Summary
在这里，我们介绍在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素38表达的分子特征。
Abstract
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，导致肌肉质量的逐渐丧失，导致过早死亡。突变往往导致读取框架失真和过早停止的鳕鱼，导致几乎完全缺乏肌营养不良蛋白。可使用诱导寡核苷酸（AON）纠正阅读框架，诱导外向跳过。morpholino AON viltolarsen（代号：NS-065/NCNP-01）已被证明诱导 exon 53 跳过，恢复 exon 52 删除患者的阅读框架。我们最近给DMD患者静脉注射了NS-065/NCNP-01的静脉注射，这是由探索性研究者发起的NS-065/NCNP-01首次人工试验。在本文的本文中，我们提出了在临床试验中使用桑格测序、RT-PCR和西印迹的肌营养不良素表达的分子特征。肌营养不良素表达的表征是显示疗效的基础研究，因为没有进行功能结果测试。
Introduction
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种退行性肌肉疾病，导致肌肉质量逐渐丧失，呼吸衰竭和心肌病，并导致过早死亡1。这种疾病是由缺乏大结构肌肉蛋白营养不良素2引起的。X染色体上的DMD基因突变是隐性的，该病影响3500-5000名新出生男性中的1个,3，4，5。,5突变往往是在外向44和55之间的热点区域大删除，导致扭曲的阅读框架和过早停止的鳕鱼，导致无稽之谈的调解衰变和几乎完全缺乏肌营养不良蛋白6，7，8。,7,8阅读框架可以使用反义寡核苷酸（AONS）进行校正，这种蛋白能诱导外向跳跃并恢复阅读框架，部分恢复肌营养不良的表达，延缓疾病进展,9、10、11。,11最近被联邦药物局（FDA）批准的奥菲诺奥·艾特普利森，诱导跳过exon 51，并可以恢复与exon 52删除12，13,的患者的阅读框架。然而，exon 53跳过恢复患者的阅读框架与exon 52删除，它有可能治疗约10%的DMD患者14。Morpholino AON 药物 NS-065/NCNP-01 已被证明诱导 exon 53 在人类细胞中跳跃， 我们最近给DMD患者进行了第一期开放标签剂量升级临床试验（以下简称"研究"）（注册为UMIN：00010964和ClinicalTrials.gov：NCT02081625）14。14研究表明，根据基于西方印迹的RT-PCR和营养不良蛋白水平，剂量依赖性增加53，14日未观察到严重不良药物事件或辍学。
在所有临床试验中，结果的分析至关重要。对于DMD临床试验，关于显示治疗效果的最佳方法的辩论仍在进行中。临床测试，如6分钟的步行测试有一些缺点。反营养不良素表达的分子表征可以使用多种方法进行，如RT-PCR、qPCR、数字PCR、西部印迹和免疫hito化学。然而，提供临床益处所需的蛋白质表达恢复程度仍不清楚。在这篇文章中，我们详细描述了RT-PCR和西方印迹方法，分别用于确定外延跳孔和蛋白质水平，在AON跳过药物NS-065/NCNP-0114的阶段试验中。
Protocol
调查员启动的审判业务程序已获国家方案伦理委员会批准（批准ID：A2013-019）。
1. 肌肉样本的准备
注：比塞普斯胸围或四头肌肌肉通常被选为活检点。然而，头骨前被用于临床试验。
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患者的肌肉活检
- 在皮肤准备之前标记切口部位。
- 为活检标本准备盐水湿纱布。把纱布挤好。
- 将局部麻醉注射到皮肤和皮下组织，而不是注入肌肉。确保麻醉的深度，没有皮肤疼痛。
注：一般麻醉一般用于15岁以下儿科患者。 - 切口从皮肤到皮下组织。使用小缩回器打开切口并分离皮下脂肪。
注意：在此步骤中，可以切割部分皮肤，用于成纤维细胞培养。 - 在筋膜中再做一个小切口，进一步切开筋膜。用蚊子钳子夹住边缘以暴露肌肉。
- 使用缝合线拉起肌肉的选定部分。用虹膜剪刀做一条小隧道，把蚊子钳子插入隧道。
- 使用钳子分离肌肉束，并切割目标部分的两端。
注：肌肉活检标本应大约在成人患者的铅笔大小（长度为1.0-1.5厘米，直径0.8-1.0厘米）。在儿科患者中，标本的长度应约为1厘米，直径应为5毫米。 - 将试样包裹在盐水湿润的纱布中，并在室温 （RT） 下立即将新鲜肌肉运送到可准备样品进行进一步分析的设施。
注：如果运输时间超过 1 小时，样品应在 4 °C 下运输。
2. 肌肉样品制备
- 混合等量的牙龈和水，直到口香糖变得柔软和粘稠。将混合物装入 25 mL 注射器中。注射器可以存放在冰箱中。
- 将大约 0.5 至 1 厘米的牙龈放在软盘上。将光盘标记为另一侧。
- 将一个异丙烷容器放在液氮中，直到一些液体结冰。
- 将试样放在气管胶中。每个肌肉的纵向轴应垂直于软木塞。在每个肌肉底部放置口香糖，以帮助正确放置。
- 使用钳子，将肌肉/软木标本放在步骤 2.3 中准备的冷异丙烷中进行冷冻。持续移动试样 1 分钟或直到完全冻结，并暂时放在干冰上。
- 将样品放在玻璃瓶中，储存在-80°C。
3. 肌肉剖块
- 设置低温恒温器，用于工作温度为 -25 °C 的截切。
- 安装软木塞/肌肉块并修剪，直到达到平坦部分。
- 使用 10 μm 的截面厚度进行 RT-PCR 和西印迹。分别使用6-8μm和10-12μm的厚度进行免疫组织化学或血氧素和eosin染色。将切片部分放入 2.0 mL 管中，并储存在 -80°C，用于 RT-PCR 和西印迹。
4. RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
- 通过低温恒温器从冷冻肌肉中提取约10片厚度为10 μm的切片。使用总RNA的纯化试剂盒，根据制造商的说明收集纯化总RNA。
- 使用分光光度计测量RNA浓度。
- 根据表1，将RT-PCR反应所需的试剂组合在PCR 管中。有关 底图序列 ，请参阅表 2。
注：患者NS-03的正向底注为44F，患者NS-07为46F。反向底像为 54/55R 作为默认值。如果非特定产品明显，则使用 54R 作为替代产品。 - 将含有混合物的 PCR 管放入热循环器中。根据表3运行热 循环器。
- 将 PCR 产品储存在 4 °C，用于短期存储，或 -20°C 长期存储。
5. 微芯片电泳和 exon 跳过计算
注：通常选择微芯片电泳系统（MCE）来分析执行效率。在此协议中，我们描述了制造商 A 以及制造商 B（以下简称系统 A 和 B）使用 MCE 系统分析 exon 跳过效率所需的步骤。在临床试验中，对系统 A 的 exon 跳过效率进行了分析。但是，系统 A 不再出售，我们建议系统 B 分析 exon 跳过效率。我们包括了两个系统的协议（系统 A 的 5.1 和系统 B 的 5.2 节）。有关 系统 A 和 B 的信息，请参阅材料表。此外，此步骤也可以执行与正常的阿加罗斯凝胶电泳，但灵敏度显著降低。
- 使用系统 A 的微芯片电泳
注：系统 A 有两种类型的芯片。在这里，我们描述DNA芯片的步骤。- 平衡试剂（染色缓冲液、装载缓冲液、梯子和凝胶缓冲液）到RT、涡流和旋转。
- 要制备凝胶染色缓冲液 （GS），将 12.5 μL 的污渍缓冲液加入 250 μL 的凝胶缓冲液和涡流 10 s。将溶液以 2，400 x g 的旋转滤管和离心机移至离心机 15 分钟。丢弃过滤器。
注：过滤后 GS 可储存在 4 °C 1 个月。 - 如果样品浓度高，用TE缓冲液或无DNase水稀释至约50纳克/μL。
注：如果样品的盐浓度 = 200 mM KCl（或 NaCl）和/或 15 mM MgCl2，则交换缓冲液。 - 将 12 μL 的 GS 溶液添加到 DNA 芯片的凝胶注水井（高亮和标记 GS）中，并将芯片放在注注站中。
注：为避免气泡，在点胶时，垂直插入移液器尖端和井底。缓慢地分配到移液器上的第一个停止，并且不要排出移液步骤末端的空气。 - 选择 C3 模式，然后按"开始 " 按钮。注机完成后，取出芯片。
- 目视检查微通道有无陷空气气泡或注油不完整。
- 将准备好的样品和梯子加载到芯片上，如下所示。
- 将 9 μL 的 GS 溶液移入其他 3 个 GS 井。
- 移液 5 μL 的负载缓冲器进入 L 井和每个样品井 （1-11）。
- 移液 1 μL 的梯子进入 L 井。
- 将1 μL的DNA样品移入11个样品井中。
- 将 1 μL 的 TE 或无 DNase 水放入任何未使用的水井中。套件快速指南显示芯片布局图。
注：通过将芯片保持为浅色背景上方，检查所有孔中有无气泡。用干净的移液器尖端或拆卸并重新装装溶液，清除井底任何受困的气泡。
- 将芯片放在涡流站中，然后按 "混合"。涡流站在 1 分钟后自动停止。
- 在装载后 5 分钟内在电泳站中运行芯片。
- 在软件工具栏中选择"新运行"。在"新运行"屏幕上，从"检测"下拉列表中选择 DNA 和DNA 1K。
- 从"项目"下拉列表中为 运行选择项目 文件夹，或者通过在"项目"字段中输入名称创建新 项目 文件夹。
- 在"运行前缀"字段中输入运行的名称，然后单击"开始运行"。
- 分析完成后，仪器发出蜂鸣音，并打开一个窗口，指示运行结束。选择 " 确定"并从芯片平台上卸下芯片。
- 选择 文件 |导出数据 以导出数据。在导出对话中选择 所需的 选项。
- 要清洁电极，请用 800 μL 的去电化水填充清洁芯片，并放在芯片平台上，合上盖子，然后关闭 1 分钟。1 分钟后，打开盖子，取出清洁芯片，让电极干燥 1 分钟。
- 使用系统 B 的微芯片电泳
- 打开操作软件并输入示例信息。输入信息后，软件会自动计算分离缓冲区和标记解决方案的数量。
- 准备软件计算的必要分离缓冲区量。首先，用适当数量的TE缓冲液稀释10，000x溶液，准备100倍核酸凝胶染色溶液。100x 溶液可储存在-20°C。
- 将适当量的 100 倍核酸凝胶污渍与公司提供的特定管中分离缓冲液混合，以准备 1x 溶液。漩涡解决方案。
- 在管中准备所需数量的标记溶液。
- 启动探头清洗程序。
- 完成后启动微芯片清洗程序。
- 同时，将样品移液到PCR多板（96孔，清澈）中，用去电化水稀释4次。机器可处理的最小体积为 6 μL，最大体积为 30 μL。我们建议总体积为 10 μL（2.5 μL 样品和 7.5 μL 的水/TE 缓冲液）。
- 用粘合的 PCR 密封箔片盖住板，然后旋转样品。
- 根据机器显示的位置，在机器中设置板、标记溶液和 1x 分离缓冲液。按下" 开始" 按钮。
- 运行完成后，从软件将结果数据导出为 .csv 文件，并使用摩尔浓度计算 exon 跳过效率，如下所示：
Exon 跳过效率 （%） = （跳过波段 / （跳过波段 + 非跳过波段） X 100
6. 补充DNA（cDNA）测序
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阿加罗斯凝胶制备
- 测量 1.5 g 的阿加罗斯粉末，将粉末与 100 mL 的 1x TAE 缓冲液混合在微可瓦的烧瓶中（产生 1.5% 的 agarose 凝胶）。
- 微波1-3分钟，直到红糖完全溶解。
注意：不要过度冷却溶液，因为一些缓冲液会蒸发并改变凝胶的最终加糖百分比。 - 让加糖溶液冷却至约50°C。
- 在红糖溶液中加入10 μL 10，000x荧光核酸染料。
- 将加糖倒入凝胶托盘中，将井梳放在位上。在 RT 离开 20-30 分钟，直到它完全凝固。
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测 序
- 混合 5 μL 的 RT-PCR 产品（从步骤 4.4）和 1 μL 的 6x 加载缓冲液。将它们装入1.5%的加糖凝胶的孔中。
- 在 135 V 下运行凝胶 5 分钟，在 120 V 下运行 20 分钟。
- 根据制造商的协议，使用转发光器可视化频段。
- 从凝胶中清除感兴趣带，并使用凝胶和 PCR 清理套件检索 RT-PCR 产品。
- 使用分光光度计测量浓度。
注：如果内部没有桑格测序设备，可发送纯化带在公司或测序设施进行测序。 - 根据表4，为循环测序试剂盒和移液器准备所需的试剂，放入多板PCR 板中。有关 底图序列 ，请参阅表 2。
- 用透明胶粘膜密封板。
- 旋转板2至3 s。在摆动桶离心机中短暂离心机，使内装物以 1，000 x g 稳定到井底 （5 至 10 s）。
注：油井中可能存在气泡，但它们不会对反应产生负面影响。 - 将混合物放入热循环器中，然后按照表 5运行。
- 根据制造商的说明用板进行测序反应。
- 使用 DNA 分析仪根据制造商的协议确定序列。
- 将获得的序列与患者的预期序列进行比较。
7. 西印
- 样品制备
- 准备 SDS 样品缓冲液（4% SDS、4 M 尿素、10% 2-二甲醇、10% 甘油、70 mM Tris-HCl pH 6.4、0.001% 布罗莫酚蓝色和蛋白酶抑制剂）。
- 将从低温截面中收集的约 100 片 10 μm 肌肉部分放在 150 μL 的 SDS 缓冲液中。
- 使用方便的微均质器，将冰上蛋白质样品简单均匀 30 秒。
- 在 16，500 x g 下离心 15 分钟，然后将上一液转移到新鲜管中。在 -80 °C 下继续分析或储存。
- 用于蛋白质浓度测量的SDS-PAGE
注：使用荧光凝胶染色来确定蛋白质浓度。- 根据制造商的说明，使用 BCA 蛋白质测定试剂盒确定正常健康控制样品重量和浓度。
- 准备凝胶电泳样品。移液10μg的总蛋白的健康控制和5μL的患者样品，5μL的4x样品缓冲液，2μL的10倍样品还原剂。混合后，将去维水加入每个样品中20 μL的最终体积。
- 在70°C加热样品10分钟。
- 使用 50 mL 的 40x SDS 运行缓冲区准备 2，000 mL 的 1x SDS 运行缓冲区。用1，950 mL的去化水稀释。
注意：此时，1，000 mL 的运行缓冲区就足够了。剩余的 1，000 mL 缓冲液用于步骤 7.3.1。 - 彻底混合并留出 800 mL 的 1x SDS 运行缓冲液，用于凝胶盒的下（外）缓冲室。
- 电泳前，在 200 mL 的 1x SDS 运行缓冲液中加入 500 μL 的抗氧化缓冲液，用于凝胶盒的上（内）缓冲室。
- 根据制造商的协议，通过设置 3-8% 三丝醋酸凝胶来准备凝胶电泳。将每个样品的 20 μL 加载到凝胶上。
- 在 150 V 下执行电泳 75 分钟。
- 电泳后，将凝胶直接放入含有 50 mL 荧光凝胶染色溶液的清洁托盘中。
- 盖住托盘，放在摇摇器上，搅拌时不要溅液体或损坏凝胶 90 分钟。
- 在荧光系统中用 312 nm 照明进行成像之前，使用溴化乙基排放过滤器将凝胶转移到水中，以检测荧光。
- 根据使用已知浓度的正常控制lysate构建的分析曲线测量患者样本的浓度。
- 用于西印迹的 SDS-PAGE
- 按照步骤 7.2.4-7.2.6 准备凝胶盒。
- 根据步骤7.2.11获得的浓度测量，健康控制利盐的每车道负载100μg，患者样本每通道300μg。使用与步骤 7.2.7 相同的设置的电泳。
- 蛋白质转移
- 准备传输缓冲区。将PVDF膜浸泡在甲醇中20 s。将它移动到印迹缓冲区 B，直到使用。
- 将超厚的印迹纸浸泡在印迹缓冲器 A、B 和 C 中至少 30 分钟。
- 电泳后，将凝胶浸泡在印迹缓冲液B中5分钟。
- 根据图 1 中的图，将印迹纸、PVDF 膜和凝胶放在半干转 印机上。用滚筒在凝胶和膜之间滚出气泡。
- 在 RT 时以 2 mA/cm2 膜传输 1 小时。
注：转移后，建议进行与庞塞奥染色类似的总蛋白染色，以确认大分子量蛋白的成功转移。
- 阻塞和抗体染色
- 用 PBST 冲洗膜两次（1x PBS，0.1% Tween 20）。
- 将膜放在1%的阻滞剂中，在RT处轻轻摇动1小时以阻挡。
- 在阻断溶液（1：125）和抗光谱抗体（1：25，000）中用抗肌营养不良素抗体孵育膜，在RT下孵育1小时，或在4°C下过夜。
- 用RT的PBST清洗膜三次，每次10分钟。
- 在PBST（1：100）中用马萝卜过氧化物酶（HRP）结合的二次抗小鼠/兔子抗体孵育膜，在RT下孵育40分钟。
- 用RT的PBST再次清洗膜三次10分钟。
- 检测
- 以 1：1 的比例混合检测解决方案 A 和 B。所需的检测试剂的最终体积为0.1 mL/cm2 膜。
- 从洗涤膜上去除多余的 PBST，并将其与蛋白质侧放在塑料包装片或其他合适的清洁表面上。将混合检测试剂加入膜，在RT下孵育5分钟。
- 通过将膜轻轻握在钳子中并触摸组织边缘，去除多余的检测试剂。
- 将印迹蛋白侧放在样品托盘上。根据用户文档操作荧光系统。设置机器如下。曝光类型：增量、间隔时间：10秒、灵敏度/分辨率：高。
注：测量区域用蓝色矩形装箱（图4a-b）： BG： 背景;D： 肌营养不良素 427 kDa， SL： 光谱素β长等同形 （274 kDa）;SS：短等形（253 kDa）。消化不良/光谱信号比计算为（D-BG）/+（SL-BG）=（SS-BG）=。正常控制比率设置为 100%。
Representative Results
若要使用 RT-PCR 来检测 exon 跳过，将设计和评估将跳过的 exon 两侧的底像仅生成特定波段（有关 exon 跳过和底像位置的示意图，请参阅图2）。如果 MCE 不可用，底向器应生成可按 MCE 系统尺寸或普通 agarose 凝胶电泳来区分的产品。图 3a显示了 MCE 系统 RT-PCR 反应的凝胶图像以及患者 NS-03 和 NS-07 在剂量升级阶段 1 试验中使用 NS-065/NCNP-01 治疗前和之后跳过带的测序结果。NS-03 和 NS-07 港湾删除分别跨越 exons 45-52 和 48-52。NS-03每周接受5毫克/千克和NS-07 20毫克/千克的NS-065/NCNP-01，每周12周。正如治疗前所预料的，两个患者都没有表现出跳过，只有一个非跳过带可以可视化。经过12周的治疗，NS-07的清晰跳过的下带被可视化。然而，仍然难以检测任何跳过的产品为患者NS-03。测序结果显示，NS-07的外显子47和54与NS-03的外显子44和54串联。根据序列，这些理论上可以产生功能性但缩短的肌营养不良素等同形式。要计算图3b 所示的跳过百分比，跳过带的摩尔浓度除以跳过带和未跳过带。对于患者NS-07，治疗后百分比为72%，NS-03为3.4%。来自患者 NS-03、NS-07 和健康对照的西部印迹数据（三重），如图4a 所示。预计，在治疗前未检测到肌营养不良素带。治疗后，检测到患者NS-07的带状物与健康控制相比分子量较低（野生型肌营养不良素的分子量为427 kDa，NS-07肌营养不良素的分子量为389 kDa）。由于外向删除和跳过，从患者NS-07的肌营养不良素等异形缺乏几个exon，它预计将有一个较低的分子量。患者NS-03治疗后未发现可检测的营养不良素水平。在图4bb中，与患者NS-07的健康对照相比，营养不良素的量。测量信号强度以计算肌营养不良素恢复的位置用蓝色方块表示。与健康对照组相比，用肌营养不良素的光谱比计算了肌营养不良素的量。为此，来自肌营养不良素减去背景的信号除以两个光谱等式等构体（长和短）减去背景的总和（见步骤8.6.5）。健康控制的比例设置为 100%。与患者NS-07治疗后的健康控制相比，肌营养不良素的量为9.1%。然而，由于弱的肌营养不良素带，无法计算患者的NS-03百分比，这类似于为两名患者的先前治疗样本获得的百分比。
图1：用于西部印迹分析的传输堆栈的示意图。 在底部浸透印迹缓冲液 A 中的西印迹转移堆栈组装，然后将印迹纸浸泡在印迹缓冲液 B、PVDF 膜、3-8% 三叶酸酯凝胶和浸泡在印迹缓冲液 C 中的 2 个印迹纸中。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在DMD基因中，exon 45-52缺失的患者中 exon 53 的 exon 跳过的架构 绘制。 例如，患者NS-03在剂量升级临床试验有这种删除。如果保留 exon 53，则 mRNA 将退出帧，因为 exon 44 和 53 之间的 exon-exon 交汇点会中断读取帧，从而在 exon 53 中导致停止 codon。当跳过 exon 53 时，将恢复读取帧，并生成更短的肌营养不良素等构形式。要检测 RT-PCR 的 exon 53 跳过，使用 exon 44 和 54 中的底像，以便轻松检测跳过和未跳过 mRNA 之间的 PCR 产品。FWD： 前底图， REV： 反向底面， PMO： 磷酰胺形态寡聚物。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：从头骨前肌肉活检样本中跳过患者NS-03和NS-07的效率。a） 电泳系统生成的凝胶图像，该图像包括未经处理和治疗的患者NS-03和NS-07的RT-PCR样本。上面板以三次三面显示 NS-03 和下面板 NS-07。对于 NS-03，未跳过的频带为 422 bp，跳过的频段为 212 bp。对于 NS-07，波段分别是 836 bp 和 624 bp。序列分析显示，NS-03 的 exon 44 和 exon 54 与 NS-07 的 exon 54 串联在一起。b）治疗前和治疗后跳过效率显示为患者NS-03和NS-07，根据系统 A 提供的两个波段的摩尔浓度计算为跳过带/（跳过带 + 未跳过带） x 100。NS-03治疗后跳过效率非常低;对于 NS-07，跳过效率超过 70%。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：在外向逃前和之后对肌病素等异形的蛋白质定量。a） 在 exon 跳过治疗之前和之后对肌营养不良素异构蛋白的蛋白质定量。从患者NS-03和NS-07治疗前的肌肉活检的西部斑点，以及三重健康控制。在427kDa上可以看到肌张丁条，用于健康控制，在389kDa上可以看到NS-07治疗后。治疗前不能为任何患者检测到营养不良素，或者对患者NS-03进行治疗后也检测出任何营养不良素。黑匣子中的区域如图4b所示。在每个印迹的左侧显示标记。b）患者NS-07治疗后恢复的肌营养不良素量。根据公式计算 Dystrophin 恢复基于肌营养不良素、背景和光谱的长和短等同形波段的强度计算，公式为：（肌营养不良素 - 背景）/（光谱 L - 背景） = （光谱 S - 背景），其中健康控制的比例设置为 100%。每个波段的强度在图中显示的蓝色框内测量。NS-07的肌营养不良素恢复率为9.1%。肌营养不良信号太弱，无法测量未经处理的样品。标记大小以千达吨表示。Dys： 肌萎缩素， Bg： 背景， Sl： Spectrin 长等同形式， SS： Spectrin 短等构形式， 我的： 肌素类型 1。标记大小以千达吨表示。请单击此处查看此图的较大版本。
| 解决 方案 | 体积/反应 （μl） | 最终浓度 |
| 无 RNase 水（提供） | 变量 | - |
| 5x QIAGEN 一步 RT-PCR 缓冲器 | 5.0 | 1x |
| dNTP 混合（包含每个 dNTP 的 10 mM） | 1.0 | 每个 dNTP 的 400 μM |
| 前向底图 （10 μM） | 1.5 | 0.6 μM |
| 反向底图 （10 μM） | 1.5 | 0.6 μM |
| QIAGEN 一步 RT-PCR 酶混合 | 1.0 | - |
| RNase 抑制剂（可选） | 变量 | 5~10个单位/反应 |
| 模板RNA | 50纳克 | |
| 总 | 25 |
表1：RT-PCR试剂。 RT-PCR 一次反应所需的化合物。
| 底漆 | 序列 |
| 44F | 5'-CCTGAGAGCATGC-3' |
| 46F | 5'-AACCTGGAGGCAA-3' |
| 48F | 5'-CCAAGAGACATGG-3' |
| 54/55R | 5'-TTCTCTCACTCCCCT-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTATCAT-3' |
表2：底图列表。 本研究中使用的底项的序列。F：向前，R：反向。
| 1 周期 | 逆转录 | 30分钟 | 50 °C |
| 1 周期 | 初始 PCR 激活步骤 | 15 分钟 | 95 °C |
| 35 周期 | 变性 | 1 分钟 | 94 °C |
| 退火 | 1 分钟 | 60 °C | |
| 扩展 | 1 分钟 | 72 °C | |
| 1 周期 | 最终延期 | 7 分钟 | 72 °C |
| 保持 | ∞ | 4 °C |
表3：使用PCR条件。 显示 RT-PCR 反应的 PCR 条件。
| 解决 方案 | 体积/反应 （μl） |
| 无 RNase 水 | 变量 |
| Bigdye 终结者 3.1 就绪反应混合 | 3.5 |
| 前进底图/反向底图 （3.2 μM） | 2.0 |
| 模板RNA | 20 纳克 |
| 总 | 20 |
表4：测序反应所需的试剂。 在设置中使用"向前"或"反向"底因为，而不是同时使用两者。
| 1 周期 | 1 分钟 | 96 °C |
| 25 周期 | 10 s | 96 °C |
| 5 s | 50 °C | |
| 4 分钟 | 60 °C | |
| 保持 | ∞ | 4 °C |
表5：桑格测序的PCR条件。
Discussion
DMD 的临床试验在上些年取得了成功和失败。RT-PCR 和西方印迹都是用于评估给患者施用的 exon 跳过化合物产生的跳过效率的常见技术。然而，据报道，与数字PCR15相比，RT-PCR高估了跳过效率。尽管这是由于许多原因造成的，但这主要是由于 PCR 周期中较小跳过的片段的更高效放大。与西方印迹估计的蛋白质表达相比，这次临床试验中使用的RT-PCR似乎也产生了更高的跳过效率。根据FDA，这是一个更可靠的方法量化肌营养不良素恢复12。因此，在解释RT-PCR跳过结果时应谨慎行事;然而，样品仍然可以比较。在西方印迹分析中，显示更高跳过效率的样本通常可提高蛋白质表达水平。
由于 DMD 临床试验中的所有患者没有相同的删除模式，因此很难设计出足够特定的底器和探针，以便在所有样品上执行数字或 qPCR。因此，RT-PCR 仍然是首次评估跳过效率的一个很好的替代方案。在NS-065/NCNP-01的临床试验开始之前，评估每个患者体外跳过效率是乏味的，因为肌肉或皮肤活检是强制性的，以产生患者特异性肌细胞。然而，我们最近出版了一种新的技术，以产生患者特定的 MYOD1 转换，尿液衍生细胞 （UDC） 作为一个新的 DMD 肌肉细胞模型16。因此，只需要从患者那里收集的尿液才能产生肌细胞，并且不需要侵入性手术。我们相信，这种方法可用于筛选患者特异性细胞中不同的 AON。此外，在患者开始任何临床试验之前，可以测试不同的底剂和探针。这可以帮助在未来的DMD临床试验中使用qPCR或数字PCR进行外向跳过测量。
在本次临床试验中，用于进行西印分析，使用单一的抗肌营养不良素抗体，仅使用一种健康对照作为参考样本。因此，抗体的特异性没有得到适当的验证。这一点，加上抗体只识别肌营养不良素的C-终端域，是协议的一个限制。今后，建议对针对肌营养不良素分子不同领域的进行更健康的对控和抗体。
在这里，我们总结了最近由探索性调查员发起的NS-065/NCNP-01人类试验中使用的协议。NS-065/NCNP-01 可能适用于 10.1% 的 DMD 患者。
Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢斋藤高桥博士、长田泰子博士、佐藤山正夫博士和田中博士进行科学讨论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
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