Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

डॉरसल सबक्यूटेनेस पॉलीविनाइल अल्कोहल स्पंज इम्प्लांटेशन और एक्सीशनल टेल स्किन घाव मॉडल का उपयोग करके तीव्र घाव उपचार का आकलन।

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60653
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Brown University, 2Division of Surgical Research, Department of Surgery, Rhode Island Hospital and The Warren Alpert School of Medicine of Brown University

Summary

यहां, दो मूत्र घाव चिकित्सा मॉडल वर्णित हैं, एक सेलुलर और साइटोकिन घाव चिकित्सा प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और दूसरा घाव बंद होने की दर की मात्रा निर्धारित करने के लिए । इन तरीकों का उपयोग खराब घाव उपचार के विभिन्न पहलुओं के तंत्र को निर्धारित करने के लिए मधुमेह जैसे जटिल रोग मॉडल के साथ किया जा सकता है।

Abstract

घाव उपचार एक जटिल प्रक्रिया है जिसके लिए सूजन, ग्रैनुलेशन ऊतक गठन, फाइब्रोसिस और संकल्प की व्यवस्थित प्रगति की आवश्यकता होती है। Murine मॉडल इन प्रक्रियाओं में मूल्यवान मशीनी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं; हालांकि, कोई भी मॉडल घाव भरने की प्रतिक्रिया के सभी पहलुओं को पूरी तरह से संबोधित नहीं करता है। इसके बजाय, घाव भरने के विभिन्न पहलुओं को संबोधित करने के लिए कई मॉडलों का उपयोग करना आदर्श है। यहां, घाव भरने की प्रतिक्रिया के विविध पहलुओं को संबोधित करने वाले दो अलग-अलग तरीकों का वर्णन किया गया है। पहले मॉडल में, पॉलीविनाइल अल्कोहल स्पंज को माउस डोरसम के साथ कम मात्रा में प्रत्यारोपित किया जाता है। स्पंज पुनर्प्राप्ति के बाद, कोशिकाओं को यांत्रिक व्यवधान द्वारा अलग किया जा सकता है, और तरल पदार्थ केंद्रीकरण द्वारा निकाले जा सकते हैं, इस प्रकार तीव्र घाव वातावरण में सेलुलर और साइटोकिन प्रतिक्रियाओं के विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। इस मॉडल की एक सीमा घाव बंद होने की दर का आकलन करने में असमर्थता है। इसके लिए टेल स्किन एक्सिडेंट मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है। इस मॉडल में, पूंछ त्वचा का 10 मिमी x 3 मिमी आयताकार टुकड़ा पृष्ठीय सतह के साथ, पूंछ के आधार के पास उत्पादित किया जाता है। इस मॉडल को उपचार दरों का निर्धारण करने के लिए प्लैनिमेट्रिक विश्लेषण के लिए आसानी से फोटो खिंचवाई जा सकती है और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उत्पादित किया जा सकता है। दोनों वर्णित तरीकों का उपयोग आनुवंशिक रूप से परिवर्तित माउस उपभेदों में किया जा सकता है, या घाव चिकित्सा तंत्र को स्पष्ट करने के लिए मधुमेह, उम्र बढ़ने या माध्यमिक संक्रमण जैसे कोमोर्बिड स्थितियों के मॉडल के साथ संयोजन के रूप में।

Introduction

घाव भरने की प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए कई मूत्र मॉडल प्रणालियां उपलब्ध हैं, प्रत्येक विशिष्ट लाभ और सीमाएं1,,2रखते हैं। निम्नलिखित विधियां दो मूत्र घाव मॉडल प्रस्तुत करती हैं, जिनमें से प्रत्येक घाव उपचार प्रतिक्रिया के एक विशेष पहलू को संबोधित करती है, और जिसका उपयोग चोट के जवाब में क्षोभ के कारण और प्रभाव की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। घाव भरने की प्रक्रिया अलग-अलग चरणों में होती है। पहला चरण भड़काऊ है, जिसकी विशेषता प्लेटलेट्स, न्यूट्रोफिल, और मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की तेजी से आमद के साथ-साथ भड़काऊ साइटोकिन्स और केमोकिन्स का उत्पादन भी है । सूजन के समाधान के बाद, पर्यावरण प्रोसिब्रोटिक और प्रोएंजियोजेनिक साइटोकिन्स और विकास कारकों को शामिल करने के साथ अधिक प्रतिकार स्थिति में संक्रमण करता है। ग्रैनुलेशन ऊतक जमा किया जाता है और नियोवेसल मायोफीब्रोब्लास्ट, फाइब्रोब्लास्ट, एपिथेलियल कोशिकाओं और एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रवास के साथ बनते हैं। अंतिम चरण में, अनंतिम बाह्युशिकी मैट्रिक्स को फिर से तैयार किया जाता है, और निशान गठन और घाव बंद करने,से2,3,44,,5,,6,,7,,8आय होती है।

कोई भी मूत्र मॉडल घाव भरने के सभी चरणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है2। यहां, दो सर्जिकल घाव मॉडल वर्णित हैं: एक तीव्र सेलुलर और साइटोकिन घाव उपचार प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करता है, और दूसरा घाव बंद होने के साथ-साथ हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के आकलन के लिए अनुमति देता है। इन दो तरीकों को घाव उपचार प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं पर क्षोभ या comorbidity के प्रभावका आकलन करने के लिए एक पूरक फैशन में नियोजित किया जा सकता है। पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) स्पंज का पृष्ठीय चमड़े का प्रत्यारोपण एक ऐसी प्रणाली है जिसका उपयोग दशकों से कृंतक मॉडलों में सेलुलर और ग्रेनुलेशन ऊतक प्रतिक्रियाओं के कई पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए किया जाता रहा है9,,10,,11,,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19,,20 ,21,22,23,24. यह दृष्टिकोण साइटोकिन-समृद्ध घाव तरल पदार्थ और सेलुलर घुसपैठ की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुमति देता है। इस मॉडल में, पीवीए स्पंज के 1 सेमी x 1 सेमी x 0.5 सेमी टुकड़ों को पीछे के पृष्ठीय मिडलाइन पर बने 2 सेमी चीरा के माध्यम से चमड़े के नीचे जेब में रखा जाता है। चीरा शल्य चिकित्सा क्लिप के साथ बंद कर दिया है, और स्पंज सेल और तरल पदार्थ अलगाव के लिए बाद के समय अंक पर प्राप्त किया जा सकता है । अलग स्पंज के सेलुलर और साइटोकिन परिवेश तीव्र घाव के सामान्य चरणों को दर्शाता है लगभग 14 दिनों के postimplantation तक उपचार। बाद के समय में अंक मॉडल ग्रेनेशन ऊतक गठन और विदेशी शरीर प्रतिक्रिया1का अध्ययन करने के लिए अधिक लाभप्रद है । इस प्रणाली के साथ, अन्य बायोप्सी आधारित,23,25,तरीकों,22सेकोशिकाओं को अलग करने पर फेनोटाइपिक और कार्यात्मक परख और आरएनए अलगाव के लिए एक अलग लाभ प्रदान करने वाली 106 कोशिकाओं को अलग करना संभवहै।

घाव बंद करने की दर पूंछ त्वचा एक्सिजन मॉडल का उपयोग कर निर्धारित की जाती है। इस मॉडल में, जैसा कि शुरू में फांगा एट अल द्वारा वर्णित है और अन्य द्वारा रिपोर्ट किया गया है27,,28,,29,,30,पूंछ त्वचा का 1 सेमी x 0.3 सेमी पूर्ण मोटाई अनुभाग पूंछ के आधार के पास हटा दिया जाता है। घाव क्षेत्र आसानी से कल्पना की जाती है और समय के साथ मापा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पूंछ ऊतक को हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अलग किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित पृष्ठीय पंच बायोप्सी विधि के साथ या संयोजन के रूप में एक विकल्प के रूप में किया जा सकता है। इन दोनों मॉडलों के बीच प्राथमिक भेद घाव बंद करने की दर,2फर की उपस्थिति या अनुपस्थिति, और त्वचा संरचना2,31,,32हैं। पूंछ त्वचा के घाव एक लंबी समय सीमा प्रदान करते हैं जिसमें घाव बंद होने का आकलन करना है, क्योंकि पूर्ण बंद होने में लगभग 21 दिन लगते हैं। यह अप्लीटेड पृष्ठीय पंच बायोप्सी का विरोध करता है, जो मुख्य रूप से पैनिकुलस कार्नोस स की कार्रवाई के कारण संकुचन से बहुत तेजी से (~ 7-10 दिन) को ठीक करता है। स्प्लिटेड पृष्ठीय पंच बायोप्सी अधिक धीरे-धीरे ठीक होती है और संकुचन उपचार के प्रभाव को कम1करती है, लेकिन संकुचन आधारित तंत्र1,2,,27,,30,,31,,33को प्रतिबंधित करने के लिए विदेशी शरीर की उपस्थिति पर भरोसा करती हैं।

वर्णित घाव मॉडल क्षोभ के अभाव में सामान्य घाव उपचार प्रक्रियाओं को समझने के लिए जानकारीपूर्ण हैं। जबकि कृंतक त्वचा का उपचार मानव त्वचा से बहुत महत्वपूर्ण तरीकों से अलग है, जिसमें ढीली संरचना, संकुचन चिकित्सा पर निर्भरता, और अन्य शारीरिक मतभेद शामिल हैं, मूत्र प्रणाली मशीनी और स्क्रीनिंग अध्ययन के लिए कुछ फायदे प्रदान करती है। इनमें सबसे महत्वपूर्ण यह है कि नस्ल उपभेदों और आनुवंशिक म्यूटेंट, आनुवंशिक ट्रैक्टेबिलिटी और कम लागत की उपलब्धता है। मेरिन अध्ययन से प्राप्त मशीनी अंतर्दृष्टि का अनुवाद जटिल पशु मॉडलों में किया जा सकता है जो मानव त्वचा उपचार की अधिक बारीकी से नकल करते हैं, जैसे पोर्सिन सिस्टम2,,31।

स्थिर स्थिति में घाव चिकित्सा प्रतिक्रियाओं की जांच के अलावा, इन मॉडलों को सेलुलर, साइटोकिन और सकल ऊतक स्तर पर घाव चिकित्सा दोषों के आधार को समझने के लिए comorbid शर्तों के साथ जोड़ा जा सकता है। यह इस विशेष सेटिंग में है कि दो मॉडलों को एक विशेष कोमोरबिड स्थिति के प्रभावों का आकलन करने के लिए संगीत कार्यक्रम में इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि पश्चात निमोनिया, तीव्र सेलुलर घाव उपचार प्रतिक्रिया और घाव बंद करने की दर30पर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी पशु अध्ययनों को ब्राउन यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार किया गया था ।  नोट: वीडियो में, सर्जिकल ड्रेप प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए छोड़ दिया गया है ।

1. पीवीए स्पंज का चमड़े का प्रत्यारोपण

  1. पीवीए स्पंज की शीट को 8 एमएम x 8 एमएम x 4 एमएम पीस में काटने के लिए कैंची का इस्तेमाल करें। पीवीए स्पंज के टुकड़ों को एक बीकर में बाँझ 1x पीबीएस में जलमग्न करके फिर से हाइड्रेट करें।
  2. 1x पीबीएस में स्पंज को स्टरलाइज करने के लिए ऑटोक्लेव करें, और पूरी तरह से ठंडा करें। बाँझ 1x पीबीएस में ऑटोक्लेव स्पंज 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. सर्जिकल प्रत्यारोपण करने से पहले, एक लैमिनार प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों में एक बाँझ संस्कृति पकवान में स्पंज की आवश्यक संख्या aliquot । अतिरिक्त स्पंज को भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ 1x पीबीएस में स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि स्पंज रिहाइड्रेशन के बाद 1 सेमी x 1 सेमी x 0.5 सेमी तक प्रफुल्लित हो जाते हैं। निर्जलित पीवीए स्पंज की एक छवि चित्र 1Aमें दिखाई गई है ।
    नोट: सर्जिकल साइट की बंध्यता बनाए रखने के लिए, पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण प्रक्रिया को माउस को संभालने और सर्जिकल साइट तैयार करने के लिए एक व्यक्ति की आवश्यकता होती है, और एक दूसरे व्यक्ति को प्रत्यारोपण करने के लिए।
  4. एनेस्थेटाइज 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6J माउस 80 मिलीग्राम/किलो केटामाइन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा। एनालजेसिया के लिए 40 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन इंट्रापेरिटोनी का प्रबंध करें।  पेडल पलटा के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें। कतरनी के साथ डोरसम के साथ बालों को हटाकर सर्जिकल साइट तैयार करें। बाँझ धुंध का उपयोग करके, दाढ़ी क्षेत्र 2x के लिए पोविडोन-आयोडीन समाधान लागू करें, इसके बाद 70% इथेनॉल।
  5. बाँझ सर्जिकल पर्दे पर माउस रखें। माउस के मुख्य तापमान को बनाए रखने के लिए सर्जिकल पर्दे के नीचे एक गर्म पैड रखें।
  6. सर्जरी करने के लिए बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनें। पृष्ठीय त्वचा को संदंश के साथ अंतर्निहित ऊतक से दूर खींचें, और बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, पृष्ठीय मिडलाइन के साथ लगभग 2 सेमी पूर्वकाल को पूंछ के आधार पर 2 सेमी चीरा बनाएं। बाँझ संदंश के साथ चीरा खुला रखने के दौरान, बाँझ घुमावदार, कुंद इत्तला दे दी सर्जिकल कैंची का उपयोग करने के लिए चित्रा 1Bमें संकेत दिया पदों में से एक में डोरसम के साथ एक चमड़े के नीचे जेब बनाने के लिए ।
  7. त्वचा को अंतर्निहित ऊतक ों से दूर उठाने के लिए संदंश का उपयोग करना जारी रखें। बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, धीरे से संस्कृति पकवान में एक PVA स्पंज निचोड़ करने के लिए अतिरिक्त PBS हटा दें । बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करके एक कोने से पीवीए स्पंज उठाओ और कैंची द्वारा आयोजित कोने के साथ अग्रणी, चरण 1.4 में गठित चमड़े के नीचे जेब में स्पंज जगह है।
  8. इस प्रक्रिया को 5x दोहराएं, चित्रा 1Bमें दिखाए गए कुल छह स्पंज को चमड़े के नीचे जेब में रखें।
  9. बाँझ संदंश के साथ एक साथ चीरा पृष्ठीय त्वचा चुटकी और दो स्टेनलेस स्टील घाव क्लिप के साथ चीरा बंद करो ।
  10. प्रत्येक माउस के लिए बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों के एक नए सेट का प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, चूहों के बीच उपकरणों की नसबंदी करने के लिए एक बीड स्टरलाइजर का उपयोग करें।

2. पीवीए स्पंज से तरल पदार्थ का अलगाव

  1. तीव्र घाव साइटोकिन परिवेश का आकलन करने के लिए, 1-14 दिनों के बाद के रोपण के बीच स्पंज को अलग करें।
  2. एक 16 mL संस्कृति ट्यूब में एक 5 मिलीएल सिरिंज के बैरल घोंसले के द्वारा एक तरल पदार्थ संग्रह ट्यूब तैयार करें।
  3. सीओ2 एस्फिक्सिएशन द्वारा प्रत्यारोपित पीवीए स्पंज के साथ एक माउस को इच्छामृत्यु दें जिसके बाद सर्वाइकल अव्यवस्था होती है।
  4. सर्जिकल स्टेपल निकालें और दांतेदार संदंश के साथ चीरा खोलें। पृष्ठीय मिडलाइन के साथ चीरा का विस्तार करने के लिए कैंची का प्रयोग करें।
  5. संदंश का उपयोग करना, अपनी चमड़े के नीचे जेब से एक स्पंज निकालें और इसे तैयार सिरिंज बैरल में स्थानांतरित करें, स्पंज के दबाव को कम करने के लिए सावधान रहें। स्पंज की सतह का पालन करने वाले किसी भी संयोजी ऊतक को असंबद्ध करें। यदि आवश्यक हो तो आसपास के ऊतकों से स्पंज को विच्छेदन करने के लिए कैंची का उपयोग करें। शेष स्पंज के साथ स्पंज हटाने की प्रक्रिया दोहराएं। बर्फ पर स्पंज युक्त ट्यूब रखें।
  6. घाव तरल पदार्थ को अलग करने के लिए, 10 मिन के लिए 700 x ग्राम पर स्पंज के साथ 5 मिलीसिर युक्त संस्कृति ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  7. सेंट्रलाइज्ड के बाद सिरिंज और स्पंज को डिस्कार्ड कर दें। घाव तरल पदार्थ 16 mL संस्कृति ट्यूब में एकत्र किया जाएगा । एक दिन 7 घाव से एकत्र तरल पदार्थ की एक प्रतिनिधि छवि चित्र 1 Dमें दिखाया गया है । घाव तरल पदार्थ को -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक साफ ट्यूब पर स्थानांतरित करें।

3. पीवीए स्पंज से कोशिकाओं का अलगाव

  1. तीव्र घाव हीलिंग सेलुलर परिवेश का आकलन करने के लिए, 1-14 दिनों के बाद स्पंज प्रत्यारोपण के बीच स्पंज इकट्ठा। प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद घाव से प्राप्त स्पंज चित्रा 1Eमें दिखाए जाते हैं ।
  2. 1x एचबीएस (+कैल्शियम/+मैग्नीशियम/-फिनॉल रेड) युक्त संग्रह माध्यम तैयार करें, जो 1% एफबीएस, 1% हेप्स और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है।
  3. एक 15 mL शंकुट्यूब में एचबीएसएस संग्रह माध्यम के Aliquot 5 mL ।
  4. 2.2-2.4 में वर्णित इच्छामृत्यु चूहों से पीवीए स्पंज निकालें। स्पंज को शंकुट्यूब में रखें जिसमें एचबीएसएस संग्रह माध्यम का 5 mL हो।
  5. स्पंज और एचबीएसएसएस संग्रह माध्यम को डालने के द्वारा 80 मीटर ब्लेंडर बैग में स्थानांतरित करें। पैडल ब्लेंडर के हैच से ब्लेंडर बैग लटकाएं, तैनात ताकि पैडल स्पंज और मीडिया पर प्रहार करें। 60 एस प्रेस शुरू करने के लिए उच्च पर चलाने के लिए पैडल ब्लेंडर की सेटिंग्स समायोजित करें।
  6. ब्लेंडर बैग से मीडिया को वापस एक पिपेट के साथ 15 मिलीएल शंकुई ट्यूब में स्थानांतरित करें, जिससे स्पंज बैग में पीछे हो गए। स्पंज निचोड़ अच्छी तरह से मीडिया जारी करने के लिए । पैडल ब्लेंडर की सेटिंग्स को उच्च पर 30 एस के लिए चलाने के लिए समायोजित करें। ब्लेंडर बैग में मीडिया के 5 मिलील जोड़ें और कुल तीन स्पंज वॉश के लिए पेट की प्रक्रिया 2x दोहराएं।
  7. 5 मिन के लिए 250 x ग्राम पर शंकुई ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सेंट्रलाइज्ड के बाद शंकुन ट्यूब के नीचे कोशिकाओं और लाल रक्त कोशिकाओं का लाल गोली दिखाई देगा।
  8. अधिनायक को त्यागें और लाल रक्त कोशिका लिसिस करें: मिश्रण करने के लिए सेल पैलेट और पिपेट में डीएच2ओ का 900 माइक्रोन जोड़ें। 10x पीबीएस के 100 माइक्रोन के साथ बेअसर। लाइसिस को पूरी तरह से बेअसर करने के लिए ट्यूब में 1x पीबीएस के 4 mL जोड़ें, फिर 5 मिन के लिए 250 x ग्राम पर अपकेंद्री।
    नोट: lysis कदम संक्षिप्त होना चाहिए; 3-5 से अधिक के लिए कोशिकाओं के संपर्क में पानी छोड़ने के परिणामस्वरूप गैर-लाल रक्त कोशिकाओं का लिसिस हो सकता है।
  9. केंद्रीकरण के बाद, लाल रक्त कोशिकाओं से रहित घाव कोशिकाओं युक्त एक सफेद सेल गोली शंकुट्यूब के तल पर मौजूद होगी। अधिनायक को त्यागें और डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए वांछित माध्यम में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।

4. पीवीए स्पंज घावों से अलग सहज ल्यूकोसाइट्स का वैकल्पिक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. 10 पीबीएस + 1% बीएसए में पतला 10 μg/mL एंटी-CD16/CD32 FCRοII/III एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी को अवरुद्ध करने के 2x समाधान के 2x समाधान के 25 μL में 0.5-1 x 106 घाव कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।
    नोट: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए सभी एंटीबॉडी को टिटकिया जाना चाहिए।
  2. बर्फ पर 10 मिन के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध करने के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. परसीपी-ईफ्लूर710-Ly6G, 5 मिलीग्राम/जीएफआईसी-Ly6C, एपीसी-Fire750-CD45.2, एपीसी-R700-Siglec-F, और 10 मिलीग्राम/mL eFluor660-F4-80 के 2.5 मिलीग्राम/mL युक्त एंटीबॉडी का 2x मास्टर मिश्रण बनाएं जो 1x पीबीएस + बीएसए + बीएसए में पतला है। सीधे एंटीबॉडी कॉकटेल के 25 μL एंटीबॉडी अवरुद्ध करने में इनक्यूबेटिंग कोशिकाओं को जोड़ें ।
  4. बर्फ पर 20 किमी के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
  5. कोशिकाओं 2x को 1x पीबीएस से धोएं।
  6. 1x पीबीएस में अमीन-प्रतिक्रियाशील स्थिर व्यवहार्यता रंग-eFluor506 पतला 1:1,000 का एक मास्टर मिश्रण बनाओ। व्यवहार्यता रंगे समाधान के 50 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    नोट: सीरम को स्थिर व्यवहार्यता कदम से बाहर रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह रंगे प्रोटीन के बंधन को रोक देगा। बर्फ पर 20 किमी के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
  7. कोशिकाओं 2x को 1x पीबीएस से धोएं। 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  8. बर्फ पर 15 किमी के लिए 1% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
  9. कोशिकाओं 1x 1x को 1x पीबीएस से धोएं और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए 1x पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें।

5. पूंछ त्वचा उत्तेजन

  1. एनेस्थेटाइज 8-12 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6J माउस 80 मिलीग्राम/किलो केटामाइन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा। एनालजेसिया के लिए 40 मिलीग्राम/किलो जाइलाज़ीन इंट्रापेरिटोनी का प्रबंध करें। पेडल पलटा के नुकसान से संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करें।
  2. पोविडोन-आयोडीन समाधान 2x लागू करने के लिए बाँझ धुंध का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस की पूंछ पर सर्जिकल साइट तैयार करें, इसके बाद 70% इथेनॉल का एक आवेदन।
  3. पूंछ की पृष्ठीय सतह पर 10 मिमी x 3 मिमी अनुभाग को परिभाषित करें, पूंछ के आधार से 10 मिमी(चित्रा 1 C)एक प्रीमेड टेम्पलेट से पता लगाने के लिए स्थायी मार्कर का उपयोग करके।
  4. बाँझ सर्जिकल पर्दे पर एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें।
  5. सर्जिकल प्रक्रियाओं को करने के लिए बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनें। बाँझ स्केलपेल ब्लेड के साथ, घाव क्षेत्र के दाएं, नीचे और बाएं किनारों के साथ एक पूर्ण मोटाई चीरा बनाएं।
  6. बाँझ संदंश का उपयोग करना, उत्पादित त्वचा को पूंछ से दूर छीलें, और घाव क्षेत्र के शीर्ष किनारे को काटने के लिए बाँझ सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
  7. रक्तस्राव को रोकने के लिए बाँझ धुंध के साथ दबाव लागू करें।
  8. घाव बिस्तर पर एक स्प्रे बैरियर फिल्म लागू करें।
  9. नियमित समय अंतराल पर एक निश्चित दूरी से घावों की तस्वीर। घाव क्षेत्र माप निर्धारित करने के लिए प्लैनिमेट्रिक विश्लेषण द्वारा तस्वीरों का विश्लेषण करें। वैकल्पिक रूप से, घाव की लंबाई और चौड़ाई माप प्राप्त करने के लिए कैलिपर्स का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण के बाद प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया
पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण सर्जरी ने एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जैसा कि घायल होने के 1 दिन बाद प्लाज्मा में आईएल-6 के शामिल होने से प्रदर्शित होता है(चित्रा 2ए)। टीएनएफ-α और आईएल-10 सहित अन्य भड़काऊ साइटोकिन्स, साथ ही सीसीएल 2 और सीएक्ससीएल1 सहित चेमोकिन्स की एक सरणी को पहले 7 दिनों के बाद पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण में व्यवस्थित रूप से प्रेरित किया गया था, और इसे कहीं और वर्णित किया गया है26,,30।

पीवीए स्पंज घावों से कोशिकाओं और तरल पदार्थों का अलगाव
पीवीए स्पंज घाव मॉडल का प्राथमिक लाभ तीव्र सेलुलर घाव उपचार प्रतिक्रिया के फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विश्लेषण ों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को ठीक करने की क्षमता है। पीवीए स्पंज घावों से बरामद की जा सकने वाली कोशिकाओं की संख्या समय के साथ बढ़ जाती है, घाव दिवस पर लगभग 2 x 106 कोशिकाओं प्रति छह स्पंज से घाव दिन 76 (चित्रा 2B)पर 8 x 106 कोशिकाओं से । सेल संख्या 7 दिन से आगे बढ़ती रहती है। इस मॉडल को ~ 14 दिनों से आगे जारी रखने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि स्पंज कोलेजन द्वारा पूरी तरह से समझाया जाता है और सिस्टम संक्रमण एक विदेशी शरीर ग्रैनुलोमा1,22,,23,25,,26मॉडलिंग के लिए एक तीव्र घाव उपचार प्रतिक्रिया मॉडलिंग से।25 पीवीए स्पंज घावों में न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज प्राथमिक सेलुलर घुसपैठ थे। न्यूट्रोफिल ने घाव के एक दिन बाद घाव सेलुलर परिवेश पर हावी हो गया, जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण(चित्रा 2 C)द्वारा मूल्यांकन किया गया है। मोनोसाइट्स और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज 3 दिनों के बाद स्पंज प्रत्यारोपण के भीतर जमा हुए, और तीन सेल आबादी समय के साथ संख्या में वृद्धि हुई(चित्रा 2C)। न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट और मैक्रोफेज आबादी की पहचान करने के लिए एक प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति चित्रा 2डीमें दिखाई गई है। एफएससी-एच और एसएससी-एच मापदंडों(चित्रा 2डी, मैं और 2)का उपयोग करसेल doublets को छोड़कर के बाद, गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को एक अमीन-प्रतिक्रियाशील स्थिर व्यवहार्यता डाइ (यहां दिखाया गया) या न्यूक्लिक एसिड डाइ (जैसे, सिटॉक्स या प्रोपिडिनियम आयोडाइड)(Figure 2D, iii)का उपयोग करके बाहर रखा गया था। अवशिष्ट सेलुलर मलबे को पूर्व गेटिंग चरणों द्वारा नहीं हटाया गया था, तब एफएससी-ए और एसएससी-ए पैरामीटर(चित्रा 2D, iv)का उपयोग करके बाहर रखा गया था। हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं में पीवीए स्पंज घाव कोशिकाओं का बहुमत शामिल था और सीडी 45 अभिव्यक्ति(चित्रा 2D, v)द्वारा पहचाना गया था। न्यूट्रोफिल की पहचान Ly6G+सिग्लेक-एफ- (चित्रा 2D, vi)के रूप में की गई थी। सिगेक-एफ+ कोशिकाएं मुख्य रूप से eosinophils(चित्रा 2D, 7i)थीं। Ly6G पर गेटिंग-सिगेक-एफ- कोशिकाओं, मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज की पहचान F4/80+ कोशिकाओं(चित्रा 2D, viii)के रूप में की गई थी। F4/80+ कोशिकाओं को Ly6C अभिव्यक्ति द्वारा आगे आंशिक किया जा सकता है Ly6Cहाय भड़काऊ मोनोसाइट्स(चित्रा 2D, ix)और Ly6Cकम मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज(चित्रा 2D, x)26भेद ।

साइटोकिन्स और अन्य घाव घुलनशील कारकों को मापने की क्षमता पीवीए स्पंज घाव मॉडल के लिए एक और लाभ है। प्रति स्पंज तरल पदार्थ के 100 μL तक निकालना संभव है। निकाले गए तरल पदार्थ विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम परखों के लिए उपयुक्त हैं। एलिसा या माड आधारित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोअस द्वारा जल्दी और देर से घाव वाले तरल पदार्थों में साइटोकिन्स और केमोकिन्स का पता लगाने की सूचना कहीं और26,30बताई गई है । एक ही घाव से कोशिकाओं और तरल पदार्थ दोनों को प्राप्त करना संभव है। ऐसा करने के लिए, सेल अलगाव के लिए पृष्ठीय मिडलाइन के एक तरफ से तीन स्पंज और तरल पदार्थ निकालने के लिए पृष्ठीय मिडलाइन के विपरीत दिशा से 3 स्पंज को अलग करने की सिफारिश की जाती है।

पूंछ त्वचा एक्सिजन मॉडल का उपयोग कर घाव बंद करने का आकलन
एक्सीशनल टेल स्किन मॉडल घने फर की कमी वाली फर्म स्किन में धीमी घाव बंद होने का अध्ययन करने के लिए पृष्ठीय त्वचा पंच बायोप्सी विधि का विकल्प प्रदान करता है। उदाहरण के लिए 1, 7, और 15 दिनों के बाद एक्सिजन में पूंछ त्वचा के घावों की छवियां चित्र 3Aमें दिखाई जाती हैं। समय के साथ घाव बिस्तर के क्षेत्र को मापने के द्वारा घाव बंद करने की मात्रा निर्धारित की जा सकती है । दिन 7 और दिन 15 घाव बिस्तर क्षेत्रों लगभग 70% और 35% थे, क्रमशः, दिन 1 घाव क्षेत्र(चित्रा 3B) के. पूर्ण घाव बंद करने के लिए लगभग 28 दिनों की आवश्यकता होती है। पूंछ त्वचा घाव भी हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा क्रॉस सेक्शन में देखा जा सकता है। चित्रा 3C और चित्रा 3 डी क्रमशः एच एंड ई और मैसन के त्रिक्रोम-दाग पूंछ क्रॉस वर्गों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाते हैं। उत्पादित त्वचा के पार्श्व मार्जिन पूंछ की पृष्ठीय सतह पर तीर सिर द्वारा इंगित किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मूत्र घाव हीलिंग मॉडल की योजनाबद्ध। (ए)साइड (बाएं) और शीर्ष (दाएं) निर्जलित पीवीए स्पंज का दृश्य 8 मिमी x 8 मिमी x 0.4 मिमी मापने वाला।(B)एक माउस का चित्रण जो पृष्ठीय मिडलाइन चीरा (केंद्रीय लाल रेखा) और छह 1 सेमी x 1 सेमी x 0.5 सेमी पीवीए स्पंज के स्थान को कम करने वाली जेब में प्रदर्शित करता है। (ग)योजनाबद्ध आकार और पूंछ की पृष्ठीय सतह पर एक एक्सीशनल त्वचा घाव (10 मिमी x 3 मिमी लाल आयत) के आकार और प्लेसमेंट का प्रदर्शन। (D)प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद चमड़े के नीचे अंतरिक्ष से निकाले गए तीन स्पंज से अलग तरल पदार्थ। (ई)प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद घाव से प्राप्त स्पंज की उपस्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण के लिए प्रणालीगत और सेलुलर प्रतिक्रिया। (A)प्लाज्मा में आईएल-6 के स्तर का एक समय पाठ्यक्रम दर्शाता है कि पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण ने एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित किया । आईएल-6 की एकाग्रता को मल्टीप्लेक्स मनका आधारित इम्यूनोसे का उपयोग करके मापा गया था। (ख)पीवीए स्पंज घाव से अलग कोशिकाओं की संख्या समय के साथ बढ़ गई । (ग)एक समय पाठ्यक्रम समय के साथ पीवीए स्पंज घावों में न्यूट्रोफिल, मोनोसाइट्स और मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के संचय को दर्शाता है। (D)पीवीए स्पंज घावों से अलग कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति यह दर्शाती है कि प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा ल्यूकोसाइट के सबसेट की पहचान कैसे की जाए । गेट्स को इस प्रकार परिभाषित किया गयाहै: (i और ii)डबल अपवर्जन,(iii)एक अमीन-प्रतिक्रियाशील स्थिर व्यवहार्यता रंग का उपयोग करके मृत सेल बहिष्कार,(iv)एफएससी-ए और एसएससी-ए द्वारा मलबे का बहिष्कार,(v)CD45+ हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं,(vi)Ly6G+ न्यूट्रोफिल्स,(सातवीं)सिग्लेक-एफ+ eosinophils,(आठवीं)Ly6G-Siglec-F-F4/80+ मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज,(ix)F4/80+ –– Ly6Cहाय मोनोसाइट्स, और(x)F4/80+Ly6Cकम मैक्रोफेज । गेट्स को फ्लोरेसेंस-माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण के अनुसार रखा गया था । ए-सी में दिखाए गए डेटा का मतलब ± एसईएम, एन = 6-10 चूहों प्रति समूह(ए),एन = 8-9 चूहों में(बी),और एन = 6-8 चूहों में(सी)हैं। सभी डेटा 2-3 स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक्सीशनल पूंछ त्वचा घाव उपचार का आकलन। (A)एक्सीशनल पूंछ त्वचा घावों की प्रतिनिधि तस्वीरें 1, 7, और 15 दिन के बाद घायल लिया । (ख)एक्सीशनल टेल त्वचा के घावों को बंद करने की दर। घाव हर दूसरे दिन फोटो खिंचवाने थे । इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग घाव बिस्तर मार्जिन का पता लगाने और संकेत ित समय बिंदुओं पर घाव क्षेत्र की गणना करने के लिए किया गया था। घाव क्षेत्र 1 दिन मापा घाव क्षेत्र के एक अंश के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। पूंछ क्रॉस वर्गों की प्रतिनिधि छवियां जो पैराफिन-एम्बेडेड, अनुभागित और(सी)एच एंड ई या(डी)मैसन के ट्रिक्रोम के साथ दाग ित थीं। घाव पूंछ पार अनुभाग की पृष्ठीय सतह पर स्थित था; पार्श्व घाव मार्जिन तीर सिर द्वारा इंगित कर रहे हैं। (बी)में दिखाए गए डेटा का मतलब ± एसईएम, एन = 8 चूहे प्रति समूह हैं। डेटा दो स्वतंत्र प्रयोगों से संयुक्त होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह लेख दो ट्रैक्टेबल क्यूरीन घाव मॉडल का वर्णन करता है जो तीव्र घाव उपचार प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं। पहली विधि में पृष्ठीय चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में पीवीए स्पंज की शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण शामिल है। यह दृष्टिकोण बड़ी संख्या में कोशिकाओं और अलग स्पंज से प्राप्त घाव तरल पदार्थों की मात्रा के कारण सेलुलर घाव उपचार प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए बायोप्सी-आधारित घाव मॉडल पर एक अलग लाभ प्रदान करता है। इस प्रक्रिया के सफल निष्पादन के लिए, चीरा के आसपास त्वचा को अच्छी तरह से साफ करके एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र को बनाए रखना जरूरी है, क्योंकि घाव में बैक्टीरिया का स्थानांतरण उपचार के पाठ्यक्रम को काफी बदल देगा। यहां वर्णित सेल आइसोलेशन विधि का उपयोग करके, स्पंज निष्कर्षण के समय के आधार पर पीवीए स्पंज से कम से कम 1-10 x 106 कोशिकाओं को अलग करना संभव है। पीवीए स्पंज घावों से अलग कोशिकाओं के बहुमत व्यवहार्य हैं(चित्रा 2D)। हालांकि, क्योंकि मृत कोशिकाओं के लिए यांत्रिक व्यवधान के बाद अलग घाव कोशिकाओं के ~ 20% तक का गठन करना संभव है, फ्लो साइटोमेट्री-आधारित विश्लेषणों के साथ आगे बढ़ने पर व्यवहार्यता दाग का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। पीवीए स्पंज घावों से अलग कोशिकाएं मुख्य रूप से सीडी45 सकारात्मकता(चित्रा 2डी)द्वारा निर्धारित हेमेटोपोइटिक मूल की हैं। मोनोसाइट्स और मैक्रोफेज के बाद न्यूट्रोफिल का तेजी से संचय घाव मरम्मत3,4,34,,35,36,37,38के तीव्र चरणों के अनुरूप है . अलग-थलग कोशिकाएं इम्यूनोफेनोटीपिंग, सेल छंटाई, पुलिया, आरएनए निष्कर्षण और विभिन्न प्रकार के कार्यात्मक परखस सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं।

पीवीए स्पंज घाव मॉडल तरल पदार्थों के अलगाव के लिए भी अनुमति देता है, जो तीव्र घाव वातावरण में साइटोकिन और विकास कारक प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए आदर्श है। पीवीए स्पंज तरल पदार्थ एलिसा, बीड आधारित मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे, और प्रोटीन क्वांटिटेशन द्वारा परीक्षण के लिए उपयुक्त हैं। पिछले अध्ययनों ने साइटोकिन और विकास कारक माप के माध्यम से प्रदर्शन किया है कि प्रारंभिक घाव वातावरण प्रकृति में भड़काऊ है, जिसमें आईएल-6, टीएनएफ-α और आईएल-10 के तेजी से शामिल होने के साथ 1-3 दिन से। घाव का वातावरण तब एक रिपारेटिव स्थिति में संक्रमण करता है, जिसमें वेगएफ और टीजीएफ-22,22,23,,25,,26,,30सहित प्रो-एंजियोजेनिक और प्रो-फाइब्रोटिक विकास कारक शामिल हैं।

जबकि पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण मॉडल तीव्र घाव सेलुलर और साइटोकिन प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लाभप्रद है, इसकी सीमाओं में से एक चिकित्सा की दर या डिग्री को मापने में असमर्थता है। घाव उपचार के इस पहलू की माप की आवश्यकता हो सकती है जब घाव उपचार प्रतिक्रिया30के विभिन्न पहलुओं पर एक comorbid स्थिति के प्रभाव का आकलन । इस मीट्रिक के लिए बायोप्सी आधारित तरीकों को तरजीह दी जाती है। यहां टेल स्किन एक्सिजन मॉडल पेश किया गया है। इस मॉडल में, पूंछ त्वचा का एक पूर्ण मोटाई अनुभाग पूंछ की पृष्ठीय सतह से उत्पादित होता है। फिर, घाव बिस्तर को कम करने से बचने के लिए बाँझ सर्जिकल क्षेत्र को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। बाद में घाव संक्रमण से बचने के लिए स्प्रे बैरियर फिल्म या अन्य घाव को कवर करने के उपयोग की भी सिफारिश की जाती है। पुराने पुरुष चूहों या आक्रामक उपभेदों घाव के व्यवधान से बचने के लिए एकल आवास की आवश्यकता होती है। घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक साइट के रूप में पूंछ का एक विशेष लाभ यह है कि यह बंद करने के लिए फिर से एपिथेलियालाइजेशन पर अधिक निर्भर करता है, जैसा किअन्य 27,32,,33द्वारा वर्णित है।, घाव बिस्तर क्षेत्र को मापने और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करने के अलावा, दूसरों ने उपचार प्रक्रियाओंको 33को मॉड्यूल करने में सामयिक हस्तक्षेपों की प्रभावकारिता का आकलन करने में इसके उपयोग की सूचना दी है।

इन तरीकों में वर्णित प्रत्येक घाव मॉडल स्थिर स्थिति में और कोऑर्बिडिटीज की उपस्थिति में घाव मरम्मत प्रक्रियाओं को समझने के लिए अलग-अलग फायदे प्रदान करते हैं। नस्ल चूहों के आनुवंशिक रूप से परिवर्तित उपभेदों की व्यापक उपलब्धता के कारण, इस प्रक्रिया के बारे में मशीनी सवालों के जवाब देने के लिए घाव भरने की प्रतिक्रियाओं में हेरफेर करना भी संभव है। इसके अलावा, इन प्रणालियों को मधुमेह, उम्र बढ़ने, माध्यमिक संक्रमण, और अन्य30,,36,,39,,40सहित खराब घाव भरने से जुड़ी स्थितियों के मूत्र मॉडल में लागू किया जा सकता है। मूत्र अध्ययन से प्राप्त यंत्रवादी अंतर्दृष्टि तब उच्च क्रम पशु मॉडल में घाव भरने का अध्ययन करने के लिए आधार प्रदान कर सकती है। साथ में, पीवीए स्पंज प्रत्यारोपण और एक्सीसिओनल पूंछ त्वचा घाव मॉडल स्थिर स्थिति और रोग की स्थिति के तहत घाव चिकित्सा प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए ट्रैककरने योग्य और बहुमुखी प्रणालियां प्रदान करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ब्राउन विश्वविद्यालय फ्लो साइटोमेट्री और छंटाई सुविधा के केविन कार्लसन को प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों के साथ परामर्श और सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। चित्र 1 B और C में छवियां बायोरेंडर के साथ बनाई गई थीं। कायला ली और ग्रेगरी सेरपा को उनकी फोटो सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है । इस काम को निम्नलिखित से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं एजेंसी (DARPA) YFAA15 D15AP00100, उभरते नए विज्ञान पुरस्कार (ब्राउन विश्वविद्यालय), राष्ट्रीय हृदय फेफड़े और रक्त संस्थान (NHLBI) 1R01HL126887-01A1 के डीन क्षेत्रों, राष्ट्रीय पर्यावरण विज्ञान संस्थान (NIES) T32-ES7272 (पर्यावरण विकृति में प्रशिक्षण), और ब्राउन विश्वविद्यालय अनुसंधान बीज पुरस्कार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP3991
15 mL centrifuge tubes, Olympus Genesee 28-103
1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) ThermoFisher Scientific 14025076
5ml Syringe BD 309646
Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 BioLegend 109852 Clone 104
Anti-mouse F4/80-eFluor660 ThermoFisher Scientific 50-4801-82 Clone BM8
Anti-mouse Ly6C-FITC BD Biosciences 553104 Clone AL-21
Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 ThermoFisher Scientific 46-9668-82 Clone 1A8-Ly6g
Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 BD Biosciences 565183 Clone E50-2440
Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier Braintree Scientific NC9021392
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm Braintree Scientific NC9334081
Blender Bag, 80mL Fisher Scientific 14258201
Culture Tube, 16mL, 17x100 Genesee Scientific 21-130
Fetal Bovine Serum - Standard ThermoFisher Scientific 10437028
Fixable Viability Dye eFluor506 ThermoFisher Scientific 65-0866-14
Hepes Solution, 1M Genesee Scientific 25-534
ImageJ Software NIH
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15070-063
Polyvinyl alcohol sponge - large pore size Ivalon/PVA Unlimited www.sponge-pva.com
Povidone-iodine solution, 10% Fisher Scientific 3955-16
Spray barrier film, Cavilon 3M 3346E
Stomacher 80 Biomaster, 110V Seward 0080/000/AJ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
  2. Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
  4. Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
  5. Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
  6. Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
  7. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
  8. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
  9. Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
  10. Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
  11. Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
  12. Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
  13. Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
  14. Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
  15. Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
  16. Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
  17. Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
  18. MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
  19. Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
  20. Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
  21. Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
  22. Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
  23. Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
  24. Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
  25. Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
  26. Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
  27. Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
  28. Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
  29. Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
  30. Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
  31. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  32. Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
  33. Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
  34. Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
  35. Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  36. Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
  37. Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
  38. DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
  39. Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
  40. Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू 157 घाव घाव भरने का मॉडल फाइब्रोसिस सर्जरी ट्रॉमा माउस सूजन जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया
डॉरसल सबक्यूटेनेस पॉलीविनाइल अल्कोहल स्पंज इम्प्लांटेशन और एक्सीशनल टेल स्किन घाव मॉडल का उपयोग करके तीव्र घाव उपचार का आकलन।
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, … More

Crane, M. J., Henry Jr, W. L., Tran, H. L., Albina, J. E., Jamieson, A. M. Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.. J. Vis. Exp. (157), e60653, doi:10.3791/60653 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter