Her er to murine sårhelingsmodeller beskrevet, den ene designet til at vurdere cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner og den anden til at kvantificere hastigheden af sårlukning. Disse metoder kan bruges med komplekse sygdomsmodeller såsom diabetes til at bestemme mekanismer i forskellige aspekter af dårlig sårheling.
Sårheling er en kompleks proces, der kræver en velordnet progression af inflammation, granulering væv dannelse, fibrose, og opløsning. Murine modeller giver værdifuld mekanistisk indsigt i disse processer; men ingen enkelt model fuldt ud omhandler alle aspekter af sårheling svar. I stedet er det ideelt at bruge flere modeller til at løse de forskellige aspekter af sårheling. Her er to forskellige metoder, der omhandler forskellige aspekter af sårheling svar beskrevet. I den første model, er polyvinyl alkohol svampe subkutant implanteret langs musen dorsum. Efter svamp hentning, celler kan isoleres ved mekanisk forstyrrelse, og væsker kan udvindes ved centrifugering, hvilket giver mulighed for en detaljeret karakterisering af cellulære og cytokin reaktioner i det akutte sår miljø. En begrænsning af denne model er den manglende evne til at vurdere antallet af sårlukning. Til dette, en hale hud excision model udnyttes. I denne model, en 10 mm x 3 mm rektangulære stykke hale hud er fjernet langs rygoverfladen, nær bunden af halen. Denne model kan let fotograferes til planimetrisk analyse for at bestemme helbredende satser og kan fjernes for histologisk analyse. Begge beskrevne metoder kan anvendes i genetisk ændrede musestammer, eller i forbindelse med modeller af comorbide tilstande, såsom diabetes, aldring, eller sekundær infektion, med henblik på at belyse sårheling mekanismer.
Der er mange murine model systemer til rådighed til at undersøge sårheling processer, hver besidder specifikke fordele og begrænsninger1,2. Følgende metoder præsenterer to murine sår modeller, som hver især omhandler et bestemt aspekt af sårheling svar, og som kan bruges til at identificere årsag og virkning af forstyrrelser i reaktionen på skade. Processen med sårheling forekommer i forskellige faser. Den første fase er inflammatorisk, karakteriseret ved den hurtige tilstrømning af blodplader, neutrofiler, og monocytter / makrofager, samt produktion af proinflammatoriske cytokiner og chemokiner. Efter opløsning af inflammation, miljøet overgange til en mere reparativ tilstand med induktion af profibrotiske og proangiogenic cytokiner og vækstfaktorer. Granuleringvæv deponeres og neofartøjer dannes med migration af myofibroblaster, fibroblaster, epitelceller og endotelceller. I de afsluttende faser ombygges den foreløbige ekstracellulære matrix , og ardannelse og sårlukning fortsætter2,3,4,5,6,7,8.
Ingen enkelt murine model giver et system til at studere alle stadier af sårheling2. Her er to kirurgiske sårmodeller beskrevet: den ene belyser akutte cellulære og cytokinsårhelingsreaktioner, og den anden giver mulighed for vurdering af sårlukning samt histologiske analyser. Disse to metoder kan anvendes på en supplerende måde til at vurdere virkningerne af en uro eller comorbiditet på forskellige aspekter af sårhelingsresponsen. Den dorsale subkutane implantation af polyvinyl alkohol (PVA) svampe er et system, der har været anvendt i gnavere modeller i årtier til at belyse en lang række aspekter af cellulære og granulering væv svar9,10,11,12,13,14,15,,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Denne fremgangsmåde giver mulighed for hentning af cytokin-rige sårvæsker og cellulære infiltrerer. I denne model, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm stykker PVA svamp er placeret i subkutane lommer gennem en 2 cm snit lavet på den bageste ryg midterlinjen. Snittet lukkes med kirurgiske clips, og svampene kan hentes på senere tidspunkter for celle- og væskeisolering. Den cellulære og cytokin miljø af isolerede svampe afspejler de normale stadier af akut sårheling op til omkring 14 dage efterimplantation. På senere tidspunkter er modellen mere fordelagtig til at studere granuleringsvævsdannelse og fremmedlegemets respons1. Med dette system er det muligt at isolere > 106 celler, hvilket giver en klar fordel for fænotypiske og funktionelle analyser og RNA-isolation, over isolering af celler fra andre biopsibaserede metoder1,22,23,25,26.
Hastigheden af sårlukning bestemmes ved hjælp af hale huden excision model. I denne model, som oprindeligt beskrevet af Falanga et al. og rapporteret af andre27,28,29,30, en 1 cm x 0,3 cm fuld tykkelse del af hale huden fjernes nær bunden af halen. Sårområdet kan let visualiseres og kan måles over tid. Alternativt kan halevæv isoleres til histologisk analyse. Denne fremgangsmåde kan bruges som et alternativ til eller i forbindelse med den veletablerede dorsale punch biopsi metode. De primære sondringer mellem disse to modeller er hastigheden af sårlukning, tilstedeværelse eller fravær af pels, og hudenstruktur2,31,32. Hale hudsår tilbyder en længere tidsramme til at vurdere sårlukning, da det tager cirka 21 dage for fuld lukning at forekomme. Dette er imod unsplinted dorsal punch biopsier, som heler meget hurtigere (~ 7-10 dage), primært ved sammentrækning på grund af virkningen af panniculus carnosus. Splintrede dorsale punch biopsier helbrede langsommere og mindske virkningerne af kontraktile healing, men stole på tilstedeværelsen af et fremmedlegeme til at begrænse kontraktile-baserede mekanismer1,2,27,30,31,33.
De beskrevne sårmodeller er informative til at forstå normale sårhelingsprocesser i mangel af forstyrrelser. Mens heling af gnaver hud adskiller sig i meget betydelige måder fra menneskers hud, herunder løs struktur, afhængighed af kontraktile healing, og andre anatomiske forskelle, murine systemet tilbyder visse fordele for mekanistiske og screening undersøgelser. Først og fremmest blandt disse er tilgængeligheden af indavlede stammer og genetiske mutanter, genetiske tractability, og lavere omkostninger. Mekanistisk indsigt fra murine undersøgelser kan oversættes til komplekse dyremodeller, der i højere grad efterligner menneskers hud heling, såsom svin system2,31.
Ud over at undersøge sårhelingsreaktioner i steady state, kan disse modeller kombineres med comorbide betingelser for at forstå grundlaget for sårhelingsdefekter på cellulære, cytokin, og brutto væv niveau. Det er i denne særlige indstilling, at de to modeller kan bruges i fællesskab til at vurdere virkningerne af en bestemt comorbid tilstand, såsom postoperativ lungebetændelse, på både den akutte cellulære sårheling respons og hastigheden af sårlukning30.
Denne artikel beskriver to tractable murine sår modeller, der giver mulighed for vurdering af den akutte sårheling svar. Den første metode indebærer kirurgisk implantation af PVA svampe i den dorsale subkutane rum. Denne tilgang giver en klar fordel i forhold til biopsi-baserede sårmodeller til undersøgelse af den cellulære sårhelingsrespons på grund af det store antal celler og mængden af sårvæsker fra de isolerede svampe. For en vellykket udførelse af denne procedure, opretholde en steril kirurgisk felt ve…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Kevin Carlson fra Brown University Flow Cytometri og Sortering Facility for høring og bistand med flow cytometri eksperimenter. Billeder i figur 1B og C blev skabt med BioRender. Kayla Lee og Gregory Serpa takkes for deres fotografiske hjælp. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra følgende: Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Dean’s Areas of Emerging New Science Award (Brown University), National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, National Institute of Environmental Science (NIES) T32-ES7272 (Uddannelse i miljøpatologi), og Brown University Research Seed Award.
10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
5ml Syringe | BD | 309646 | |
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
Culture Tube, 16mL, 17×100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
Fetal Bovine Serum – Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
ImageJ Software | NIH | ||
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Polyvinyl alcohol sponge – large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |