在这里,我们介绍在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素38表达的分子特征。
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种退行性肌肉疾病,导致肌肉质量的逐渐丧失,导致过早死亡。突变往往导致读取框架失真和过早停止的鳕鱼,导致几乎完全缺乏肌营养不良蛋白。可使用诱导寡核苷酸(AON)纠正阅读框架,诱导外向跳过。morpholino AON viltolarsen(代号:NS-065/NCNP-01)已被证明诱导 exon 53 跳过,恢复 exon 52 删除患者的阅读框架。我们最近给DMD患者静脉注射了NS-065/NCNP-01的静脉注射,这是由探索性研究者发起的NS-065/NCNP-01首次人工试验。在本文的本文中,我们提出了在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素表达的分子特征。肌营养不良素表达的表征是显示疗效的基础研究,因为没有进行功能结果测试。
杜氏肌营养不良症(DMD)是一种退行性肌肉疾病,导致肌肉质量逐渐丧失,呼吸衰竭和心肌病,并导致过早死亡1。这种疾病是由缺乏大结构肌肉蛋白营养不良素2引起的。X染色体上的DMD基因突变是隐性的,该病影响3500-5000名新出生男性中的1个,3,4,5。,5突变往往是在外向44和55之间的热点区域大删除,导致扭曲的阅读框架和过早停止的鳕鱼,导致无稽之谈的调解衰变和几乎完全缺乏肌营养不良蛋白6,7,8。,7,8阅读框架可以使用反义寡核苷酸(AONS)进行校正,这种蛋白能诱导外向跳跃并恢复阅读框架,部分恢复肌营养不良的表达,延缓疾病进展,9、10、11。,11最近被联邦药物局(FDA)批准的奥菲诺奥·艾特普利森,诱导跳过exon 51,并可以恢复与exon 52删除12,13,的患者的阅读框架。然而,exon 53跳过恢复患者的阅读框架与exon 52删除,它有可能治疗约10%的DMD患者14。Morpholino AON 药物 NS-065/NCNP-01 已被证明诱导 exon 53 在人类细胞中跳跃, 我们最近给DMD患者进行了第一期开放标签剂量升级临床试验(以下简称”研究”)(注册为UMIN:00010964和ClinicalTrials.gov:NCT02081625)14。14研究表明,根据基于西方印迹的RT-PCR和营养不良蛋白水平,剂量依赖性增加53,14日未观察到严重不良药物事件或辍学。
在所有临床试验中,结果的分析至关重要。对于DMD临床试验,关于显示治疗效果的最佳方法的辩论仍在进行中。临床测试,如6分钟的步行测试有一些缺点。反营养不良素表达的分子表征可以使用多种方法进行,如RT-PCR、qPCR、数字PCR、西部印迹和免疫hito化学。然而,提供临床益处所需的蛋白质表达恢复程度仍不清楚。在这篇文章中,我们详细描述了RT-PCR和西方印迹方法,分别用于确定外延跳孔和蛋白质水平,在AON跳过药物NS-065/NCNP-0114的阶段试验中。
DMD 的临床试验在上些年取得了成功和失败。RT-PCR 和西方印迹都是用于评估给患者施用的 exon 跳过化合物产生的跳过效率的常见技术。然而,据报道,与数字PCR15相比,RT-PCR高估了跳过效率。尽管这是由于许多原因造成的,但这主要是由于 PCR 周期中较小跳过的片段的更高效放大。与西方印迹估计的蛋白质表达相比,这次临床试验中使用的RT-PCR似乎也产生了更高的跳过效率。根据FDA,这是一个更可靠的方法量化肌营养不良素恢复12。因此,在解释RT-PCR跳过结果时应谨慎行事;然而,样品仍然可以比较。在西方印迹分析中,显示更高跳过效率的样本通常可提高蛋白质表达水平。
由于 DMD 临床试验中的所有患者没有相同的删除模式,因此很难设计出足够特定的底器和探针,以便在所有样品上执行数字或 qPCR。因此,RT-PCR 仍然是首次评估跳过效率的一个很好的替代方案。在NS-065/NCNP-01的临床试验开始之前,评估每个患者体外跳过效率是乏味的,因为肌肉或皮肤活检是强制性的,以产生患者特异性肌细胞。然而,我们最近出版了一种新的技术,以产生患者特定的 MYOD1 转换,尿液衍生细胞 (UDC) 作为一个新的 DMD 肌肉细胞模型16。因此,只需要从患者那里收集的尿液才能产生肌细胞,并且不需要侵入性手术。我们相信,这种方法可用于筛选患者特异性细胞中不同的 AON。此外,在患者开始任何临床试验之前,可以测试不同的底剂和探针。这可以帮助在未来的DMD临床试验中使用qPCR或数字PCR进行外向跳过测量。
在本次临床试验中,用于进行西印分析,使用单一的抗肌营养不良素抗体,仅使用一种健康对照作为参考样本。因此,抗体的特异性没有得到适当的验证。这一点,加上抗体只识别肌营养不良素的C-终端域,是协议的一个限制。今后,建议对针对肌营养不良素分子不同领域的进行更健康的对控和抗体。
在这里,我们总结了最近由探索性调查员发起的NS-065/NCNP-01人类试验中使用的协议。NS-065/NCNP-01 可能适用于 10.1% 的 DMD 患者。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢斋藤高桥博士、长田泰子博士、佐藤山正夫博士和田中博士进行科学讨论。
100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
EzBlot | Atto | AE-1460 | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
SDS | Nacalai | 31606-75 | |
Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Urea | Nacalai | 35907-15 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |