Summary
Her er to murine sårhelingmodeller beskrevet, en designet for å vurdere cellulære og cytokinsårhelingsresponser og den andre for å kvantifisere frekvensen av sårlukking. Disse metodene kan brukes med komplekse sykdomsmodeller som diabetes for å bestemme mekanismer ved ulike aspekter ved dårlig sårheling.
Abstract
Sårheling er en kompleks prosess som krever ryddig progresjon av betennelse, granulering vevdannelse, fibrose og oppløsning. Murine-modeller gir verdifull mekanistisk innsikt i disse prosessene; Imidlertid tar ingen enkelt modell fullt ut alle aspekter av sårhelingsresponsen. I stedet er det ideelt å bruke flere modeller for å adressere de forskjellige aspektene ved sårheling. Her beskrives to forskjellige metoder som tar for seg ulike aspekter ved sårhelingsresponsen. I den første modellen blir polyvinylalkoholsvamper subkutant implantert langs musens dorsum. Etter svampgjenfinning kan celler isoleres ved mekanisk forstyrrelse, og væsker kan ekstraheres ved sentrifugering, og dermed tillate en detaljert karakterisering av cellulære og cytokinresponser i det akutte sårmiljøet. En begrensning av denne modellen er manglende evne til å vurdere frekvensen av sårlukking. For dette benyttes en halehudeksisjonsmodell. I denne modellen blir et 10 mm x 3 mm rektangulært stykke halehud skåret langs dorsaloverflaten, nær bunnen av halen. Denne modellen kan enkelt fotograferes for planimetrisk analyse for å bestemme helbredende priser og kan bli utskåret for histologisk analyse. Begge beskrevne metoder kan brukes i genetisk endrede musestammer, eller i forbindelse med modeller av komorbide forhold, som diabetes, aldring eller sekundær infeksjon, for å belyse sårhelingsmekanismer.
Introduction
Det er mange murine modellsystemer tilgjengelig for å undersøke sårhelingprosesser, hver har spesifikke fordeler og begrensninger1,2. Følgende metoder presenterer to murine sår modeller, som hver adresserer et bestemt aspekt av sårhelingsresponsen, og som kan brukes til å identifisere årsaken og effekten av perturbasjoner i responsen på skade. Prosessen med sårheling skjer i forskjellige faser. Den første fasen er inflammatorisk, preget av den raske tilstrømningen av blodplater, nøytrofiler og monocytter / makrofager, samt produksjon av proinflammatoriske cytokiner og chemokiner. Etter oppløsning av betennelse, miljøet overganger til en mer reparativ tilstand med induksjon av profibrotic og proangiogenic cytokiner og vekstfaktorer. Granulasjonsvev deponeres og neofartøy dannes med migrering av myofibroblaster, fibroblaster, epitelceller og endotelceller. I sluttfasen er den foreløpige ekstracellulære matrisen ombygd, og arrdannelse og sårlukking fortsetter2,,3,,4,,5,6,7,8.
Ingen enkelt murine modell gir et system for å studere alle stadier av sårheling2. Her beskrives to kirurgiske sårmodeller: en belyser akutt cellulær og cytokinsårhelingsrespons, og den andre åpner for vurdering av sårlukking samt histologiske analyser. Disse to metodene kan brukes på en komplementær måte for å vurdere effekten av en perturbasjon eller komorbiditet på ulike aspekter av sårhelingsresponsen. Den dorsal subkutan implantasjon av polyvinyl alkohol (PVA) svamper er et system som har blitt brukt i gnagermodeller i flere tiår for å belyse mange aspekter av cellulær og granulering vevresponser 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Denne tilnærmingen gjør det mulig å hente cytokinrike sårvæsker og cellulære infiltrater. I denne modellen plasseres 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stykker PVA-svamp i subkutane lommer gjennom et 2 cm snitt laget på den bakre dorsal midtlinjen. Snittet er lukket med kirurgiske klipp, og svampene kan hentes på senere tidspunkt for celle- og væskeisolasjon. Cellulær og cytokinmiljø av isolerte svamper gjenspeiler de normale stadiene av akutt sårheling opptil ca 14 dager etter implantasjon. På senere tidspunkt er modellen mer fordelaktig for å studere granulering vevdannelse og fremmedlegemet respons1. Med dette systemet er det mulig å isolere > 106 celler, som gir en klar fordel for fenotypiske og funksjonelle analyser og RNA-isolasjon, over isolerende celler fra andre biopsibaserte metoder1,22,23,25,26.
Frekvensen av sårlukking bestemmes ved hjelp av halen hud excision modell. I denne modellen, som opprinnelig beskrevet av Falanga et al. og rapportert av andre27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm full tykkelse delen av hale huden fjernes nær bunnen av halen. Sårområdet er lett visualisert og kan måles over tid. Alternativt kan halevev isoleres for histologisk analyse. Denne tilnærmingen kan brukes som et alternativ til eller i forbindelse med den veletablerte dorsal punch biopsimetoden. De primære forskjellene mellom disse to modellene er frekvensen av sårlukking, tilstedeværelse eller fravær av pels, og hudstrukturen2,31,32. Hale hudsår tilbyr en lengre tidsramme for å vurdere sårlukking, da det tar ca 21 dager for full lukking å oppstå. Dette er i motsetning til unsplinted dorsal punch biopsier, som helbredemye raskere (~ 7-10 dager), hovedsakelig ved sammentrekning på grunn av virkningen av panniculus carnosus. Splinted dorsal punch biopsier helbrede saktere og redusere effekten av kontraktile healing, men stole på tilstedeværelsen av et fremmedlegeme for å begrense kontraktile-baserte mekanismer1,2,27,30,31,33.
De beskrevne sårmodellene er informative for å forstå normale sårhelingsprosesser i fravær av perturbasjon. Mens helbredelsen av gnagerhud er forskjellig på svært betydelige måter fra menneskelig hud, inkludert løs struktur, avhengighet av kontraktile helbredelse og andre anatomiske forskjeller, tilbyr murine-systemet visse fordeler for mekanistiske og screeningstudier. Fremst blant disse er tilgjengeligheten av innavlede stammer og genetiske mutanter, genetisk tractability, og lavere kostnader. Mekanistisk innsikt oppnådd fra murine studier kan oversettes til komplekse dyremodeller som nærmere etterligner menneskelig hudhealing, for eksempel svinsystemet2,31.
I tillegg til å undersøke sårhelingsresponser i steady state, kan disse modellene kombineres med komorbide forhold for å forstå grunnlaget for sårhelingsdefekter på cellulær, cytokin og brutto vevsnivå. Det er i denne spesielle innstillingen at de to modellene kan brukes til felles for å vurdere effekten av en bestemt komorbid tilstand, for eksempel postoperativ lungebetennelse, på både akutt cellulær sårhelingsrespons og frekvensen av sårlukking30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier beskrevet her ble godkjent av Brown University Institutional Animal Care and Use Committee og utført i samsvar med Guide for care and use of Animals of the National Institutes of Health. MERK: i videoen er den kirurgiske draperingen utelatt for demonstrasjonsformål.
1. Subkutan implantasjon av PVA svamper
- Bruk saks til å kutte ark med PVA svamp i 8 mm x 8 mm x 4 mm stykker. Rehydrere bitene av PVA svamp ved å senke dem i sterile 1x PBS i et beger.
- Autoklav svampene i 1x PBS for å sterilisere, og avkjøles helt. Oppbevar autoklappe svamper i sterile 1x PBS ved 4 °C.
- Før du utfører kirurgisk implantasjon, siterer det nødvendige antallet svamper i en steril kulturrett under sterile forhold i en lamiarstrømningshette. Oppbevar de ekstra svampene i steril 1x PBS ved 4 °C for fremtidig bruk. Pass på at svampene svulmer til 1 cm x 1 cm x 0,5 cm etter rehydrering. Et bilde av dehydrerte PVA-svamper er vist i figur 1A.
MERK: For å opprettholde steriliteten til det kirurgiske stedet, krever PVA svampimplantasjonsprosedyren en person til å håndtere musen og forberede det kirurgiske stedet, og en annen person til å utføre implantasjonen. - Bedøve en 8–12 uke gammel hann C57BL/6J-mus ved intraperitoneal injeksjon på 80 mg/kg ketamin. Administrer 40 mg/kg xylazin intraperitonealt for analgesi. Bekreft dybden av anestesi ved tap av pedalrefleks. Forbered operasjonsstedet ved å fjerne håret langs dorsum med clippers. Bruk steril gasbind, påfør povidon-jodløsning på barberingsområdet 2x, etterfulgt av 70% etanol.
- Plasser musen på sterile kirurgiske gardiner. Plasser en oppvarmet pute under de kirurgiske gardinene for å opprettholde musens kjernetemperatur.
- Bruk sterile kirurgiske hansker for å utføre operasjonen. Trekk dorsal huden bort fra underliggende vev med tang, og ved hjelp av steril kirurgisk saks, lage en 2 cm snitt langs dorsal midtlinjen ca 2 cm fremre til bunnen av halen. Mens du holder snittet åpent med sterile tang, bruk sterile buede, stump-tippedkirurgisksaks for å danne en subkutan lomme langs dorsum i en av posisjonene som er angitt i figur 1B.
- Fortsett å bruke tang for å løfte huden bort fra det underliggende vevet. Ved hjelp av steril kirurgisk saks, klem forsiktig en PVA svamp i kulturfatet for å fjerne overflødig PBS. Plukk opp PVA svamp en hjørne ved hjelp av steril kirurgisk saks og, fører med hjørnet holdt av saksen, plassere svampen i subkutan lomme dannet i trinn 1.4.
- Gjenta denne prosessen 5x, plassere totalt seks svamper i subkutane lommer som vist i figur 1B.
- Klyp den forsklinte dorsalhuden sammen med sterile tang og lukk snittet med to sårklips i rustfritt stål.
- Bruk et nytt sett med sterile kirurgiske instrumenter for hver mus. Alternativt kan du bruke en perlesterilisator for å sterilisere instrumenter mellom mus.
2. Isolering av væsker fra PVA svamper
- For å vurdere det akutte såret cytokinmiljø, isolere svamper mellom 1-14 dager etterimplantasjon.
- Forbered et væskeoppsamlingsrør ved å hekke sylinderen på en 5 ml sprøyte i et 16 ml kulturrør.
- Euthanize en mus med implanterte PVA svamper av CO2 kvelning etterfulgt av cervical dislokasjon.
- Fjern de kirurgiske stiftene og åpne snittet med tanntang. Bruk saks til å forlenge snittet langs den dorsal midtlinjen.
- Bruk tang, trekk ut en svamp fra sin subkutane lomme og overfør den til den tilberedte sprøytesylinderen, vær forsiktig med å minimere trykket til svampen. Fjern tilknytning en bindevev som forblir festet til overflaten av svampen. Bruk saks til å dissekere svampen fra det omkringliggende vevet om nødvendig. Gjenta svampfjerningsprosessen med de resterende svampene. Plasser røret som inneholder svampene på isen.
- For å isolere sårvæsken, sentrifuge kulturrøret som inneholder 5 ml sprøyte med svampene på 700 x g i 10 min.
- Etter sentrifugeringen kaster du sprøyten og svampene. Sårvæsken vil ha samlet seg i 16 ml kulturrør. Et representativt bilde av væske samlet inn fra en dag 7 sår er vist i figur 1D. Overfør sårvæsken til et rent rør for langtidslagring ved -80 °C.
3. Isolering av celler fra PVA svamper
- For å vurdere det akutte sårhelingscellulære miljøet, samle svamper mellom 1-14-dagers etter svamp implantasjon. Svamper hentet fra et sår 7 dager etter implantasjon er vist i figur 1E.
- Forbered oppsamlingsmediet som inneholder 1x HBSS (+kalsium/+magnesium/–fenolrød) supplert med 1 % FBS, 1 % HEPES og 1 % penicillin-streptomycin.
- Aliquot 5 ml HBSS-samlingsmedium i et 15 ml konisk rør.
- Trekk ut PVA-svampene fra eutaniserte mus som beskrevet i 2,2–2,4. Plasser svampene i det koniske røret som inneholder 5 ml HBSS-oppsamlingsmedium.
- Overfør svampene og HBSS-kolleksjonsmediet til en 80 ml blenderpose ved å helle. Heng blenderposen fra luken på padleblenderen, plassert slik at padleårene treffer svampene og mediene. Juster innstillingene for padleblenderen for å kjøre høyt i 60 s. Trykk på start.
- Overfør mediet fra blenderposen tilbake til det 15 ml koniske røret med en pipette, og la svampene ligge i posen. Klem svampene for å frigjøre mediet grundig. Juster innstillingene til padleblenderen for å kjøre i 30 s på høyt nivå. Tilsett 5 ml medier i blenderposen og gjenta mageprosessen 2x for totalt tre svampvasker.
- Sentrifuge det koniske røret ved 250 x g i 5 min. En rød pellet av celler og røde blodlegemer vil være synlig på bunnen av det koniske røret etter sentrifugering.
- Kast supernatanten og utfør en rød blodcellelyse: Tilsett 900 μL dH2O til cellepellet og pipette for å blande. Nøytraliser med 100 μL 10x PBS. Tilsett 4 ml 1x PBS i røret for å nøytralisere lysen helt, deretter sentrifuge ved 250 x g i 5 min.
MERK: Lysis-trinnet skal være kort; å forlate vannet i kontakt med cellene i mer enn 3–5 s kan føre til lysse av ikke-røde blodlegemer. - Etter sentrifugering vil en hvitcellepellet som inneholder sårceller blottet for røde blodlegemer være til stede på bunnen av det koniske røret. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i ønsket medium for nedstrømsanalyser.
4. Valgfri flyt cytometri analyse av medfødte leukocytter isolert fra PVA svamp sår
- Resuspender 0,5–1 x 106 sårceller i 25 μL av en 2x oppløsning av blokkering av antistoff som inneholder 10 μg/ml anti-CD16/CD32 FcRγII/III antistoff fortynnet i 1x PBS + 1 % BSA.
MERK: Alle antistoffer bør titreres for å bestemme optimale konsentrasjoner for flow cytometrianalyse. - Inkuber cellene med blokkerende antistoff i 10 minutter på is.
- Lag en 2x master blanding av antistoffer som inneholder 2,5 mg / ml PerCP-eFluor710-Ly6G, 5 mg / ml AV FITC-Ly6C, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F, og 10 mg / ml av eFluor660-F4-80 fortynnet i 1x PBS + 1% BSA. Tilsett direkte 25 μL av antistoffcocktailen til cellene som ruger i blokkering av antistoff.
- Inkuber cellene i 20 minutter på is, beskyttet mot lys.
- Vask cellene 2x med 1x PBS.
- Lag en hovedblanding av amin-reaktiv fikserbar levedyktighet dye-eFluor506 fortynnet 1:1000 i 1x PBS. Resuspender cellepelleten i 50 μL av levedyktighetsfargeoppløsningen.
MERK: Serum må utelukkes fra det fikserbare levedyktighetstrinnet, da det vil forhindre binding av faren til endogene proteiner. Inkuber cellene i 20 minutter på is, beskyttet mot lys. - Vask cellene 2x med 1x PBS. Resuspender cellepelleten i 50 μL av 1% paraformaldehyd.
- Inkuber cellene med 1% paraformaldehyd i 15 min på is, beskyttet mot lys.
- Vask cellene 1x med 1x PBS og resuspend pellet i 1x PBS for flow cytometrisk analyse.
5. Tail hud eksisjon
- Bedøve en 8–12 uke gammel hann C57BL/6J-mus ved intraperitoneal injeksjon på 80 mg/kg ketamin. Administrer 40 mg/kg xylazin intraperitonealt for analgesi. Bekreft dybden av anestesi ved tap av pedalrefleks.
- Forbered det kirurgiske stedet på halen av den bedøvede musen ved hjelp av steril gasbind for å bruke povidon-jodløsning 2x, etterfulgt av en påføring av 70% etanol.
- Definer en 10 mm x 3 mm-seksjon på haleoverflaten, 10 mm fra bunnen av halen (Figur 1C) ved hjelp av en permanent markør for å spore fra en forhåndslaget mal.
- Plasser den bedøvede musen på sterile kirurgiske gardiner.
- Bruk sterile kirurgiske hansker for å utføre kirurgiske prosedyrer. Med et sterilt skalpellblad, gjør et fulltykkelsessnitt langs høyre, bunn og venstre kanter av sårområdet.
- Bruk sterile tang, skrelle den utskårne huden bort fra halen, og bruk steril kirurgisk saks for å kutte bort den øverste kanten av sårområdet.
- Påfør trykk med steril gasbind for å stoppe blødningen.
- Påfør en spraybarrierefilm på sårsengen.
- Fotografer sårene fra fast avstand med jevne mellomrom. Analyser fotografier etter planimetrisk analyse for å bestemme målinger av sårområdet. Alternativt kan du bruke kalipere for å oppnå sårlengde og breddemålinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemisk inflammatorisk respons etter PVA-svampimplantasjon
PVA svamp implantasjon kirurgi generert en systemisk inflammatorisk respons, som demonstrert ved induksjon av IL-6 i plasma 1 dag etter såret (Figur 2A). Andre proinflammatoriske cytokiner, inkludert TNF-α og IL-1β, samt en rekke chemokiner, inkludert CCL2 og CXCL1, ble indusert systemisk i de første 7 dagene etter PVA svampimplantasjon, og har blitt beskrevet andre steder26,30.
Isolering av celler og væsker fra PVA svamp sår
Den primære fordelen med PVA svamp sår modell er evnen til å gjenopprette nok celler for fenotypiske og funksjonelle analyser av den akutte cellulære sårhelingsresponsen. Antall celler som kan gjenopprettes fra PVA svamp sår øker over tid, fra ca 2 x 106 celler per seks svamper på sår dag 1 x 106 til 8 x 106 celler på sår dag 7 (Figur 2B). Celletallet fortsetter å øke utover dag 7. Det anbefales ikke å fortsette denne modellen utover ~ 14 dager fordi svampene blir fullt innkapslet av kollagen og systemet overganger fra modellering en akutt sårheling respons til modellering av en fremmedlegeme granulom1,22,23,25,26. Nøytrofiler, monocytter og makrofager var den primære cellulære infiltraten i PVA svampsår. Nøytrofiler dominerte såret cellulært miljø en dag etter såret, som vurdert av flow cytometrisk analyse (Figur 2C). Monocytter og monocytt-avledede makrofager akkumulert innen 3 dager etter svampimplantasjon, og de tre cellepopulasjonene økte i antall over tid (figur 2C). En representativ flyt cytometri gating strategi for å identifisere nøytrofil, monocytt og makrofag populasjoner er vist i figur 2D. Etter å ha ekskludert celledobler ved hjelp av FSC-H- og SSC-H-parametere (Figur 2D, i og ii),ble ikke-levedyktige celler utelukket ved hjelp av et amin-reaktivt kanytbar levedyktighetsfarge (vist her) eller en nukleinsyrefarge (f.eks. sytox eller propidiumjodid) (figur 2D, iii). Gjenværende cellulær avfall som ikke fjernes av de tidligere gatingtrinnene ble deretter utelukket ved hjelp av FSC-A- og SSC-A-parametere (Figur 2D, iv). Hematopoetiske celler besto av de fleste PVA svamp sårceller og ble identifisert av CD45 uttrykk (Figur 2D, v). Nøytrofiler ble identifisert som Ly6G+Siglec-F– (Figur 2D, vi). Siglec-F+ celler var primært eosinofil (Figur 2D, vii). Gating på Ly6G–Siglec-F– celler, monocytter/makrofager ble identifisert som F4/80+ celler (Figur 2D, viii). F4/80+ celler kan bli ytterligere fraksjonert av Ly6C uttrykk for å skille Ly6Chi inflammatoriske monocytter (Figur 2D, ix) og Ly6Clav monocytt-avledet makrofager (Figur 2D, x)26.
Evnen til å måle cytokiner og andre sårløselige faktorer er en annen fordel for PVA svamp sår modell. Det er mulig å trekke ut opptil 100 μL væske per svamp. Ekstraherte væsker er egnet for en rekke nedstrøms analyser. Påvisning av cytokiner og chemokiner i tidlig og sen sårvæsker av ELISA eller perlebaserte multipleks immunoassays har blitt rapportert andre steder26,30. Det er mulig å få både celler og væsker fra samme sår. For å gjøre dette anbefales det å isolere tre svamper fra den ene siden av dorsal midtlinjen for celleisolering og 3 svamper fra motsatt side av dorsal midtlinjen for væskeekstraksjon.
Vurdering av sårlukking ved hjelp av ansiktsmodellen for haleskinn
Den eksisjonelle halehudmodellen gir et alternativ til dorsal hudpunchbiopsimetoden for å studere langsom sårlukking i fast hud som mangler tett pels. Eksempel bilder av hale hudsår på 1, 7 og 15 dager etter excision er vist i figur 3A. Sårlukking kan kvantifiseres ved å måle området av sårsengen over tid. Dag 7 og dag 15 sårseng områder var ca 70% og 35%, henholdsvis av dagen 1 sårområdet (Figur 3B). Full sårlukking kreves ca. 28 dager. Halehudsåret kan også observeres i tverrsnitt ved histologisk analyse. Figur 3C og figur 3D viser representative bilder av H&E og Massons Trichrome-beiset haletverrsnitt. De laterale margene i den utskårne huden indikeres av pilspisser på haleoverflaten.
Figur 1: Skjematisk av murine sårheling modeller. (A) Side (venstre) og topp (høyre) visning av dehydrerte PVA-svamper som måler 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Illustrasjon av en mus som viser plasseringen av det dorsal midtlinjesnittet (sentral rød linje) og seks 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA-svamper i subkutane lommer. (C) Skjematisk som viser størrelsen og plasseringen av et eksisjonshudsår (10 mm x 3 mm rødt rektangel) på haleoverflaten. (D) Sårvæske isolert fra tre svamper som ble hentet fra subkutan plass 7 dager etter implantasjon. (E) Utseendet på svamper hentet fra såret 7 dager etter implantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Den systemiske og cellulære responsen på PVA-svampimplantasjon. (A) Et tidsforløp på IL-6-nivåer i plasmaet viser at PVA svampimplantasjon induserte en systemisk inflammatorisk respons. Konsentrasjonen av IL-6 ble målt ved hjelp av en multipleks perlebasert immunoassay. (B) Antall celler isolert fra PVA svamper såret økt over tid. (C) Et tidsforløp viser akkumulering av nøytrofiler, monocytter og monocytt-avledede makrofager i PVA svampsår over tid. (D) En representativ gating strategi for celler isolert fra PVA svamp sår viser hvordan å identifisere leukocytter undersett ved flyt cytometrisk analyse. Portene er definert som følger: (i og ii) doublet utelukkelse, (iii) død celle utelukkelse ved hjelp av en amine-reaktiv fikserbar levedyktighet farge, (iv) avfall utelukkelse av FSC-A og SSC-A, (v) CD45+ hematopoietiske celler, (vi) Ly6G+ nøytrofiler, (vii) Siglec-F+ eosinofiler, (viii) Ly6G–Siglec-F– F4/80+ monocytter/makrofager, (ix) F4/80+ Ly6Chi monocytter, og (x) F4/80+Ly6Clave makrofager. Portene ble plassert i henhold til fluorescens-minus en (FMO) kontroller. Dataene som vises i A–C er gjennomsnittet ± SEM, n = 6–10 mus per gruppe i (A), n = 8–9 mus i (B) og n = 6–8 mus i (C). Alle data kombineres fra 2–3 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vurdering av eksisjonshalehudsårheling. (A) Representative fotografier av eksisjonelle hale hudsår tatt 1, 7 og 15 dager etter sår. (B) Frekvensen av lukking av eksisjonelle hale hudsår. Sår ble fotografert annenhver dag. Bildebehandlingsprogramvaren ble brukt til å spore sårsengmargene og beregne sårområdet på angitte tidspunkter. Sårområdet presenteres som en brøkdel av sårområdet målt på dag 1. Representative bilder av haletverrsnitt som var parafininnebygde, seksjonerte og farget med (C) H&E eller (D) Massons Trichrome. Såret ble plassert på dorsaloverflaten på haletverrsnittet; laterale sårmarger indikeres av pilspisser. Dataene som vises i (B) er gjennomsnittet ± SEM, n = 8 mus per gruppe. Data kombineres fra to uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver to håndterbare murine sår modeller som tillater vurdering av akutt sårheling respons. Den første metoden innebærer kirurgisk implantasjon av PVA svamper i dorsal subkutan plass. Denne tilnærmingen gir en klar fordel over biopsibaserte sårmodeller for å studere cellulær sårhelingsrespons på grunn av det store antallet celler og mengde sårvæsker hentet fra de isolerte svampene. For vellykket utførelse av denne prosedyren, opprettholde et sterilt kirurgisk felt ved grundig rengjøring av huden rundt snittet er viktig, som translokasjon av bakterier inn i såret vil betydelig endre løpet av healing. Ved hjelp av celleisolasjonsmetoden som er beskrevet her, er det mulig å isolere minst 1–10 x 106 celler fra PVA-svampene, avhengig av tidspunktet for svampekstraksjon. De fleste celler isolert fra PVA svamp sår er levedyktig (Figur 2D). Men fordi det er mulig for døde celler å utgjøre opptil ~ 20% av isolerte sårceller etter mekanisk forstyrrelse, anbefales det sterkt å bruke en levedyktighetsflekk når du fortsetter med flow cytometribaserte analyser. Celler isolert fra PVA svamp sår er hovedsakelig av hematopoietisk opprinnelse som bestemmes av CD45 positivitet (Figur 2D). Den raske akkumuleringen av nøytrofiler etterfulgt av monocytter og makrofager er i samsvar med de akutte stadiene av sårreparasjon3,,4,,34,,35,36,37,38. Isolerte celler er egnet for nedstrømsanalyser, inkludert immunfenoftyping, cellesortering, kuling, RNA-ekstraksjon og en rekke funksjonelle analyser.
PVA svamp sår modell tillater også for isolering av væsker, som er ideell for å vurdere cytokin og vekstfaktor responser i det akutte sårmiljøet. PVA svamp væsker er egnet for testing av ELISA, perle-baserte multipleks immunoassay, og protein kvantitasjon, blant andre. Tidligere studier har vist gjennom cytokin- og vekstfaktormåling at det tidlige sårmiljøet er inflammatorisk i naturen, med rask induksjon av IL-6, TNF-α og IL-1β fra dag 1-3. Såret miljøet deretter går over til en reparativ tilstand med senere induksjon av pro-angiogene og pro-fibrotic vekstfaktorer, inkludert VEGF og TGF-β22,23,25,26,30.
Mens PVA svamp implantasjonsmodellen er en fordel for å studere akutte sårcellulære og cytokinresponser, er en av begrensningene manglende evne til å måle frekvensen eller graden av helbredelse. Måling av dette aspektet av sårheling kan være nødvendig når du vurderer effekten av en komorbid tilstand på ulike aspekter av sårhelingsresponsen30. For denne målingen foretrekkes biopsibaserte metoder. Her presenteres halehudeksisjonsmodellen. I denne modellen blir en full tykkelse av halehuden skåret ut fra haleoverflaten. Igjen er det viktig å opprettholde et sterilt kirurgisk felt for å unngå å inokulere sårsengen. Bruk av en spraybarrierefilm eller annet sårbelegg anbefales også for å unngå senere sårinfeksjon. Eldre hannmus eller aggressive stammer krever solohus for å unngå forstyrrelse av såret. En spesiell fordel med halen som et sted for å studere sårheling er at det er mer avhengig av re-epitelisering for nedleggelse, som beskrevet av andre27,32,33. I tillegg til å måle sårsengområdet og utføre histologiske analyser, har andre rapportert bruken i vurderingen av effekten av aktuelle intervensjoner i modulering av helbredelsesprosessene33.
Hver av sårmodellene beskrevet i disse metodene gir tydelige fordeler for å forstå sårreparasjonsprosesser i steady state og i nærvær av komorbiditeter. På grunn av den brede tilgjengeligheten av genetisk endrede stammer av innavlede mus, er det også mulig å manipulere sårhelingsresponsen for å svare på mekanistiske spørsmål om prosessen. Videre kan disse systemene implementeres i murine modeller av forhold forbundet med dårlig sårheling inkludert diabetes, aldring, sekundær infeksjon, og andre30,36,39,40. Den mekanistiske innsikten fra murinestudier kan da gi grunnlag for å studere sårheling i dyremodeller med høyere rekkefølge. Sammen gir PVA-svampimplantasjonen og eksisjonsmodellene for halehudmodeller håndsbare og allsidige systemer for å belyse sårhelingsprosesser under steady state og patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Kevin Carlson fra Brown University Flow Cytometry and Sorting Facility for konsultasjon og hjelp med flow cytometri eksperimenter. Bilder i figur 1B og C ble opprettet med BioRender. Kayla Lee og Gregory Serpa er takket for deres fotografiske hjelp. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra følgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean's Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Opplæring i miljøpatologi), og Brown University Research Seed Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17x100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum - Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge - large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
References
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
