitet29,30 som kan äventyra noggrannheten i behandling svar tolkning som en enda cell klon med högre proliferative kapacitet inom en PDX kan växa ur de andra31, vilket resulterar i en förlust av heterogenitet. Dessutom, när enda tumör tarmbiopsier används för att utveckla PDX, kan några av cellpopulationerna missas och kommer inte att vara representerade i det slutliga transplantatet. Flera prover från samma tumör rekommenderas för implantation för att lösa detta problem. Även om PDX tumörer tenderar att innehålla alla celltyper av den ursprungliga givaren tumör, dessa celler gradvis ersättas av de av murint ursprung3. Samspelet mellan murine stroma och mänskliga tumörceller i PDX-modeller är inte väl förstått. Ändå visades stromal celler att rekapitulera tumör mikromiljö33.
Trots dessa begränsningar är PDX-modeller fortfarande bland de mest värdefulla verktygen för translationell forskning samt personlig medicin för att välja patientterapier. Större tillämpningar av PDXs inkluderar biomarkör upptäckt och drogtester. PDX-modeller används också framgångsrikt för att studera läkemedelsresistens mekanismer och identifiera strategier för att övervinna läkemedelsresistens34,35. Den metod som beskrivs i det aktuella manuskriptet gör det möjligt för forskaren att identifiera potentiella terapeutiska mål i mänskliga tumörer och att bedöma effekten av motsvarande läkemedel in vivo, hos möss som hyser engrafted tumörer som ursprungligen genomiskt karakteriserades. Protokollet använder äggstockstumörer engrafted intraperitoneally men är tillämplig på alla typer av tumör tillräckligt aggressiva för att växa i möss2,3,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver den metod och protokoll som vi använde för att genomföra en “klinisk prövning” i PDX modeller som drar nytta av molekylära egenskaper hos tumör som erhålls genom genomisk profilering för att bestämma det bästa valet av läkemedel för testning. Flera sekvenseringsplattformar används för närvarande för genomisk karakterisering av primära tumörer inklusive hela genomsekvensering, RNAseq och anpassade genpaneler. För hög kvalitet serösa äggstockscancer carcinom, MPseq att identifiera struktu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM) Dr Lin Yang och Faye R. Harris, MS, för hjälp med att genomföra experiment. Detta arbete stöddes av Mr och Mrs Neil E. Eckles gåva till Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (CIM).
Materials
| 3M Vetbond | 3M, Co. | 1469SB | |
| anti-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9272 | |
| Anti-GAPDH antibody(G-9) | Santa Cruz Biotech. Inc. | sc-365062 | |
| Anti-MAPK antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9926 | |
| Anti-phospho-AKT antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 9271 | |
| Anti-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2972 | |
| Anti-Phospho-mTOR antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2971 | |
| Anti-Phospho-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 4858 | |
| Anti-Rictor antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2114 | |
| Anti-S6 antibody | Cell Signaling Technologies, Inc. | 2217 | |
| Captisol | ChemScene, Inc. | cs-0731 | |
| Carboplatin | NOVAPLUS, Inc. | 61703-360-18 | |
| DMEM | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Easy-A Hi-Fi PCR Cloning Enzyme | Agilent, Inc. | 600404-51 | |
| Lubricant | Cardinal Healthcare | 82-280 | |
| Matrigel | Corning, Inc. | 356234 | |
| McCoy's media | Mediatech, Inc. | 10-050-CV | |
| MK-2206 | ApexBio, Inc. | A3010 | |
| MK-8669 | ARIAD Pharmaceuticals, Inc. | AP23573 | |
| Nair Sensitive Skin | Church & Dwight Co. | Nair Hair Remover Shower Power Sensitive | |
| NOD/SCID mice | Charles River, Inc. | NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl | |
| Paclitaxel | NOVAPLUS, Inc. | 55390-304-05 | |
| PEG400 | Millipore Sigma, Inc. | 88440-250ML-F | |
| Perjeta | Genetech, Co. | Pertuzumab | |
| Rituximab | Genetech, Co. | Rituxan | |
| RPMI1640 | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| SCID mice | Harlan Laboratories, Inc. | C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg | |
| SLAx 13-6MHz linear transducer | FUJIFILM SonoSite, Inc | HFL38xp | |
| SonoSite S-series Ultrasound machine | FUJIFILM SonoSite, Inc | SonoSite SII | |
| Tween 80 | Millipore Sigma, Inc. | P4780-100ML |
References
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, 3989-3998 (2007).
- Zhang, X., et al. A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models. Cancer Research. 73, 4885-4897 (2013).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Weroha, S. J., et al. Tumorgrafts as in vivo surrogates for women with ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 20, 1288-1297 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. Optimizing the development of targeted agents in pancreatic cancer: tumor fine-needle aspiration biopsy as a platform for novel prospective ex vivo drug sensitivity assays. Molecular Cancer Therapeutics. 6, 1079-1088 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Ricci, F., et al. Patient-derived ovarian tumor xenografts recapitulate human clinicopathology and genetic alterations. Cancer Research. 74, 6980-6990 (2014).
- Fleming, J. M., et al. Local regulation of human breast xenograft models. Journal of Cellular Physiology. 224, 795-806 (2010).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50, 1-10 (2018).
- Sivanand, S., et al. A validated tumorgraft model reveals activity of dovitinib against renal cell carcinoma. Science Translational Medicine. 4, 137-152 (2012).
- Pavía-Jiménez, A., Tcheuyap, V. T., Brugarolas, J. Establishing a human renal cell carcinoma tumorgraft platform for preclinical drug testing. Nature Protocols. 9, 1848-1859 (2014).
- Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nature Protocols. 7, 1138-1144 (2012).
- Cutz, J. C., et al. Establishment in severe combined immunodeficiency mice of subrenal capsule xenografts and transplantable tumor lines from a variety of primary human lung cancers: potential models for studying tumor progression-related changes. Clinical Cancer Research. 12, 4043-4054 (2006).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, 5315-5319 (2013).
- Butler, K. A., et al. Prevention of Human Lymphoproliferative Tumor Formation in Ovarian Cancer Patient-Derived Xenografts. Neoplasia. 19, 628-636 (2017).
- Cao, X., et al. Defective lymphoid development in mice lacking expression of the common cytokine receptor gamma chain. Immunity. 2, 223-238 (1995).
- Dobbin, Z. C., et al. Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer. Oncotarget. 5, 8750-8764 (2014).
- Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
- Malaney, P., Nicosia, S. V., Davé, V. One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy. Cancer Letters. 344, 1-12 (2014).
- Rosfjord, E., Lucas, J., Li, G., Gerber, H. P. Advances in patient-derived tumor xenografts: from target identification to predicting clinical response rates in oncology. Biochemical Pharmacology. 91, 135-143 (2014).
- Braekeveldt, N., Bexell, D. Patient-derived xenografts as preclinical neuroblastoma models. Cell and Tissue Research. 372, 233-243 (2018).
- ‘Perez-Soler, R., et al. Response and determinants of sensitivity to paclitaxel in human non-small cell lung cancer tumors heterotransplanted in nude mice. Clinical Cancer Research. 6, 4932-4938 (2000).
- Fichtner, I., et al. Anticancer drug response and expression of molecular markers in early-passage xenotransplanted colon carcinomas. European Journal of Cancer. 40, 298-307 (2004).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21, 1318-1325 (2015).
- Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28, 2595-2605 (2017).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Mengelbier, L. H., et al. Intratumoral genome diversity parallels progression and predicts outcome in pediatric cancer. Nature Communications. 27, 6125 (2015).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168, 613-628 (2017).
- Marusyk, A., et al. Non-cell-autonomous driving of tumour growth supports sub-clonal heterogeneity. Nature. 514, 54-58 (2014).
- Braekeveldt, N., et al. Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts reflect the microenvironmental hallmarks of aggressive patient tumours. Cancer Letters. 375, 384-389 (2016).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494, 251-255 (2013).
- Girotti, M. R., et al. Application of Sequencing, Liquid Biopsies, and Patient-Derived Xenografts for Personalized Medicine in Melanoma. Cancer Discovery. 6, 286-299 (2016).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA Research. 19, 395-406 (2012).
- Smadbeck, J. B., et al. Copy number variant analysis using genome-wide mate-pair sequencing. Genes Chromosomes and Cancer. 57, 459-470 (2018).
- Kovtun, I. V., et al. Lineage relationship of Gleason patterns in Gleason score 7 prostate cancer. Cancer Research. 73, 3275-3284 (2013).
- Paster, E. V., Villines, K. A., Hickman, D. L. Endpoints for mouse abdominal tumor models: refinement of current criteria. Comparative Medicine. 59, 234-241 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Cheng, Y., et al. MK-2206, a novel allosteric inhibitor of Akt, synergizes with gefitinib against malignant glioma via modulating both autophagy and apoptosis. Molecular Cancer Therapeutics. 11, 154-164 (2012).
- Rivera, V. M., et al. Ridaforolimus (AP23573; MK-8669), a potent mTOR inhibitor, has broad antitumor activity and can be optimally administered using intermittent dosing regimens. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 1059-1071 (2011).
- Heitjan, D. F., Manni, A., Santen, R. J. Statistical analysis of in vivo tumor growth experiments. Cancer Research. 53, 6042-6050 (1993).
- Vargas, R., et al. Case study: patient-derived clear cell adenocarcinoma xenograft model longitudinally predicts treatment response. NPJ Precision Oncology. 2, 14 (2018).
- Harris, F. R., et al. Targeting HER2 in patient-derived xenograft ovarian cancer models sensitizes tumors to chemotherapy. Molecular Oncology. 13, 132-152 (2019).
- Fidler, I. J., et al. Modulation of tumor cell response to chemotherapy by the organ environment. Cancer and Metastasis Reviews. 13, 209-222 (1994).
