여기서, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 38 발현의 분자 특성화를 제시합니다.
Duchenne 근 이영양증 (DMD)은 근육 질량의 점진적 인 손실을 일으키는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망으로 이어집니다. 돌연변이는 수시로 dystrophin 단백질의 거의 총 부족귀착되는 왜곡된 독서 프레임 및 조기 정지 코돈귀착됩니다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기를 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있다. 모르폴리노 AON viltolarsen (코드 이름: NS-065/NCNP-01)는 엑슨 53 건너뛰기를 유도하여 엑슨 52 삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하는 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 NS-065/NCNP-01의 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 DMD 환자에게 정맥으로 관리했습니다. 이 방법 문서에서는, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 발현의 분자 특성화를 제시합니다. dystrophin 발현의 특성화는 기능성 결과 시험이 수행되지 않았기 때문에 효능을 보여주는 연구에서 기본이었습니다.
두첸 근이영양증(DMD)은 근육량, 호흡부전 및 심근병증의 점진적 손실을 유발하는 퇴행성 근육 질환으로 조기 사망1을이끈다. 이 질병은 큰 구조 근육 단백질 디스트로핀2의부족에 의해 발생합니다. X 염색체에 DMD 유전자에 있는 돌연변이는 열적이고, 질병은 3500-5000의 새로운 태어난 남성3,,4,,5에있는 1에 영향을 미칩니다. 돌연변이는 종종 엑소톤 44와 55 사이의 핫스팟 영역에서 큰 삭제로 인해 왜곡된 판독 프레임과 조기 정지 코돈으로 이어지며, 이는 말도 안되는 매개 부패와 거의 총 결여된 디스트로핀 단백질6,,7,,8을유발한다. 판독 프레임은 엑슨 건너뛰기및 판독 프레임을 복원유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(AONs)를 사용하여 교정할 수 있으며, 부분적으로 디스트로핀 발현을 복원하고 질병 진행을지연9,,10,,11. 최근 연방약국(FDA)의 승인을 받은 모르폴리노 AON eteplirsen은 엑슨 51의 건너뛰기를 유도하고, 엑슨 52절,,13을가진 환자에서 판독 프레임을 복원할 수 있다.12 그러나, 엑슨(53)은 엑슨 52삭제를 가진 환자를 위한 판독 프레임을 복원하고, 잠재적으로 DMD 환자14의약 10%를 치료할 수 있다. 모폴리노 AON 약물 NS-065/NCNP-01은 인간 세포에서 엑슨 53 건너뛰기를 유도하는 것으로 나타났다. 그리고 우리는 최근 1상 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험 (이하 “연구”로 지칭) (UMIN으로 등록 된 1 단계 오픈 라벨 용량 에스컬레이션 임상 시험에서 DMD 환자에게 NS-065 /NCNP-01을 투여하였다: 000010964 및 ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. 연구 결과는 서쪽 블로팅에 근거를 둔 RT-PCR 및 dystrophin 단백질 수준에 근거를 둔 엑슨 53 건너뛰기의 복용량 의존적인 증가를 보여주었습니다, 아니 가혹한 불리한 약 사건 또는 중퇴는 관찰되지 않았습니다14.
모든 임상 시험에서, 결과의 분석은 가장 중요 합니다. DMD 임상 시험에 대 한, 논쟁은 여전히 치료 혜택을 보여주는 최고의 방법에 관한 진행. 6 분 도보 테스트와 같은 임상 테스트에는 특정 단점이 있습니다. dystrophin 발현의 분자 특성화는 RT-PCR, qPCR, 디지털 PCR, 서부 블로팅 및 면역 작용과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 임상 혜택을 부여 하는 데 필요한 단백질 발현 복원의 정도 불분명 남아. 본 방법 문서에서는, AON 건너뛰기 약물 NS-065/NCNP-0114의1상 시험에서 각각 엑슨 건너뛰기 및 단백질 수준을 결정하는 데 사용되는 RT-PCR 및 서부 블로팅 방법을 자세히 설명한다.
DMD의 임상 시험은 지난 몇 년 동안 성공과 실패를 모두 생산했습니다. RT-PCR과 서부 블로팅은 환자에게 투여되는 엑슨 건너뛰는 화합물에 의해 생성된 건너뛰는 효율을 평가하는 일반적인 기술이다. 그러나 RT-PCR은 디지털 PCR15에비해 건너뛰는 효율을 과대 평가한 것으로 보고되었다. 이것은 여러 가지 이유로 인해 발생하지만, 주로 PCR 주기 동안 작은 건너 뛴 조각의 보다 효율적인 증폭에 의해 발생합니다. 이 임상 시험에 사용된 RT-PCR도 서양 블로팅에 의해 추정된 단백질 발현에 비해 더 높은 건너뛰는 효율성을 생성한 것으로 보인다. FDA에 따르면, 이것은 dystrophin 복원을 정량화하는 더 신뢰할 수있는 방법입니다12. 따라서 RT-PCR 건너뛰기 결과를 해석할 때주의해야 합니다. 그러나 샘플은 여전히 비교할 수 있습니다. RT-PCR 결과에 근거를 둔 더 높은 건너뛰는 효율성을 보여주는 견본은 일반적으로 서쪽 blot 분석에서 더 높은 단백질 발현 수준을 exhbit.
DMD 임상 시험에 있는 모든 환자는 동일 삭제 패턴을 가지고 있지 않기 때문에, 모든 견본에 디지털 또는 qPCR를 능력을 발휘하기 위하여 적당하게 특정한 프라이머 및 프로브를 디자인하기 어려울 수 있습니다. 따라서 RT-PCR은 여전히 건너뛰는 효율성에 대한 첫 번째 평가를 위한 좋은 대안입니다. NS-065/NCNP-01의 임상 시험이 시작되기 전에 근육이나 피부 생검이 환자 별 근막을 생성하는 것이 필수적이었기 때문에 체외내의 각 환자에 대한 건너뛰는 효율을 평가하는 것은 지루했습니다. 그러나, 최근에는 새로운 DMD 근육세포모델로서환자특이적 MYOD1 변환, 소변 유래 세포(UDCs)를 생성하는 새로운 기술을 최근에 발표했다. 따라서, 환자로부터 수집된 소변만 근막을 생성하기 위해 필요하며, 침습적 절차가 필요하지 않다. 우리는 이 방법이 환자 특정 세포에 있는 다른 AON을 스크린하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 믿습니다. 더욱이, 환자가 어떤 임상 시험을 시작하기 전에 다른 프라이머와 프로브는 시험될 수 있습니다. 이를 통해 향후 DMD 임상 시험에서 엑슨 건너뛰기 측정을 위한 qPCR 또는 디지털 PCR사용을 용이하게 할 수 있다.
이 임상 시험에서 서양 얼룩 분석을 수행하기 위해, dystrophin에 대하여 단 하나 항체가 이용되고, 단지 하나의 건강한 통제가 참조 견본으로 이용되었습니다. 따라서, 항체의 특이성은 적절히 검증되지 않았다. 이것은, 항체가 dystrophin의 C-말단 도메인을 인식한다는 사실과 더불어, 프로토콜의 한계입니다. dystrophin 분자의 다른 도메인에 대하여 더 건강한 통제 및 항체는 미래에 추천합니다.
여기에서, 우리는 NS-065/NCNP-01의 최근 탐사 조사자 개시, 첫번째 인간 예심에서 사용된 프로토콜을 요약했습니다. NS-065/NCNP-01은 DMD 환자의 10.1%에 잠재적으로 적용될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
사이토 다카시 박사, 나가타 데츠야 박사, 마스다 사토시, 다케시타 에리 박사님의 과학적 토론에 감사드립니다.
100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
EzBlot | Atto | AE-1460 | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
SDS | Nacalai | 31606-75 | |
Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Urea | Nacalai | 35907-15 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |