Summary

Vurdering af akut sårheling ved hjælp af Dorsale subkutane Polyvinyl Alkohol Sponge Implantation og Excisional Tail Hud Sår Modeller.

Published: March 25, 2020
doi:

Summary

Her er to murine sårhelingsmodeller beskrevet, den ene designet til at vurdere cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner og den anden til at kvantificere hastigheden af sårlukning. Disse metoder kan bruges med komplekse sygdomsmodeller såsom diabetes til at bestemme mekanismer i forskellige aspekter af dårlig sårheling.

Abstract

Sårheling er en kompleks proces, der kræver en velordnet progression af inflammation, granulering væv dannelse, fibrose, og opløsning. Murine modeller giver værdifuld mekanistisk indsigt i disse processer; men ingen enkelt model fuldt ud omhandler alle aspekter af sårheling svar. I stedet er det ideelt at bruge flere modeller til at løse de forskellige aspekter af sårheling. Her er to forskellige metoder, der omhandler forskellige aspekter af sårheling svar beskrevet. I den første model, er polyvinyl alkohol svampe subkutant implanteret langs musen dorsum. Efter svamp hentning, celler kan isoleres ved mekanisk forstyrrelse, og væsker kan udvindes ved centrifugering, hvilket giver mulighed for en detaljeret karakterisering af cellulære og cytokin reaktioner i det akutte sår miljø. En begrænsning af denne model er den manglende evne til at vurdere antallet af sårlukning. Til dette, en hale hud excision model udnyttes. I denne model, en 10 mm x 3 mm rektangulære stykke hale hud er fjernet langs rygoverfladen, nær bunden af halen. Denne model kan let fotograferes til planimetrisk analyse for at bestemme helbredende satser og kan fjernes for histologisk analyse. Begge beskrevne metoder kan anvendes i genetisk ændrede musestammer, eller i forbindelse med modeller af comorbide tilstande, såsom diabetes, aldring, eller sekundær infektion, med henblik på at belyse sårheling mekanismer.

Introduction

Der er mange murine model systemer til rådighed til at undersøge sårheling processer, hver besidder specifikke fordele og begrænsninger1,2. Følgende metoder præsenterer to murine sår modeller, som hver især omhandler et bestemt aspekt af sårheling svar, og som kan bruges til at identificere årsag og virkning af forstyrrelser i reaktionen på skade. Processen med sårheling forekommer i forskellige faser. Den første fase er inflammatorisk, karakteriseret ved den hurtige tilstrømning af blodplader, neutrofiler, og monocytter / makrofager, samt produktion af proinflammatoriske cytokiner og chemokiner. Efter opløsning af inflammation, miljøet overgange til en mere reparativ tilstand med induktion af profibrotiske og proangiogenic cytokiner og vækstfaktorer. Granuleringvæv deponeres og neofartøjer dannes med migration af myofibroblaster, fibroblaster, epitelceller og endotelceller. I de afsluttende faser ombygges den foreløbige ekstracellulære matrix , og ardannelse og sårlukning fortsætter2,3,4,5,6,7,8.

Ingen enkelt murine model giver et system til at studere alle stadier af sårheling2. Her er to kirurgiske sårmodeller beskrevet: den ene belyser akutte cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner, og den anden giver mulighed for vurdering af sårlukning samt histologiske analyser. Disse to metoder kan anvendes på en supplerende måde til at vurdere virkningerne af en uro eller comorbiditet på forskellige aspekter af sårhelingsresponsen. Den dorsale subkutane implantation af polyvinyl alkohol (PVA) svampe er et system, der har været anvendt i gnavere modeller i årtier til at belyse en lang række aspekter af cellulære og granulering væv svar9,10,11,12,13,14,15,,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Denne fremgangsmåde giver mulighed for hentning af cytokin-rige sårvæsker og cellulære infiltrerer. I denne model, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stykker PVA svamp er placeret i subkutane lommer gennem en 2 cm snit lavet på den bageste ryg midterlinjen. Snittet lukkes med kirurgiske clips, og svampene kan hentes på senere tidspunkter for celle- og væskeisolering. Den cellulære og cytokin miljø af isolerede svampe afspejler de normale stadier af akut sårheling op til omkring 14 dage efterimplantation. På senere tidspunkter er modellen mere fordelagtig til at studere granuleringsvævsdannelse og fremmedlegemets respons1. Med dette system er det muligt at isolere > 106 celler, hvilket giver en klar fordel for fænotypiske og funktionelle analyser og RNA-isolation, over isolering af celler fra andre biopsibaserede metoder1,22,23,25,26.

Hastigheden af sårlukning bestemmes ved hjælp af hale huden excision model. I denne model, som oprindeligt beskrevet af Falanga et al. og rapporteret af andre27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm fuld tykkelse del af hale huden fjernes nær bunden af halen. Sårområdet kan let visualiseres og kan måles over tid. Alternativt kan halevæv isoleres til histologisk analyse. Denne fremgangsmåde kan bruges som et alternativ til eller i forbindelse med den veletablerede dorsale punch biopsi metode. De primære sondringer mellem disse to modeller er hastigheden af sårlukning, tilstedeværelse eller fravær af pels, og hudenstruktur2,31,32. Hale hudsår tilbyder en længere tidsramme til at vurdere sårlukning, da det tager cirka 21 dage for fuld lukning at forekomme. Dette er imod unsplinted dorsal punch biopsier, som heler meget hurtigere (~ 7-10 dage), primært ved sammentrækning på grund af virkningen af panniculus carnosus. Splintrede dorsale punch biopsier helbrede langsommere og mindske virkningerne af kontraktile healing, men stole på tilstedeværelsen af et fremmedlegeme til at begrænse kontraktile-baserede mekanismer1,2,27,30,31,33.

De beskrevne sårmodeller er informative til at forstå normale sårhelingsprocesser i mangel af forstyrrelser. Mens heling af gnaver hud adskiller sig i meget betydelige måder fra menneskers hud, herunder løs struktur, afhængighed af kontraktile healing, og andre anatomiske forskelle, murine systemet tilbyder visse fordele for mekanistiske og screening undersøgelser. Først og fremmest blandt disse er tilgængeligheden af indavlede stammer og genetiske mutanter, genetiske tractability, og lavere omkostninger. Mekanistisk indsigt fra murine undersøgelser kan oversættes til komplekse dyremodeller, der i højere grad efterligner menneskers hud heling, såsom svin system2,31.

Ud over at undersøge sårhelingsreaktioner i steady state, kan disse modeller kombineres med comorbide betingelser for at forstå grundlaget for sårhelingsdefekter på cellulære, cytokin, og brutto væv niveau. Det er i denne særlige indstilling, at de to modeller kan bruges i fællesskab til at vurdere virkningerne af en bestemt comorbid tilstand, såsom postoperativ lungebetændelse, på både den akutte cellulære sårheling respons og hastigheden af sårlukning30.

Protocol

Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, blev godkendt af Brown University Institutional Animal Care and Use Committee og udført i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af dyr fra National Institutes of Health.  BEMÆRK: I videoen er den kirurgiske drapere blevet udeladt med henblik på demonstration. 1. Subkutan implantation af PVA svampe Brug en saks til at skære plader af PVA svamp i 8 mm x 8 mm x 4 mm stykker. Rehydrere stykker af PVA svamp ved nedsænkning dem i …

Representative Results

Systemisk inflammatorisk respons efter PVA svamp implantationPVA svamp implantation kirurgi genereret en systemisk inflammatorisk respons, som det fremgår af induktion af IL-6 i plasma 1 dag efter at have såret (Figur 2A). Andre proinflammatoriske cytokiner, herunder TNF-α og IL-1β, samt en række chemokiner, herunder CCL2 og CXCL1, blev induceret systemisk i de første 7 dage efter PVA svampeimplantation og er blevet beskrevet andetsteds26<su…

Discussion

Denne artikel beskriver to tractable murine sår modeller, der giver mulighed for vurdering af den akutte sårheling svar. Den første metode indebærer kirurgisk implantation af PVA svampe i den dorsale subkutane rum. Denne tilgang giver en klar fordel i forhold til biopsi-baserede sårmodeller til undersøgelse af den cellulære sårhelingsrespons på grund af det store antal celler og mængden af sårvæsker fra de isolerede svampe. For en vellykket udførelse af denne procedure, opretholde en steril kirurgisk felt ve…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Kevin Carlson fra Brown University Flow Cytometri og Sortering Facility for høring og bistand med flow cytometri eksperimenter. Billeder i figur 1B og C blev skabt med BioRender. Kayla Lee og Gregory Serpa takkes for deres fotografiske hjælp. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra følgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Uddannelse i miljøpatologi), og Brown University Research Seed Award.

Materials

10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17×100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum – Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).

Play Video

Cite This Article
Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

View Video