Summary
Burada, biri hücresel ve sitokin yara iyileştirici yanıtlarını değerlendirmek, diğeri ise yara kapatma oranını ölçmek için tasarlanmış iki murine yara iyileşmesi modeli tanımlanmıştır. Bu yöntemler, kötü yara iyileşmesiçeşitli yönlerini mekanizmaları belirlemek için diyabet gibi karmaşık hastalık modelleri ile kullanılabilir.
Abstract
Yara iyileşmesi inflamasyon, granülasyon doku oluşumu, fibrozis ve çözünürlük düzenli ilerlemesini gerektiren karmaşık bir süreçtir. Murine modelleri bu süreçlere değerli mekanistik bilgiler sağlar; ancak, tek bir model tamamen yara iyileşme yanıtı tüm yönleriyle adresleri. Bunun yerine, yara iyileşmesi farklı yönlerini ele almak için birden fazla model kullanmak idealdir. Burada yara iyileşmesi yanıtının farklı yönlerini ele alan iki farklı yöntem tanımlanmıştır. İlk modelde polivinil alkol süngerleri fare dorsum boyunca deri altı implante edilir. Sünger alımının ardından hücreler mekanik bozulma ile izole edilebilir ve sıvılar santrifüj ile çıkarılabilir, böylece akut yara ortamında hücresel ve sitokin yanıtlarının ayrıntılı bir karakterizasyonuna olanak sağlar. Bu modelin bir sınırlama yara kapatma oranını değerlendirmek için yetersizlik tir. Bunun için kuyruk derisi eksizyonu modeli kullanılmaktadır. Bu modelde, kuyruk derisinin 10 mm x 3 mm dikdörtgen parçası, kuyruk tabanına yakın, sırt yüzeyi boyunca çıkar. Bu model kolayca iyileşme oranlarını belirlemek için planimetrik analiz için fotoğraflanabilir ve histolojik analiz için excised olabilir. Tanımlanan her iki yöntem de genetik olarak değiştirilmiş fare suşlarında veya yara iyileşme mekanizmalarını açıklamak için diyabet, yaşlanma veya sekonder enfeksiyon gibi komorbid durum modelleri ile birlikte kullanılabilir.
Introduction
Yara iyileşme süreçlerini incelemek için birçok murine model sistemleri vardır, her biri belirli avantajları ve sınırlamaları sahip1,2. Aşağıdaki yöntemler, her biri yara iyileşmesi yanıtının belirli bir yönünü ele alan ve yaralanmaya yanıttaki tedirginliklerin neden ve etkisini belirlemek için kullanılabilen iki murine yara modeli sunar. Yara iyileşme süreci farklı evrelerde gerçekleşir. İlk aşama inflamatuardır, trombositlerin hızlı akını ile karakterize, nötrofiller, ve monositler / makrofajlar, yanı sıra proinflamatuar sitokinler ve kemokinler üretimi. İltihapın çözülmesinden sonra, profibrotik ve proanjiogenik sitokinlerin indüksiyonu ve büyüme faktörleri ile ortam daha iyi bir duruma geçmektedir. Granülasyon dokusu birikir ve neokaplar miyofibroblastlar, fibroblastlar, epitel hücreleri ve endotel hücrelerinin göçü ile oluşur. Son aşamalarda, geçici hücre dışı matriks remodeled ve yara oluşumu ve yara kapatma gelirleri2,3,4,5,6,7,8.
Hiçbir tek murine modeli yara iyileşmesi tüm aşamalarında çalışmak için bir sistem sağlar2. Burada iki cerrahi yara modeli tanımlanmıştır: biri akut hücresel ve sitokin yara iyileşme yanıtlarını açıklığa kavuştururken, diğeri yara kapanmasının değerlendirilmesinin yanı sıra histolojik analizlere de olanak sağlar. Bu iki yöntem, yara iyileşmesi yanıtının farklı yönleri üzerinde bir tedirginlik veya komorbiditenin etkilerini değerlendirmek için tamamlayıcı bir şekilde kullanılabilir. Polivinil alkol (PVA) süngerlerin dorsal deri altıimplantasyonu,hücresel ve granülasyon doku yanıtlarının çeşitli yönlerini açıklamak için yıllardır kemirgen modellerinde kullanılan bir sistemdir 9 ,10,11,12,,13,14,15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24. Bu yaklaşım sitokin açısından zengin yara sıvıları ve hücresel infiltrasyon ların alınmasını sağlar. Bu modelde, 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA sünger parçaları posterior dorsal orta hatta yapılan 2 cm'lik bir kesi ile deri altı ceplere yerleştirilir. Kesi cerrahi klipslerle kapatılır ve süngerler hücre ve sıvı izolasyonu için daha sonraki zaman noktalarında alınabilir. İzole süngerlerin hücresel ve sitokin ortamı, yaklaşık 14 gün postimplantasyona kadar akut yara iyileşmesinin normal evrelerini yansıtır. Daha sonraki zaman noktalarında model granülasyon doku oluşumu ve yabancı cisim yanıtı1incelenmesi için daha avantajlıdır. Bu sistem ile fenotipik ve fonksiyonel tahliller ve RNA izolasyonu için ayrı bir avantaj sunan >106 hücreleri, diğer biyopsi tabanlı yöntemlerden hücreleri izole etme üzerinde1,22,2323,25,26izole etmek mümkündür.
Kuyruk derisi eksizyon modeli kullanılarak yara kapatma oranı belirlenir. Bu modelde, başlangıçta Falanga ve ark. tarafından açıklanan ve diğerleri tarafından bildirilen27,28,29,30, kuyruk derisinin 1 cm x 0.3 cm tam kalınlıkta bölümü kuyruk tabanına yakın kaldırılır. Yara alanı kolayca görselleştirilir ve zaman içinde ölçülebilir. Alternatif olarak, kuyruk dokusu histolojik analiz için izole edilebilir. Bu yaklaşım, köklü sırt yumruğu biyopsisi yöntemine alternatif olarak veya birlikte kullanılabilir. Bu iki model arasındaki birincil ayrımlar yara kapatma oranı, kürk varlığı veya yokluğu ve cilt yapısı2,31,32. Kuyruk deri yaraları, yara kapanmasını değerlendirmek için daha uzun bir zaman dilimi sunar, çünkü tam kapanmanın gerçekleşmesi yaklaşık 21 gün sürer. Bu çok daha hızlı iyileşmek için içler acıklı sırt yumruğu biyopsiler karşı, (~ 7-10 gün), öncelikle panniculus karnosus eylem nedeniyle kasılma ile. Splinted sırt yumruğu biyopsileri daha yavaş iyileşmek ve kontraktil iyileşme etkilerini azaltmak, ama kontraktil tabanlı mekanizmaları 1 kısıtlamak için yabancı bir cisim varlığı güveniyor1,2,27,,30,31,33.
Açıklanan yara modelleri, tedirginlik yokluğunda normal yara iyileşme süreçlerini anlamak için bilgilendiricidir. Kemirgen derisinin iyileşmesi gevşek yapısı, kontraktil iyileşmeye güven ve diğer anatomik farklılıklar da dahil olmak üzere insan derisinden çok önemli şekillerde farklılık gösterirken, minür sistemi mekanistik ve tarama çalışmaları için bazı avantajlar sunar. Bunların başında inbred suşları ve genetik mutantlar, genetik sistem ve düşük maliyet durumudur. Murine çalışmalarından elde edilen mekanistik içgörü, domuz sistemi2,31gibi insan deri iyileşmesini daha yakından taklit eden karmaşık hayvan modellerine çevrilebilir.
Sabit durumda yara iyileşmesi yanıtları incelenmesine ek olarak, bu modeller hücresel, sitokin ve brüt doku düzeyinde yara iyileşmesi kusurlarının temelini anlamak için komorbid koşulları ile kombine edilebilir. Bu iki model, ameliyat sonrası pnömoni gibi belirli bir komorbid durumun etkilerini değerlendirmek için birlikte kullanılabilir bu özel ayarı, hem akut hücresel yara iyileşme yanıtı ve yara kapatma oranı30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm hayvan çalışmaları Brown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca yürütülmüştür. NOT: Videoda, cerrahi örtü gösteri amacıyla atlanmıştır.
1. PVA süngerlerinin deri altı implantasyonu
- 8 mm x 8 mm x 4 mm adet PVA sünger levhakesmek için makas kullanın. PVA sünger parçalarını steril 1x PBS'ye batırarak bir kabın içinde yeniden sulayın.
- Otoklav 1x PBS içinde sünger sterilize etmek ve tamamen serin. Otoklavlı süngerleri steril 1x PBS'de 4 °C'de saklayın.
- Cerrahi implantasyon gerçekleştirmeden önce, laminar akış kaputunda steril koşullar altında steril bir kültür çanağı içine gerekli sayıda sünger aliquot. Ekstra süngerleri steril 1x PBS'de 4 °C'de saklayın. Rehidrasyondan sonra süngerlerin 1 cm x 1 cm x 0,5 cm'ye kadar şişmesini sağlayın. Susuz PVA süngerlerin bir görüntüsü Şekil 1A'dagösterilmiştir.
NOT: PVA sünger implantasyon prosedürü, cerrahi alanın sterilitesini korumak için fareyi tek bir kişinin, ikinci bir kişinin ise implantasyon unu gerçekleştirmesini gerektirir. - 80 mg/kg ketamin intraperitoneal enjeksiyon ile 8-12 haftalık erkek C57BL/6J fare anestezi. Analjezi için 40 mg/kg ksilazin intraperitoneal olarak uygulayın. Bir pedal refleks kaybı ile anestezi derinliğini onaylayın. Makas ile dorsum boyunca saç kaldırarak cerrahi site hazırlayın. Steril gazlı bez kullanarak, tıraş bölgesi2x povidon-iyot çözeltisi uygulayın, ardından% 70 etanol.
- Fareyi steril cerrahi perdelerüzerine yerleştirin. Farenin çekirdek sıcaklığını korumak için cerrahi perdelerin altına ısıtılmış bir ped yerleştirin.
- Ameliyatı gerçekleştirmek için steril cerrahi eldiven giyin. Dizal derisini forceps ile altta yatan dokudan çekin ve steril cerrahi makas kullanarak, kuyruk tabanına yaklaşık 2 cm ön dorsal orta hat boyunca 2 cm'lik bir kesi yapın. Kesisteril forsepslerle açık tutarken, Şekil 1B'debelirtilen pozisyonlardan birinde dorsum boyunca deri altı bir cep oluşturmak için steril kavisli, künt uçlu cerrahi makas kullanın.
- Altta yatan doku dan deri kaldırmak için forseps kullanmaya devam edin. Steril cerrahi makas kullanarak, aşırı PBS kaldırmak için kültür çanak hafifçe bir PVA sünger sıkmak. PVA süngerini steril cerrahi makas kullanarak bir köşeden toplayıp, makasın elindeki köşeyi koyarak süngeri 1.4 adımda oluşan deri altı cebine yerleştirin.
- Şekil 1B'degösterildiği gibi deri altı ceplere toplam altı sünger yerleştirerek bu işlemi 5kat tekrarlayın.
- İncinmiş sırt derisini steril ençelerle birlikte çimdiklayın ve kesiyi iki paslanmaz çelik yara klipsi ile kapatın.
- Her fare için steril cerrahi aletler yeni bir dizi kullanın. Alternatif olarak, fareler arasında aletleri sterilize etmek için bir boncuk sterilizatör kullanın.
2. PVA süngerlerden sıvıların izolasyonu
- Akut yara sitokin ortamını değerlendirmek için, süngerleri 1-14 gün postimplantasyon arasında izole edin.
- 5 mL'lik şırınganın namlularını 16 mL'lik bir kültür tüpüne sokarak sıvı toplama tüpü hazırlayın.
- Bir fareyi implante edilmiş PVA süngerleri ile CO2 boğulma sıyrık ve ardından servikal çıkış ile ötenazi.
- Cerrahi zımba çıkarın ve dişli forceps ile kesi açın. Dorsal orta hat boyunca kesi uzatmak için makas kullanın.
- Forceps kullanarak, deri altı cebinden bir sünger ayıklayın ve hazırlanan şırınga varil aktarın, sünger basıncı en aza indirmek için dikkatli olmak. Süngerin yüzeyine yapışılmış kalan bağ dokusunu ayırın. Gerekirse süngeri çevredeki dokudan incelemek için makas kullanın. Kalan süngerlerle sünger kaldırma işlemini tekrarlayın. Süngerleri içeren tüpü buzüzerine yerleştirin.
- Yara sıvısını izole etmek için, 5 mL şırınga içeren kültür tüpünü 10 dk boyunca 700 x g'de süngerlerle santrifüj edin.
- Santrifüjden sonra şırıngayı ve süngerleri atın. Yara sıvısı 16 mL kültür tüpünde toplanmış olacak. Şekil 1D'debir günde 7 yaradan toplanan sıvının temsili bir görüntüsü gösterilmiştir. Yara sıvısını -80 °C'de uzun süreli depolamaiçin temiz bir tüpe aktarın.
3. PVA süngerlerden hücrelerin izolasyonu
- Akut yara iyileştirici hücresel ortamı değerlendirmek için sünger sonrası 1-14 gün arasında sünger toplayın. İmplantasyondan 7 gün sonra yaradan elde edilen süngerler Şekil 1E'degösterilmiştir.
- %1 FBS, %1 HEPES ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenen 1x HBSS (+kalsiyum/+magnezyum/-fenol kırmızısı) içeren toplama ortamı hazırlayın.
- Aliquot 5 mL HBSS toplama ortamı 15 mL konik tüp içine.
- 2.2-2.4'te açıklandığı gibi PVA süngerlerini ötenazili farelerden ayıklayın. Süngerleri 5 mL HBSS toplama ortamı içeren konik tüpe yerleştirin.
- Süngerleri ve HBSS toplama ortamını dökerek 80 mL'lik bir blender torbasına aktarın. Raketblender ambarından blender çanta asmak, kürekler sünger ve medya grev şekilde konumlandırılmış. Raket blender ayarlarını 60 s. Basın başlatmak için yüksek çalıştırmak için ayarlayın.
- Ortamı blender torbasından pipetli 15 mL konik boruya aktarın ve süngerleri çantada bırakabilirsiniz. Iyice medya serbest bırakmak için sünger sıkmak. Raket blender ayarlarını yüksek 30 s çalıştırmak için ayarlayın. Blender torbasına 5 mL ortam ekleyin ve toplam üç sünger yıkar için mide işlemini 2 x tekrarlayın.
- Konik tüpü 5 dk için 250 x g'da santrifüj edin. Santrifüjden sonra konik tüpün alt kısmında kırmızı bir hücre ve kırmızı kan hücresi görünür olacaktır.
- Supernatant atın ve kırmızı kan hücresi lysis gerçekleştirmek: hücre pelet ve pipet karıştırmak için 900 μL dH2O ekleyin. 100 μL 10x PBS ile nötralize edin. Lysis'i tamamen nötralize etmek için tüpe 4 mL 1x PBS ekleyin, ardından 5 dk boyunca 250 x g'da santrifüj edin.
NOT: Lysis adımı kısa olmalıdır; 3-5 s'den fazla hücrelerle temas halinde su bırakarak kırmızı olmayan kan hücrelerinin lysis neden olabilir. - Santrifüjden sonra konik tüpün alt kısmında kırmızı kan hücrelerinden yoksun yara hücreleri içeren beyaz bir hücre peleti bulunacaktır. Supernatant atın ve aşağı analizler için istenilen ortamda hücre pelet resuspend.
4. PVA sünger yaralarından izole edilen doğuştan gelen lökositlerin isteğe bağlı akış sitometri analizi
- 10 μg/mL anti-CD16/CD32 FcRγII/III antikor içeren 2x blokaj lı antikor çözeltisinin 25 μL'lik 25 l'lik 25l'lik halinde 0.5-1 x 106 yara hücresini yeniden askıya alın ve 1x PBS + %1 BSA ile seyreltildi.
NOT: Akış sitometrisi analizi için en uygun konsantrasyonları belirlemek için tüm antikorlar titre edilmelidir. - Hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde bloke antikor ile kuluçkaya yatırın.
- PerCP-eFluor710-Ly6G 2.5 mg/mL, FITC-Ly6C 5 mg/mL, APC-Fire750-CD45.2, APC-R700-Siglec-F ve 10 mg/mL eFluor660-F4-80 içeren antikorların 2x ana karışımını yapın . Doğrudan bloke antikor inkübün hücrelere antikor kokteyl 25 μL ekleyin.
- Hücrelerden 20 dakika boyunca ışıktan korunan buz üzerinde kuluçkaya yat.
- Hücreleri 1x PBS ile 2x yıkayın.
- Amin-reaktif fikse edilebilirlik boya-eFluor506 1x PBS 1:1.000 seyreltilmiş bir ana karışımı olun. Canlıboya çözeltisinin 50 μL'lik hücre peletini yeniden askıya alın.
NOT: Serum, boyanın endojen proteinlere bağlanmasını önleyeceği için düzeltilebilir canlılık adımının dışında tutulmalıdır. Hücrelerden 20 dakika boyunca ışıktan korunan buz üzerinde kuluçkaya yat. - Hücreleri 1x PBS ile 2x yıkayın. Hücre peletini %1 paraformaldehit 50 μL'de yeniden askıya alın.
- Hücrelere ışıktan korunan 15 dakika boyunca %1 paraformaldehit ile buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Hücreleri 1x 1x PBS ile yıkayın ve akış sitometrik analizi için 1x PBS pelet resuspend.
5. Kuyruk deri eksizyonu
- 8-12 haftalık erkek C57BL/6J fareyi 80 mg/kg ketamin intraperitoneal enjeksiyon la anestelet. Analjezi için 40 mg/kg ksilazin intraperitoneal olarak uygulayın. Bir pedal refleks kaybı ile anestezi derinliğini onaylayın.
- Povidon-iyot solüsyonu 2x uygulamak için steril gazlı bez kullanarak anestezili farenin kuyruğundaki cerrahi bölgeyi hazırlayın ve ardından %70 etanol uygulayın.
- Kuyruğun sırt yüzeyinde 10 mm x 3 mm'lik bir kesit tanımlayın, kuyruğun tabanından 10 mm(Şekil 1C)önceden yapılmış bir şablondan iz sürmek için kalıcı bir işaretleyici kullanarak.
- Steril cerrahi perdeler üzerine anestezili fare yerleştirin.
- Cerrahi prosedürleri gerçekleştirmek için steril cerrahi eldiven giyin. Steril bir neşter bıçak ile, yara alanının sağ, alt ve sol kenarları boyunca tam kalınlıkta kesi yapın.
- Steril çöförler kullanarak, kuyruk uzak excised deri soyma ve yara alanının üst kenarı kesmek için steril cerrahi makas kullanın.
- Kanamayı durdurmak için steril gazlı bez ile basınç uygulayın.
- Yara yatağına bir sprey bariyer filmi uygulayın.
- Yaraları düzenli zaman aralıklarında sabit bir mesafeden fotoğrafla. Yara alanı ölçümlerini belirlemek için fotoğrafları planimetrik analiz ile analiz edin. Alternatif olarak, yara uzunluğu ve genişlik ölçümleri elde etmek için kaliperkullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PVA sünger implantasyonu sonrası sistemik inflamatuar yanıt
PVA sünger implantasyon cerrahisi, yaralanmadan 1 gün sonra plazmada IL-6 indüksiyonu ile gösterildiği gibi sistemik inflamatuar yanıt üretti(Şekil 2A). TNF-α ve IL-1β gibi diğer proinflamatuar sitokinlerin yanı sıra CCL2 ve CXCL1 dahil olmak üzere bir dizi kemokin ler pva sonrası ilk 7 gün içinde sistemsel olarak indüklenmiştir ve başka bir yerde26,30tanımlanmıştır.
PVA sünger yaralarından hücre ve sıvıların izolasyonu
PVA sünger yara modelinin birincil avantajı akut hücresel yara iyileşmesi yanıtının henotibik ve fonksiyonel analizleri için yeterli hücreyi kurtarabilmektir. PVA sünger yaralarından kurtarılabilen hücre sayısı zamanla artar, yara gününde altı sünger başına yaklaşık 2 x 106 hücre 1 x 106 ila 8 x 106 hücre yara günü 7(Şekil 2B). Hücre sayısı 7. Süngerler tamamen kollajen tarafından kapsüllenmiş ve yabancı bir cisim granülomu modelleme akut yara iyileşme yanıtı modelleme gelen sistem geçişleri 11,22,,23,25,26çünkü ~ 14 gün ötesinde bu modeldevam etmek için tavsiye edilmez .26 Nötrofiller, monositler ve makrofajlar PVA sünger yaralarında birincil hücresel infiltrasyondu. Nötrofiller, akış sitometrik analizi ile değerlendirildiği gibi, yaradan bir gün sonra yara hücresel ortamına baskın olarak baskın olarak hakimdirler (Şekil 2C). Sünger sonrası implantasyon sonrası 3 gün içinde biriken monositler ve monosit kaynaklı makrofajlar zamanla sayıca artmıştır(Şekil 2C). Nötrofil, monosit ve makrofaj popülasyonlarını tanımlamak için temsili bir akış sitometrisi gating stratejisi Şekil 2D'degösterilmiştir. FSC-H ve SSC-H parametreleri(Şekil 2D, i ve ii)kullanılarak hücre doublet'leri dışlandıktan sonra, amin-reaktif sabitlenebilir canlılık boyası (burada gösterilmiştir) veya nükleik asit boyası (örn. sytox veya propidium iyodid)(Şekil 2D, iii) kullanılarak canlı olmayan hücreler dışlandı. Daha önce gating adımları ile kaldırılmayan artık hücresel enkaz daha sonra FSC-A ve SSC-A parametreleri kullanılarak dışlandı(Şekil 2D, iv). PVA sünger yara hücrelerinin çoğunluğunu oluşturan hematopoetik hücreler CD45 ekspresyonu ile tanımlanmıştır (Şekil 2D, v). Nötrofiller Ly6G+Siglec-Folarak tanımlanmış – (Şekil 2D, vi). Siglec-F+ hücreleri öncelikle eozinofil(Şekil 2D, vii) idi. Ly6G üzerinde gating–Siglec-F– hücreler, monositler/makrofajlar F4/80+ hücre olarak tanımlandı (Şekil 2D, viii). F4/80+ hücreler Ly6Chi inflamatuar monositleri ayırt etmek için Ly6C ekspresyonu ile daha da fraksiyona alınabilir (Şekil 2D, ix) ve Ly6Cdüşük monosit türevi makrofajlar (Şekil 2D, x)26.
Sitokinleri ve diğer yarada çözünen faktörleri ölçme yeteneği PVA sünger yara modelinin bir diğer avantajıdır. Sünger başına 100°L'ye kadar sıvı ayıklamak mümkündür. Ayıklanan sıvılar downstream tahliller çeşitli için uygundur. ELISA veya boncuk bazlı multipleks immünoassays tarafından erken ve geç yara sıvılarında sitokinler ve kemokinlerin tespiti başka bir yerde bildirilmiştir26,30. Aynı yaradan hem hücre hem de sıvı elde etmek mümkündür. Bunu yapmak için, hücre izolasyonu için dorsal orta hattın bir tarafından üç sünger ve sıvı ekstraksiyonu için dorsal orta hattın karşı tarafında 3 sünger izole etmek için tavsiye edilir.
Kuyruk derisi eksizyon modeli kullanılarak yara kapanmasının değerlendirilmesi
Eksizyonel kuyruk deri modeli yoğun kürk eksik firma cilt yavaş yara kapatma çalışması için dorsal deri yumruk biyopsi yöntemine bir alternatif sağlar. Eksizyon sonrası 1, 7 ve 15 gün kuyruk deri yaralarının örnek görüntüleri Şekil 3A'dagösterilmiştir. Yara kapanması zaman içinde yara yatağının alanı ölçülerek ölçülebilir. Gün 7 ve gün 15 yara yatak alanları yaklaşık% 70 ve% 35, sırasıyla, gün 1 yara alanı(Şekil 3B)idi. Tam yara kapanması yaklaşık 28 gün gerekli. Kuyruk derisindeki yara histolojik analiz ile kesitte de görülebilir. Şekil 3C ve Şekil 3D, sırasıyla H&E ve Masson'un Trichrome lekeli kuyruk kesitlerinin temsili görüntülerini gösterir. Eksireli derinin lateral kenar boşlukları kuyruğun sırt yüzeyindeok başları ile gösterilir.
Şekil 1: Murine yara iyileştirici modellerin şeması. (A) 8 mm x 8 mm x 0,4 mm. (B) Dorsal orta hat kesisinin (merkezi kırmızı çizgi) ve altı 1 cm x 1 cm x 0,5 cm PVA süngerin deri altı ceplere yerleştirilmelerini gösteren bir farenin yan (sol) ve üst (sağ) görünümü. (C) Kuyruk sırt yüzeyinde eksizyonel bir deri yarasının (10 mm x 3 mm kırmızı dikdörtgen) boyutunu ve yerleşimini gösteren şema. (D) İmplantasyondan 7 gün sonra deri altı uzaydan alınan üç süngerden izole edilen yara sıvısı. (E) İmplantasyondan 7 gün sonra yaradan alınan süngerlerin görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PVA sünger implantasyonuna sistemik ve hücresel yanıt. (A) Plazmadaki IL-6 düzeylerinin bir zaman seyri PVA sünger implantasyonunun sistemik inflamatuar yanıta yol açtığını göstermektedir. IL-6 konsantrasyonu çokluk boncuk bazlı immünoassay kullanılarak ölçüldü. (B) PVA süngeryarasından izole edilen hücre sayısı zamanla artmıştır. (C) Zaman kursu, pva sünger yaralarında nötrofiller, monositler ve monosit kaynaklı makrofajların zaman içinde birikmesini gösterir. (D) PVA sünger yaralarından izole edilen hücrelerin temsili bir gating stratejisi, akış sitometrik analizi ile lökosit alt kümelerinin nasıl belirlenebildiğini gösterir. Kapılar aşağıdaki gibi tanımlanır: (i ve ii) doublet dışlama, (iii) ölü hücre dışı bir amin-reaktif fikse edilebilir canlılık boyası kullanarak, (iv) FSC-A ve SSC-A, (v) CD45+ hematopoetik hücreler, (vi) Ly6G+ nötrofiller, (vi )Siglec-F+ eozinofiller, (viii) Ly6G–Siglec-F– F4/80+ monositler/makrofajlar, (ix) F4/80+ + Ly6Chi monositler ve (x) F4/80+Ly6Cdüşük makrofajlar. Kapılar floresan eksi bir (FMO) kontrollerine göre yerleştirildi. A–C'de gösterilen veriler ortalama ± SEM, n = 6-10 farenin grup başına(A),n = 8-9 fare içinde (B), n = 6-8 fare(C)olarak Tüm veriler 2-3 bağımsız deneyden birleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Eksizyonel kuyruk yara iyileşmesinin değerlendirilmesi. (A) Eksizyonel kuyruk deri yaralarının 1, 7 ve 15 gün sonra yaralanmış olarak çekilmiş temsili fotoğrafları. (B) Eksizyonel kuyruk deri yaralarının kapanma oranı. Yaralar iki günde bir fotoğraflandı. Yara yatağı marjlarını takip etmek ve belirtilen zaman noktalarında yara alanını hesaplamak için görüntü işleme yazılımı kullanılmıştır. Yara alanı, 1. (C) H&E veya (D) Masson's Trichrome ile parafin gömülü, kesitli ve lekeli kuyruk kesitlerinin temsili görüntüleri. Yara, kuyruk kesitinin sırt yüzeyinde yer alıyordu; lateral yara kenarları ok uçları ile gösterilir. (B)içinde gösterilen veriler grup başına ortalama ± SEM, n = 8 faredir. Veriler iki bağımsız denemeden birleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, akut yara iyileşmesi yanıtının değerlendirilmesini sağlayan iki çekilebilir murine yara modeli açıklanmaktadır. İlk yöntem dorsal deri altı alana PVA süngerlerin cerrahi implantasyonu içerir. Bu yaklaşım, izole süngerlerden elde edilen çok sayıda hücre ve yara sıvısı miktarı nedeniyle hücresel yara iyileşmesi yanıtını incelemek için biyopsi bazlı yara modellerine göre belirgin bir avantaj sağlar. Bu işlemin başarılı bir şekilde uygulanabı için, kesi çevresindeki deriyi iyice temizleyerek steril bir cerrahi alanın korunması zorunludur, çünkü bakterilerin yaraya aktarılması iyileşme sürecini önemli ölçüde değiştirecektir. Burada açıklanan hücre izolasyonu yöntemini kullanarak, sünger çıkarma zamanına bağlı olarak PVA süngerlerinden en az 1-10 x 106 hücreyi izole etmek mümkündür. PVA sünger yaralarından izole edilen hücrelerin çoğu canlıdır(Şekil 2D). Ancak, mekanik bozulmadan sonra izole edilmiş yara hücrelerinin ~%20'sini oluşturan ölü hücrelerin mümkün olması nedeniyle, akış sitometrisi bazlı analizlere devam ederken canlılık lekesi kullanılması tavsiye edilir. PVA sünger yaralarından izole edilen hücreler cd45 pozitifliği ile belirlenen hematopoetik kökenlidir(Şekil 2D). Monositler ve makrofajlar takip nötrofillerin hızlı birikimi yara onarım ı akut aşamaları ile tutarlı3,4,34,35,36,37,38. İzole hücreler immünofenotipleme, hücre ayıklama, kültür çıkarma, RNA çıkarma ve çeşitli fonksiyonel tahliller dahil olmak üzere downstream analizleri için uygundur.
PVA sünger yara modeli de sıvıların izolasyon sağlar, hangi akut yara ortamında sitokin ve büyüme faktörü yanıtları değerlendirmek için idealdir. PVA sünger sıvıları ELISA tarafından test için uygundur, boncuk bazlı multipleks immünoassay, ve protein niceliği, diğerleri arasında. Daha önceki çalışmalar, sitokin ve büyüme faktörü ölçümü ile erken yara ortamının doğada inflamatuar olduğunu, IL-6, TNF-α ve IL-1β'nin 1-3 gün arasında hızlı indüksiyonu ile ortaya koymuştur. Yara ortamı daha sonra VEGF ve TGF-β22,23,25,26,30dahil olmak üzere pro-anjiyojenik ve pro-fibrotik büyüme faktörleri, daha sonra indüksiyon ile bir reparatif duruma geçişler .
PVA sünger implantasyon modeli akut yara hücresel ve sitokin yanıtları çalışma için avantajlı olsa da, sınırlamalarından biri iyileşme oranı veya derecesini ölçmek için yetersizlik olduğunu. Yara iyileşmesinin bu yönünün ölçümü, komorbid durumun yara iyileşmesi yanıtının çeşitli yönleri üzerindeki etkilerini değerlendirirken gerekli olabilir30. Bu metrik için biyopsi bazlı yöntemler tercih edilir. Burada kuyruk derisi eksizyonu modeli sunulmaktadır. Bu modelde kuyruk derisinin tam kalınlıkta bir bölümü kuyruğun sırt yüzeyinden çıkar. Yine, steril bir cerrahi alan bakımı yara yatağı aşılama önlemek için önemlidir. Bir sprey bariyer film veya diğer yara kaplama kullanımı da daha sonra yara enfeksiyonu önlemek için tavsiye edilir. Yaşlı erkek fareler veya agresif suşları yaranın bozulmasını önlemek için yalnız konut gerektirir. Yara iyileşmesi için bir site olarak kuyruk belirli bir avantajı, diğerleri tarafından açıklandığı gibi, kapatma için yeniden epitelizasyon daha fazla dayanır27,32,33. Yara yatağı alanını ölçmenin ve histolojik analizlerin yanı sıra, diğerleri iyileşme süreçlerinin modüle edilmesinde topikal müdahalelerin etkinliğini değerlendirmede kullanımını bildirmiş33.
Bu yöntemlerde tanımlanan yara modellerinin her biri, yara onarım süreçlerinin sabit durumda ve komorbiditevarlığında anlaşılması nda farklı avantajlar sunmaktadır. Inbred farelerin genetik olarak değiştirilmiş suşlarının geniş kullanılabilirliği nedeniyle, süreç hakkında mekanistik soruları cevaplamak için yara iyileştirici yanıtları manipüle etmek de mümkündür. Ayrıca, bu sistemler diyabet, yaşlanma, ikincil enfeksiyon ve diğerleri30,36,,39,40dahil olmak üzere kötü yara iyileşmesi ile ilişkili koşulların murine modellerinde uygulanabilir. Mürin çalışmalarından elde edilen mekanistik anlayışlar daha sonra daha yüksek derecede hayvan modellerinde yara iyileşmesi nin incelenmesinde temel oluşturabilir. Birlikte, PVA sünger implantasyonu ve eksizyonel kuyruk deri yara modelleri istikrarlı bir durum ve patolojik koşullar altında yara iyileşme süreçlerini açıklamak için çekilebilir ve çok yönlü sistemler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Kevin Carlson Brown Üniversitesi Akış Sitometri ve Sıralama Tesisi danışma ve akış sitometri deneyleri ile yardım için teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1B ve C'deki görüntüler BioRender ile oluşturulmuştur. Kayla Lee ve Gregory Serpa fotoğrafyardım için teşekkür edilir. Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) YFAA15 D15AP00100, Yeni Gelişen Yeni Bilim Ödülü Dekan Alanları (Brown Üniversitesi), Ulusal Kalp Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) 1R01HL126887-01A1, Ulusal Çevre Bilimleri Enstitüsü (NIES) T32-ES7272 (Çevre Patolojisi Eğitimi) ve Brown Üniversitesi Araştırma Tohum Ödülü.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 15 mL centrifuge tubes, Olympus | Genesee | 28-103 | |
| 1x HBSS (+Calcium, +Magnesium, –Phenol Red) | ThermoFisher Scientific | 14025076 | |
| 5ml Syringe | BD | 309646 | |
| Anti-mouse CD45.2-APC Fire750 | BioLegend | 109852 | Clone 104 |
| Anti-mouse F4/80-eFluor660 | ThermoFisher Scientific | 50-4801-82 | Clone BM8 |
| Anti-mouse Ly6C-FITC | BD Biosciences | 553104 | Clone AL-21 |
| Anti-mouse Ly6G-PerCP-eFluor710 | ThermoFisher Scientific | 46-9668-82 | Clone 1A8-Ly6g |
| Anti-mouse Siglec-F-APC-R700 | BD Biosciences | 565183 | Clone E50-2440 |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clip Applier | Braintree Scientific | NC9021392 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Blender Bag, 80mL | Fisher Scientific | 14258201 | |
| Culture Tube, 16mL, 17x100 | Genesee Scientific | 21-130 | |
| Fetal Bovine Serum - Standard | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Fixable Viability Dye eFluor506 | ThermoFisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Hepes Solution, 1M | Genesee Scientific | 25-534 | |
| ImageJ Software | NIH | ||
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
| Polyvinyl alcohol sponge - large pore size | Ivalon/PVA Unlimited | www.sponge-pva.com | |
| Povidone-iodine solution, 10% | Fisher Scientific | 3955-16 | |
| Spray barrier film, Cavilon | 3M | 3346E | |
| Stomacher 80 Biomaster, 110V | Seward | 0080/000/AJ |
References
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 8 (2), 83-96 (2000).
- Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. A Modeling Conundrum: Murine for Cutaneous Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Huber-Lang, M., Lambris, J. D., Ward, P. A. Innate immune responses to trauma. Nature Immunology. 19 (4), 327-341 (2018).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Phenotypic Transitions of Macrophages Orchestrate Tissue Repair. The American Journal of Pathology. 183 (5), 1352-1363 (2013).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Wang, L. Chemokines and Their Receptors Are Key Players in the Orchestra That Regulates Wound Healing. Advances in Wound Care. 2 (7), 327-347 (2013).
- Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nature Communications. 10 (1), 650 (2019).
- Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), 2971 (2018).
- Davidson, J. M., et al. Accelerated wound repair, cell proliferation, and collagen accumulation are produced by a cartilage-derived growth factor. The Journal of Cell Biology. 100 (4), 1219-1227 (1985).
- Buckley, A., Davidson, J. M., Kamerath, C. D., Wolt, T. B., Woodward, S. C. Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (21), 7340-7344 (1985).
- Peterson, J. M., Barbul, A., Breslin, R. J., Wasserkrug, H. L., Efron, G. Significance of T-lymphocytes in wound healing. Surgery. 102 (2), 300-305 (1987).
- Efron, J. E., Frankel, H. L., Lazarou, S. A., Wasserkrug, H. L., Barbul, A. Wound healing and T-lymphocytes. Journal of Surgical Research. 48 (5), 460-463 (1990).
- Schäffer, M. R., Tantry, U., Thornton, F. J., Barbul, A. Inhibition of nitric oxide synthesis in wounds: pharmacology and effect on accumulation of collagen in wounds in mice. The European Journal of Surgery = Acta Chirurgica. 165 (3), 262-267 (1999).
- Opalenik, S. R., Davidson, J. M. Fibroblast differentiation of bone marrow-derived cells during wound repair. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (11), 1561-1563 (2005).
- Järveläinen, H., et al. A role for decorin in cutaneous wound healing and angiogenesis. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 14 (4), 443-452 (2006).
- Luckett, L. R., Gallucci, R. M. Interleukin-6 (IL-6) modulates migration and matrix metalloproteinase function in dermal fibroblasts from IL-6KO mice. The British Journal of Dermatology. 156 (6), 1163-1171 (2007).
- Daniel, T., et al. Regulation of the postburn wound inflammatory response by gammadelta T-cells. Shock. 28 (3), 278-283 (2007).
- MacLauchlan, S., et al. Macrophage fusion, giant cell formation, and the foreign body response require matrix metalloproteinase 9. Journal of Leukocyte Biology. 85 (4), 617-626 (2009).
- Schwacha, M. G., Thobe, B. M., Daniel, T., Hubbard, W. J. Impact of thermal injury on wound infiltration and the dermal inflammatory response. Journal of Surgical Research. 158 (1), 112-120 (2010).
- Ganesh, K., et al. Prostaglandin E2 Induces Oncostatin M Expression in Human Chronic Wound Macrophages through Axl Receptor Tyrosine Kinase Pathway. The Journal of Immunology. 189 (5), 2563-2573 (2012).
- Deskins, D. L., et al. Human mesenchymal stromal cells: identifying assays to predict potency for therapeutic selection. Stem Cells Translational Medicine. 2 (2), 151-158 (2013).
- Daley, J. M., Brancato, S. K., Thomay, A. A., Reichner, J. S., Albina, J. E. The phenotype of murine wound macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 59-67 (2010).
- Thomay, A. A., et al. Disruption of Interleukin-1 Signaling Improves the Quality of Wound Healing. The American Journal of Pathology. 174 (6), 2129-2136 (2009).
- Brancato, S. K., et al. Toll-like receptor 4 signaling regulates the acute local inflammatory response to injury and the fibrosis/neovascularization of sterile wounds. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 21 (4), 624-633 (2013).
- Daley, J. M., et al. Modulation of macrophage phenotype by soluble product(s) released from neutrophils. Journal of Immunology. 174 (4), 2265-2272 (2005).
- Crane, M. J., et al. The monocyte to macrophage transition in the murine sterile wound. PloS One. 9 (1), 86660 (2014).
- Falanga, V., et al. Full-thickness wounding of the mouse tail as a model for delayed wound healing: accelerated wound closure in Smad3 knock-out mice. Wound Repair and Regeneration. 12 (3), 320-326 (2004).
- Li, J., et al. Molecular mechanisms underlying skeletal growth arrest by cutaneous scarring. Bone. 66, 223-231 (2014).
- Zhou, S., et al. A Novel Model for Cutaneous Wound Healing and Scarring in the Rat. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 468-477 (2019).
- Crane, M. J., et al. Pulmonary influenza A virus infection leads to suppression of the innate immune response to dermal injury. PLOS Pathogens. 14 (8), 1007212 (2018).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Rittié, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communication and Signaling. 10 (2), 103-120 (2016).
- Falanga, V., et al. Autologous Bone Marrow-Derived Cultured Mesenchymal Stem Cells Delivered in a Fibrin Spray Accelerate Healing in Murine and Human Cutaneous Wounds. Tissue Engineering. 13 (6), 1299-1312 (2007).
- Lucas, T., et al. Differential Roles of Macrophages in Diverse Phases of Skin Repair. The Journal of Immunology. 184 (7), 3964-3977 (2010).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Mirza, R. E., Koh, T. J. Contributions of cell subsets to cytokine production during normal and impaired wound healing. Cytokine. , 1-4 (2014).
- Mirza, R., DiPietro, L. A., Koh, T. J. Selective and Specific Macrophage Ablation Is Detrimental to Wound Healing in Mice. The American Journal of Pathology. 175 (6), 2454-2462 (2010).
- DiPietro, L. A., Burdick, M., Low, Q. E., Kunkel, S. L., Strieter, R. M. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. Journal of Clinical Investigation. 101 (8), 1693-1698 (1998).
- Wetzler, C., Kämpfer, H., Stallmeyer, B., Pfeilschifter, J., Frank, S. Large and Sustained Induction of Chemokines during Impaired Wound Healing in the Genetically Diabetic Mouse: Prolonged Persistence of Neutrophils and Macrophages during the Late Phase of Repair. Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 245-253 (2000).
- Kim, D. J., Mustoe, T., Clark, R. A. Cutaneous wound healing in aging small mammals: a systematic review. Wound Repair and Regeneration. 23 (3), 318-339 (2015).
