Summary
هنا، نقدم التوصيف الجزيئي لdytrophin 38 التعبير باستخدام تسلسل سانجر، RT-PCR، وغرب النشاف في التجارب السريرية.
Abstract
دوشين ضمور العضلات (DMD) هو مرض العضلات التنكسية التي تسبب فقدان تدريجي للكتلة العضلية, مما يؤدي إلى الوفاة المبكرة. الطفرات غالبا ما تسبب إطار القراءة مشوهة وcodons وقف سابق لأوانه، مما أدى إلى نقص شبه كامل من بروتين ديستروفين. ويمكن تصحيح إطار القراءة باستخدام oligonucleotides المضادة للsense (AONs) التي تحفز exon تخطي. وقد ثبت أن موربولينو AON viltolarsen (الاسم الرمزي: NS-065/NCNP-01) للحث على exon 53 تخطي، واستعادة إطار القراءة للمرضى الذين يعانون من الحذف إكسون 52. لقد قمنا مؤخرًا بإدارة NS-065/NCNP-01 عن طريق الوريد لمرضى DMD في تجربة استكشافية بدأها المحقق، وأول تجربة في الإنسان من NS-065/NCNP-01. في هذه المقالة الأساليب، نقدم التوصيف الجزيئي للتعبير ديستروفين باستخدام تسلسل سانجر، RT-PCR، وغرب النشاف في التجارب السريرية. كان توصيف تعبير الديستروفين أساسيًا في الدراسة لإظهار الفعالية حيث لم يتم إجراء اختبارات نتائج وظيفية.
Introduction
دوشين ضمور العضلات (DMD) هو مرض العضلات التنكسية مما تسبب في فقدان تدريجي للكتلة العضلية, فشل في الجهاز التنفسي, واعتلال عضلة القلب, ويؤدي إلى الوفاة المبكرة1. ويتسبب هذا المرض بسبب عدم وجود العضلات الهيكلية الكبيرة ديستروفين بروتين2. الطفرات في الجين DMD على الكروموسوم X هي المتنحية، ويؤثر المرض 1 في 3500-5000 الذكور حديثي الولادة3،4،5. الطفرات غالبا ما تكون كبيرة الحذف في منطقة ساخنة بين exons 44 و 55 التي تؤدي إلى إطار القراءة مشوهة وcodons وقف سابق لأوانه، مما تسبب في تسوس هراء بوساطة ونقص كامل تقريبا من بروتين ديستروفين6,7,8. يمكن تصحيح إطار القراءة باستخدام oligonucleotides antisense (AONs) التي تحفز exon تخطي واستعادة إطار القراءة، واستعادة جزئيا التعبير ديستروفين وتأخير تطور المرض9،10،11. وmorpholino AON eteplirsen, الذي تمت الموافقة عليه مؤخرا من قبل وكالة المخدرات الاتحادية (FDA), يدفع تخطي إكسون 51 ويمكن استعادة إطار القراءة في المرضى الذين يعانون من exon 52 الحذف12,13. ومع ذلك، exon 53 تخطي يعيد إطار القراءة للمرضى الذين يعانون من exon 52 الحذف، وأنه يمكن أن يحتمل أن علاج ما يقرب من 10٪ من المرضى DMD14. وقد تبين أن المخدرات morpholino AON NS-065/NCNP-01 للحث على exon 53 تخطي في الخلايا البشرية، ونحن مؤخرا تدار NS-065/NCNP-01 لمرضى DMD في المرحلة 1 مفتوحة التسمية جرعة التصعيد التجارب السريرية (المشار إليها فيما يلي باسم "الدراسة") (مسجلة باسم UMIN: 000010964 و ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. وأظهرت الدراسة زيادة تعتمد على الجرعة من exon 53 تخطي على أساس RT-PCR ومستويات البروتين ديستروفين على أساس النشاف الغربية، ولم يلاحظ أي أحداث المخدرات الضارة الشديدة أو التسرب14.
في جميع التجارب السريرية، وتحليل النتائج هي ذات أهمية قصوى. بالنسبة للتجارب السريرية DMD، لا يزال النقاش مستمرا بشأن أفضل طريقة لإظهار فائدة العلاج. الاختبارات السريرية مثل اختبار المشي لمدة 6 دقائق لها بعض العيوب. يمكن إجراء التوصيف الجزيئي للتعبير ديستروفين باستخدام عدة طرق، مثل RT-PCR، qPCR، الرقمية-PCR، النشاف الغربية، والكيمياء المناعية. ومع ذلك، فإن مدى استعادة التعبير البروتيني المطلوب لنقل فائدة سريرية لا يزال غير واضح. في هذه المقالة الأساليب، ونحن وصف بالتفصيل RT-PCR والغربية أساليب النشاف المستخدمة لتحديد تخطي exon ومستويات البروتين، على التوالي، في المرحلة 1 محاكمة AON تخطي المخدرات NS-065/NCNP-0114.
Protocol
وقد وافقت اللجنة الأخلاقية التابعة للمجلس الوطني للشرطة الوطنية على الإجراء التنفيذي للمحاكمة التي بدأها المحققون (رقم الاعتماد: A2013-019).
1. إعداد عينات العضلات
ملاحظة: غالبًا ما يتم اختيار عضلات العضلة ذات الرأسين أو عضلات الزفير الرباعية كمواقع خزعة. ومع ذلك، تم استخدام الـ"تيبياليس" الأمامي في التجربة السريرية.
-
خزعة العضلات من المرضى
- وضع علامة على موقع الشق قبل إعداد الجلد.
- إعداد الشاش المبلل المثبطة لعيّنة الخزعة. الضغط على الشاش جيدا.
- حقن التخدير الموضعي في الجلد والأنسجة تحت الجلد، ولكن ليس في العضلات. تأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود ألم اَن.
ملاحظة: التخدير العام يستخدم عادة في المرضى الأطفال الذين تقل أعمارهم عن 15 سنة. - إجراء شق من الجلد إلى الأنسجة تحت الجلد. استخدم اِلَاَلَسَات صغيرة لفتح الشق وفصل الدهون تحت الجلد.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن قطع جزء من الجلد لثقافة الخلايا الليفية. - جعل شق صغير آخر في اللفافة وقطع اللفافة كذلك. المشبك الحواف باستخدام ملقط البعوض لفضح العضلات.
- استخدام خياطة لسحب ما يصل الجزء المحدد من العضلات. جعل نفق صغير باستخدام مقص إيريس وإدراج ملقط البعوض في النفق.
- فصل حزمة العضلات باستخدام ملقط وقطع طرفي الجزء المستهدف.
ملاحظة: يجب أن تكون عينات خزعة العضلات حول حجم قلم رصاص للمرضى البالغين (الطول 1.0-1.5 سم، قطر 0.8-1.0 سم). يجب أن يكون طول العينة حوالي 1 سم وقطرها 5 ملم في الأطفال المرضى. - لف العينة في شاش مبللة بالملوحة ونقل العضلات الطازجة في درجة حرارة الغرفة (RT) على الفور إلى منشأة حيث يمكن إعداد العينة لمزيد من التحليل.
ملاحظة: ينبغي نقل العينات عند 4 درجات مئوية إذا تجاوزت مدة النقل ساعة واحدة.
2. إعداد عينة العضلات
- مزيج وحدات متساوية من العلكة والمياه tragacanth حتى يصبح اللثة لينة ولزجة. تحميل الخليط في الحقن 25 مل. يمكن تخزين المحاقن في الثلاجة.
- ضع حوالي 0.5 إلى 1 سم من علكة تراجكاناث على أقراص الفلين. تسمية الأقراص على الجانب الآخر.
- وضع حاوية من ال isopentane في النيتروجين السائل حتى يتجمد بعض السائل.
- ضع العينة في علكة تراغاكارث. يجب أن يكون المحور الطولي لكل عضلة عموديًا على الفلين. ضع العلكة حول الجزء السفلي من كل عضلة للمساعدة في وضع مناسب.
- باستخدام ملاقط، ضع عينة العضلات/الفلين في إيسوبينتان الباردة المعدة في الخطوة 2.3 لتجميد. نقل العينة باستمرار لمدة 1 دقيقة أو حتى المجمدة تماما، ووضعها على الجليد الجاف مؤقتا.
- ضع العينة في قارورة زجاجية واخزنها عند -80 درجة مئوية.
3. العضلات القطاعات
- إعداد التبريد للقطع مع درجة حرارة العمل من -25 درجة مئوية.
- جبل الفلين / كتلة العضلات وتقليم حتى يتم تحقيق أقسام مسطحة.
- استخدام سمك قسم من 10 μm لRT-PCR وغرب النشاف. استخدام سمك 6-8 ميكرومتر و 10-12 ميكرومتر للكيمياء المناعية أو هاماتوكسيلين و إيوسين، على التوالي. وضع شرائح أقسام في أنابيب 2.0 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية لRT-PCR وغرب النشاف.
4. RNA استخراج وعكس النسخ البوليمرات سلسلة التفاعل (RT-PCR)
- استخراج ما يقرب من 10 شرائح مع 10 μm سمك من العضلات المجمدة عن طريق التبريد. جمع RNA مجموع تنقية باستخدام مجموعة تنقية من الجيش الملكي النيبالي الكلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف.
- الجمع بين الكواشف المطلوبة لتفاعل RT-PCR في أنابيب PCR وفقا للجدول 1. انظر الجدول 2 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي.
ملاحظة: كان التمهيدي الأمامي 44F للمريض NS-03 و 46F للمريض NS-07. وكان التمهيدي العكسي 54/55R كإعداد افتراضي. وإذا كانت المنتجات غير المحددة واضحة، فقد استخدم 54R كبديل. - ضع أنابيب PCR التي تحتوي على الخليط في دورة حرارية. تشغيل دورة الحرارة وفقا للجدول 3.
- تخزين المنتج PCR في 4 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
5. microchip electrophoresis و exon تخطي الحساب
ملاحظة: غالباً ما يتم تحديد نظام electrophoresis (MCE) رقاقة لتحليل exon تخطي الكفاءة. في هذا البروتوكول، ونحن وصف الخطوات اللازمة لتحليل exon تخطي الكفاءة باستخدام نظام MCE من قبل الشركة المصنعة A وكذلك من الشركة المصنعة B، فيما يلي دعا النظام A و B. خلال التجربة السريرية، تم تحليل exon تخطي الكفاءة على النظام A. ومع ذلك، لم يعد النظام A للبيع، ونحن نوصي النظام ب لتحليل exon تخطي الكفاءة. وقد أدرجنا بروتوكولات لكلا النظامين (انظر القسم 5-1 للنظام ألف و 5-2 للنظام باء). انظر جدول المواد للحصول على معلومات بشأن النظام ألف وباء. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذه الخطوة مع جل agarose العادية electrophoresis، ولكن الحساسية يقلل بشكل ملحوظ.
- ميكروشيب الكهربائية باستخدام النظام A
ملاحظة: يحتوي النظام A على نوعين من الرقائق. هنا، نحن وصف الخطوات لرقاقة الحمض النووي.- أكواشف مجموعة اكويسير (بقعة العازلة، تحميل العازلة، سلم، وجل العازلة) إلى RT، دوامة، وتدور إلى أسفل.
- لإعداد العازلة جل stain (GS)، إضافة 12.5 ميكرولتر من العازلة وصمة عار إلى 250 ميكرولتر من العازلة هلام ودوامة لمدة 10 ق. نقل الحل إلى أنبوب فلتر تدور والطرد المركزي في 2400 س ز لمدة 15 دقيقة. تجاهل عامل التصفية.
ملاحظة: يمكن تخزين GS المصفاة في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد. - إذا كانت العينات مركزة للغاية، يتم تخفيفها إلى حوالي 50 نانوغرام/ميكرولتر مع عازلة TE أو مياه خالية من الـ DNase.
ملاحظة: إذا كانت العينات في تركيز الملح ≥ 200 mM KCl (أو NaCl) و / أو 15 mM MgCl2، تبادل المخزن المؤقت. - إضافة 12 ميكرولتر من حل GS إلى هلام فتيلة جيدا (أبرز ووسمها GS) من رقاقة الحمض النووي ووضع رقاقة في محطة فتيلة.
ملاحظة: لتجنب فقاعات الهواء، أدخل طرف الماصات عموديا وإلى الجزء السفلي من البئر عند الاستغناء. الاستغناء ببطء إلى المحطة الأولى على الماصات، ولا تطرد الهواء في نهاية خطوة الأنابيب. - حدد وضع C3 واضغط على الزر ابدأ. بعد الانتهاء من فتيلة، وإزالة رقاقة.
- فحص بصريا القنوات الصغيرة لفقاعات الهواء المحاصرين أو فتيلة غير مكتملة.
- تحميل العينات المعدة وسلم على رقاقة على النحو التالي.
- مايليت 9 ميكرولتر من GS حل في 3 GS أخرى الآبار.
- Pipette 5 ميكرولتر من العازلة التحميل في بئر L وكل عينة جيدا (1-11).
- ماصة 1 ميكرولتر من سلم في بئر L.
- ماصة 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي في كل من 11 عينة الآبار.
- ماصة 1 μL من المياه TE أو DNase خالية من المياه في أي آبار غير مستخدمة. دليل سريع مجموعة يظهر شكل من تخطيط رقاقة.
ملاحظة: فحص جميع الآبار بحثاً عن فقاعات الهواء عن طريق الضغط على الرقاقة فوق خلفية ملونة طفيفة. طرد أي فقاعات الهواء المحاصرين في الجزء السفلي من بئر مع طرف ماصة نظيفة أو عن طريق إزالة وإعادة تحميل الحل.
- ضع الرقاقة في محطة الدوامة واضغط على Mix. تتوقف محطة الدوامة تلقائيا بعد 1 دقيقة.
- تشغيل رقاقة في محطة الكهرباء في غضون 5 دقيقة من التحميل.
- حدد تشغيل جديد في شريط أدوات البرامج. على شاشة التشغيل الجديد، حدد الحمض النووي والحمض النووي 1K من قائمة سحب المقايسة.
- إما تحديد مجلد مشروع للتشغيل من القائمة المنسدلة المشروع أو إنشاء مجلد مشروع جديد عن طريق إدخال اسم في حقل المشروع.
- أدخل اسمًا للتشغيل في الحقل تشغيل البادئة وانقر فوق تشغيل ابدأ.
- ينبّه الجهاز عند اكتمال التحليل، ويفتح نافذة تشير إلى نهاية الشوط. حدد موافق وإزالة رقاقة من منصة رقاقة.
- حدد الملف | تصدير البيانات لتصدير البيانات. حدد الخيارات المطلوبة في حوار التصدير.
- لتنظيف الأقطاب الكهربائية، تعبئة رقاقة تنظيف مع 800 ميكرولتر من المياه ديوند ووضعها على منصة رقاقة، وإغلاق الغطاء، وتركه مغلقا لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة، افتح الغطاء، وأزل رقاقة التنظيف، واسمح للأقطاب الكهربائية بالجفاف لمدة دقيقة.
- رقاقة الكهربائية باستخدام النظام B
- افتح برنامج التشغيل وأدخل معلومات العينة. بعد إدخال المعلومات، يقوم البرنامج بحساب مقدار الفاصل بين حلول المخزن المؤقت وعلامة تلقائيا.
- إعداد الكمية الضرورية من الفاصل العازلة التي يتم حسابها من قبل البرنامج. أولا، إعداد 100x حمض نووي هلام حل وصمة عار عن طريق تخفيف 10،000 × حل مع كمية مناسبة من المخزن المؤقت TE. يمكن تخزين الحل 100x في -20 درجة مئوية.
- مزيج كمية مناسبة من 100x الحمض النووي وصمة عار هلام مع العازلةseparation في أنبوب معين المقدمة من قبل الشركة لإعداد حل 1x. دوامة الحل.
- إعداد الكمية المطلوبة من حل علامة في الأنبوب.
- بدء برنامج غسل التحقيق.
- بدء برنامج غسل رقاقة عند الانتهاء.
- في الوقت نفسه، ماصة العينات إلى متعدد البلح PCR (96-جيدا، واضحة) وتمييع 4 مرات مع المياه غير المؤينة. الحد الأدنى لحجم يمكن للآلة التعامل مع 6 ميكرولتر، والحد الأقصى هو 30 ميكرولتر. نقترح حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر (2.5 ميكرولتر من العينة و 7.5 ميكرولتر من الماء / TE-العازلة).
- تغطية لوحات مع لاصقة PCR ختم أوراق احباط spin-down العينات.
- تعيين لوحة، حل علامة، و1x الفاصل العازلة في الجهاز وفقا للموضع الذي يظهره الجهاز. اضغط على زر البدء.
- عند الانتهاء من تشغيل، تصدير البيانات نتيجة كملف .csv من البرنامج وحساب exon تخطي الكفاءة باستخدام تركيز المول كما يلي:
Exon تخطي الكفاءة (٪ = (تخطي الفرقة / (الفرقة تخطي + الفرقة غير تخطي) X 100
6- تسلسل الحمض النووي التكميلي (cDNA)
-
إعداد جل أجاروز
- قياس 1.5 غرام من مسحوق agarose وخلط مسحوق مع 100 مل من 1x TAE العازلة في قارورة microwavable (مما أدى إلى 1.5٪ agarose هلام).
- الميكروويف لمدة 1-3 دقائق حتى يتم حل agarose تماما.
ملاحظة: لا تُلبِل المحلّل، لأنّ بعض من العازلة سيتبخر ويُغيّر النسبة المئوية النهائية لـ agarose من الجل. - دع حل agarose يبرد إلى حوالي 50 درجة مئوية.
- أضف 10 ميكرولتر 10000x صبغة حمض نووي فلوري إلى محلول agarose.
- صب agarose في علبة هلام مع مشط البئر في مكان. يترك في RT لمدة 20-30 دقيقة حتى أنها قد توطدت تماما.
-
التسلسل
- مزيج 5 ميكرولتر من المنتج RT-PCR (من الخطوة 4.4) و 1 ميكرولتر من 6x تحميل العازلة. حملها في آبار هلام agarose 1.5٪.
- تشغيل الجل في 135 V لمدة 5 دقائق و 120 الخامس لمدة 20 دقيقة.
- تصور العصابات باستخدام transilluminator وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- عصابات من المواد من الفائدة من هلام واستخدام هلام وPCR تنظيف عدة لاسترداد المنتجات RT-PCR.
- قياس التركيز باستخدام مقياس الطيف.
ملاحظة: يمكن إرسال الشريط المنقى لتسلسل في شركة أو منشأة التسلسل إذا لم تتوفر معدات تسلسل Sanger في المنزل. - إعداد الكواشف المطلوبة لدورة تسلسل عدة وماصة في لوحة PCR متعدد اللوح وفقا للجدول 4. انظر الجدول 2 للاطلاع على تسلسلات التمهيدي.
- ختم لوحة مع فيلم لاصق واضح.
- دوامة لوحة لمدة 2 إلى 3 s. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح بحيث تستقر محتويات إلى أسفل الآبار (5 إلى 10 s) في 1000 x غم.
ملاحظة: قد تكون فقاعات الهواء موجودة في الآبار، ولكنها لا تؤثر سلبًا على رد الفعل. - ضع الخليط في دورة حرارية وتشغيلها وفقا للجدول 5.
- تنقية ردود الفعل تسلسل مع لوحات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- استخدم محلل الحمض النووي لتحديد التسلسلات وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- قارن التسلسل الذي تم الحصول عليه بالتسلسل المتوقع للمريض.
7. الغربية النشاف
- إعداد العينة
- إعداد المخزن المؤقت عينة SDS (4٪ SDS، 4 M اليوريا، 10٪ 2-mercaptoethanol، 10٪ الجلسرين، 70 mM تريس-HCl pH 6.4، 0.001٪ بروموفينول الأزرق، ومثبطات البروتياز).
- ضع حوالي 100 شريحة من أقسام العضلات 10 ميكرومتر التي تم جمعها من قسم التجمّع في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت SDS.
- التجانس لفترة وجيزة عينات البروتين على الجليد لمدة 30 ق باستخدام المجانسة الصغيرة مفيد.
- جهاز طرد مركزي في 16500 س ز لمدة 15 دقيقة، ونقل فائقة إلى أنبوب جديد. المضي قدما في التحليل أو تخزين في -80 درجة مئوية.
- SDS-PAGE لقياس تركيز البروتين
ملاحظة: تم استخدام وصمة هلام الفلورسنت لتحديد تركيز البروتين.- تحديد وزن العينة السليمة العادية التحكم والتركيز باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- إعداد العينات للالكتروفورس هلام. Pipette 10 ميكروغرام من البروتين الكلي للسيطرة صحية و 5 ميكرولتر من عينات المريض، 5 ميكرولتر من 4x عينة العازلة، 2 ميكرولتر من 10x عينة وكيل الحد. مرة واحدة وقد تم خلط هذه، إضافة المياه الأيونية إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر في كل عينة.
- عينات الحرارة في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- إعداد 2000 مل من 1x SDS تشغيل المخزن المؤقت باستخدام 50 مل من 40x SDS تشغيل المخزن المؤقت. تخفيف مع 1950 مل من المياه ديوند.
ملاحظة: عند هذه النقطة، 1000 مل من المخزن المؤقت قيد التشغيل كافية. يتم استخدام المخزن المؤقت المتبقي 1,000 مل في الخطوة 7.3.1. - تخلط جيدا وتوضع جانبا 800 مل من 1x SDS تشغيل العازلة للاستخدام في الغرفة العازلة السفلي (الخارجي) من مربع هلام.
- مباشرة قبل electrophoresis، إضافة 500 ميكرولتر من العازلة المضادة للأكسدة إلى 200 مل من 1x SDS تشغيل العازلة لاستخدامها في الغرفة العازلة العلوية (الداخلية) من مربع هلام.
- الاستعداد للكهربية هلام عن طريق إعداد 3-8٪ تريس خلات هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تحميل 20 ميكرولتر من كل عينة على هلام.
- قم بإجراء الكهرباء في 150 فولت لمدة 75 دقيقة.
- بعد الكهرباء، ضع الجل مباشرة في صينية نظيفة تحتوي على 50 مل من محلول وصمة هلام الفلورسنت.
- غطي الصينية، وضعها على شاكر، وتهيج دون رش السائل أو إتلاف الجل لمدة 90 دقيقة.
- نقل الجل إلى الماء قبل التصوير في نظام الفلوريسنس في الإضاءة 312 نانومتر مع مرشح انبعاث بروميد الإتيهيدوم للكشف عن الفلور.
- قياس تركيزات العينات المريض على أساس منحنى تحليلي شيدت باستخدام lysate التحكم الطبيعي مع تركيز معروف.
- SDS-PAGE لنشاف الغربية
- إعداد مربع هلام وفقا للخطوات 7.2.4-7.2.6.
- استناداً إلى قياس التركيز الذي تم الحصول عليه في الخطوة 7.2.11، قم بتحميل 100 ميكروغرام لكل حارة من lysate التحكم الصحي و 300 ميكروغرام لكل حارة من عينة المريض. الكهرباء باستخدام نفس الإعدادات كخطوة 7.2.7.
- نقل البروتين
- تحضير المخزن المؤقت للنقل. نقع غشاء PVDF لمدة 20 S في الميثانول. نقله إلى المخزن المؤقت B النشاف حتى الاستخدام.
- نقع ورقة النشاف سميكة في المخزن المؤقت النشاف A، B، وC لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل عازلة.
- بعد electrophoresis، نقع الجل في مخزن النشاف B لمدة 5 دقائق.
- مكان أوراق النشاف، غشاء PVDF، وهلم على آلة نقل شبه الجافة وفقا للرسم في الشكل 1. طرح فقاعات الهواء بين الجل والغشاء مع الأسطوانة.
- نقل في 2 م أ / سم2 غشاء ل 1 ساعة في RT.
ملاحظة: بعد نقل, فمن المستحسن لأداء وصمة عار البروتين الكلي مماثلة لبونساو تلطيخ لتأكيد نقل ناجحة من كبر الوزن الجزيئي البروتينات.
- حظر وتلطيخ الأجسام المضادة
- شطف الغشاء مرتين مع PBST (1X PBS مع 0.1٪ توين 20).
- وضع الغشاء في 1٪ منع وكيل، والصخور بلطف لمدة 1 ساعة في RT لمنع.
- احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة ديستروفين المضادة في محلول منع (1:125) والأجسام المضادة مضادة لأطياف (1:25،000) ل1 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها في 4 °C.
- اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع PBST في RT.
- احتضان الغشاء مع بيروكسيديز الفجل (HRP)-متقارنة الثانوية المضادة الماوس / أرنب في PBST (1:100) لمدة 40 دقيقة في RT.
- غسل الغشاء مرة أخرى ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع PBST في RT.
- الكشف عن
- مزيج حلول الكشف A و B في نسبة 1:1. الحجم النهائي للكشف عن الكاشف المطلوب هو 0.1 مل / سم2 غشاء.
- إزالة PBST الزائدة من الغشاء غسلها ووضعها مع الجانب البروتين حتى على ورقة من البلاستيك أو الأسطح النظيفة المناسبة الأخرى. إضافة كاشف الكشف المختلط على الغشاء واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
- إزالة كاشف الكشف الزائد عن طريق عقد الغشاء بلطف في ملقط ولمس الحافة ضد الأنسجة.
- ضع جانب البروتين في البقعة على صينية عينة. تشغيل نظام الفلورسنت وفقا لوثائق المستخدم. تعيين الجهاز على النحو التالي. نوع التعرض: زيادة، الفاصل الزمني: 10 ق، حساسية / القرار: عالية.
ملاحظة: تم محاصرة المساحات المقاسة بمستطيل أزرق (الشكل 4أ -ب):BG: خلفية؛ D: ديستروفين 427 كيلو Da، SL: أطياف بيتا isoform طويلة (274 كيلوDa)؛ SS: isoform قصيرة (253 كيلوDa). تم حساب نسبة إشارة الديتروفين/المطية على أنها (D-BG)/[SL-BG) + (SS-BG)]. تم تعيين نسبة التحكم العادي كـ 100%.
Representative Results
لاستخدام RT-PCR للكشف عن تخطي exon، تم تصميم التمهيديات على جانبي exon التي سيتم تخطيها وتقييمها لـإدرار نطاقات محددة فقط (انظر الشكل 2 لمخطط تخطيطي لتخطي exon وموضع التمهيدي). وينبغي أن التمهيديات توليد المنتجات التي يمكن بسهولة أن تميز من حيث الحجم على نظام MCE أو الطبيعي agarose هلام electrophoresis إذا MCE غير متوفر. ويبين الشكل 3أ نظام MCE صور هلام من ردود الفعل RT-PCR ونتائج تسلسل الفرقة تخطي من المرضى NS-03 وNS-07 قبل وبعد العلاج مع NS-065/NCNP-01 في المرحلة 1 من مرحلة تصعيد الجرعة. NS-03 و NS-07 الحذف الميناء التي تمتد exons 45-52 و 48-52، على التوالي. NS-03 تلقى 5 ملغ/كغم وNS-07 20 ملغ/كغ من NS-065/NCNP-01 أسبوعياً لمدة 12 أسبوعاً. كما كان متوقعا قبل العلاج، كل من المرضى أظهرت أي تخطي، ويمكن تصور فقط الفرقة غير تخطي. بعد 12 أسبوعا من العلاج، تم تصور شريط أقل تخطي واضح لNS-07. ومع ذلك، كان لا يزال من الصعب الكشف عن أي منتج تخطي للمريض NS-03. وأظهرت نتائج التسلسل سلسلة من exons 47 و 54 لNS-07، فضلا عن exons 44 و 54 لNS-03. وفقا للتسلسل، وهذه يمكن أن تنتج نظريا ايزوفورم ديستروفين وظيفية ولكن تقصير. لحساب نسبة تخطي الموضحة في الشكل 3b،تم تقسيم تركيز المول للقطّقة التي تم تخطيها بواسطة النطاق الذي تم تخطيه و un-تخطيه. بالنسبة للمريض NS-07، كانت النسبة المئوية بعد العلاج 72٪، وكانت 3.4٪ لNS-03. تظهر بيانات البقعة الغربية (في ثلاثية) من المرضى NS-03، NS-07، والسيطرة الصحية في الشكل 4أ. ومن المتوقع، لم يتم الكشف عن أي الفرقة ديستروفين قبل العلاج. بعد العلاج تم الكشف عن عصابة من المريض NS-07 مع وزن جزيئي أقل مقارنة بالتحكم الصحي (ديستروفين نوع البرية لديه وزن جزيئي من 427 كيلو ادا، وNS-07 ديستروفين لديه الوزن الجزيئي من 389 كيلو Da). بسبب الحذف وتخطي، وisoform ديستروفين من المريض NS-07 تفتقر إلى العديد من exons، وكان من المتوقع أن يكون لها وزن جزيئي أقل. وأظهرت المريض NS-03 أي مستويات يمكن الكشف عنها من ديستروفين بعد العلاج. في الشكل 4ب، يظهر مقدار الديستروفين مقارنة بتحكم صحي للمريض NS-07. يشار إلى الموقع حيث تم قياس كثافة الإشارة لحساب استعادة الديستروفين مع المربعات الزرقاء. تم استخدام نسبة لطخات الديستروفين لتحديد كمية الديستروفين مقارنة مع تلك التي من السيطرة الصحية. وتحقيقا لهذه الغاية، تم تقسيم الإشارة من خلفية ناقص ديستروفين على مجموع اثنين من isoforms أطياف (طويلة وقصيرة) ناقص الخلفية (انظر الخطوة 8.6.5). تم تعيين نسبة للسيطرة الصحية إلى 100٪. كمية من الديستروفين مقارنة مع السيطرة الصحية في المريض NS-07 بعد العلاج كان 9.1 ٪. ومع ذلك، لا يمكن حساب النسبة المئوية للمريض NS-03 بسبب ضعف نطاق الديستروفين، والتي مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها لعينات العلاج المسبق لكلا المرضى.
الشكل 1: مخطط تخطيطي لمكدس النقل لتحليل البقعة الغربية. تجميع كومة نقل البقعة الغربية مع ورقة النشاف غارقة في العازلة النشاف A في الجزء السفلي تليها ورقة النشاف غارقة في العازلة النشاف B، غشاء PVDF، ويظهر 3-8٪ تريس-خلات جل وعلى أعلى 2 أوراق النشاف غارقة في العازلة النشاف C. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الرسم التخطيطي لتخطي إكسون 53 في مريض مع exon 45-52 حذف في الجين DMD. على سبيل المثال، المريض NS-03 في التجارب السريرية تصعيد الجرعة كان هذا الحذف. إذا تم الاحتفاظ exon 53، فإن مرنا يكون خارج الإطار منذ تقاطع إكسون إكسون بين إكسون 44 و 53 يعطل إطار القراءة، مما تسبب في وقف كودون في إكسون 53. يتم استعادة إطار القراءة عندما يتم تخطي إكسون 53، ويتم إنتاج isoform أقصر من ديستروفين. للكشف عن exon 53-تخطي من قبل RT-PCR، يتم استخدام التمهيديات في إكسون 44 و 54 بحيث يمكن بسهولة الكشف عن منتج PCR بين مُخطَى و mRNA غير متخطي. FWD: التمهيدي إلى الأمام، REV: التمهيدي العكسي، PMO: phosphorodiamidate مورفولينو oligomer. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تخطي الكفاءة للمرضى NS-03 و NS-07 من عينات خزعة العضلات الأمامية tibialis. أ)صورة هلامية المتولدة عن نظام الكهرباء A من عينات RT-PCR من العينات غير المعالجة والمعالجة من المرضى NS-03 و NS-07. اللوحة العلوية يظهر NS-03 والسفلى NS-07 في ثلاثية. بالنسبة لـ NS-03 ، فإن النطاق غير المتخطي هو 422 bp ، والفرقة التي تم تخطيها هي 212 bp. بالنسبة لـ NS-07 ، تبلغ النطاقات 836 نقطة بريتيش بتروليوم و 624 نقطة بريتيش بتروليوم على التوالي. وأظهر تحليل التسلسل سلسلة من exon 44 و 54 لNS-03 و EXON 47 إلى إكسون 54 لNS-07. ب)يتم عرض تخطي الكفاءة قبل وبعد العلاج للمرضى NS-03 و NS-07، محسوبة من تركيز المول من النطاقين المقدمة من النظام A كما تخطي الفرقة / (تخطي الفرقة + غير تخطي الفرقة) × 100. وكانت كفاءة تخطي NS-03 منخفضة جدا بعد العلاج؛ بالنسبة لـ NS-07، كانت كفاءة تخطي أكثر من 70%." الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: كم البروتين من ايزوفورمات دايستروفين قبل وبعد تخطي العلاج. أ)كم البروتين من ايزوفورمات ديستروفين قبل وبعد exon تخطي العلاج. لطخة غربية من خزعة العضلات من tibialis الأمامي من المرضى NS-03 و NS-07 قبل وبعد العلاج ومن السيطرة الصحية في ثلاثية. ويمكن رؤية دستروفين في 427 كيلو Da للسيطرة الصحية وعلى 389 كيلو ادا لNS-07 بعد العلاج. لا يمكن الكشف عن ديستروفين للمريض إما قبل العلاج، أو لا يمكن الكشف عن أي بعد العلاج للمريض NS-03. تظهر المنطقة في الصندوق الأسود في الشكل 4b. إلى اليسار في كل بقعة يتم عرض العلامة. ب)كمية من الديستروفين استعادة بعد العلاج للمريض NS-07. تم حساب استعادة ديستروفين على أساس كثافة العصابات للديستروفين، والخلفية، والأيزوفورم الطويل والقصي من سبيكترين وفقا للصيغة: (ديستروفين - الخلفية) / (spectrin L -الخلفية) + (spectrin S - الخلفية) حيث يتم تعيين نسبة للسيطرة الصحية إلى 100٪. تم قياس شدة كل نطاق داخل المربعات الزرقاء الموضحة في الشكل. وكان ترميم الديستروفين لNS-07 9.1٪ بعد العلاج. إشارة الديستروفين كانت ضعيفة جداً بحيث لا يمكن قياسها في العينات غير المعالجة. يتم عرض أحجام العلامة بالكيلودالتونات. دايس: ديستروفين، BG: الخلفية، SL: سبيكترين isoform طويلة، SS: سبيكترين isoform قصيرة، بلدي: Myosin نوع 1. يتم عرض أحجام العلامة بالكيلودالتونات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حل | حجم / رد فعل (μl) | التركيز النهائي |
| مياه خالية من الـ RNase (مقدمة) | متغير | - |
| 5X QIAGEN OneStep RT-PCR العازلة | 5.0 | 1 x |
| dNTP ميكس (تحتوي على 10 mM من كل dNTP) | 1.0 | 400 ميكرومتر من كل dNTP |
| التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) | 1.5 | 0.6 ميكرومتر |
| عكس التمهيدي (10 μM) | 1.5 | 0.6 ميكرومتر |
| QIAGEN OneStep RT-PCR مزيج الإنزيم | 1.0 | - |
| مثبط RNase (اختياري) | متغير | 5-10 وحدات / رد فعل |
| قالب الجيش الملكي النيبالي | 50 نانوغرام | |
| مجموع | 25 |
الجدول 1: الكواشف RT-PCR. المركبات اللازمة لتفاعل واحد من رت-PCR.
| التمهيدي | تسلسل |
| 44 واو | 5'-CCTGAGAAGAGGGGAACATGC-3' |
| 46 واو | 5'-AACCTGGAAAAGAGCAGCAA-3' |
| 48 واو | 5'-CCAAGAGAGGACCATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-TCTCGCTCACTCACCCTT-3' |
| 54R | 5'-GTACTTTTCTGGTATTATTATCAT-3' |
الجدول 2: قائمة التمهيدي. تسلسلات ل التمهيديات المستخدمة في هذه الدراسة. F: إلى الأمام، R: عكس.
| دورة 1 | النسخ العكسي | 30 دقيقة | 50 درجة مئوية |
| دورة 1 | خطوة تنشيط PCR الأولية | 15 دقيقة | 95 درجة مئوية |
| 35 دورة | التشبع بالدن | 1 دقيقة | 94 درجة مئوية |
| الصلب | 1 دقيقة | 60 درجة مئوية | |
| ملحق | 1 دقيقة | 72 درجة مئوية | |
| دورة 1 | التمديد النهائي | 7 دقائق | 72 درجة مئوية |
| عقد | ∞ | 4 درجة مئوية |
الجدول 3: PCR مكيفة المستخدمة. إظهار شروط PCR لتفاعل RT-PCR.
| حل | حجم / رد فعل (μl) |
| مياه خالية من RNase | متغير |
| BigDye المنهي 3.1 مزيج رد الفعل الجاهزة | 3.5 |
| التمهيدي الأمامي / عكس التمهيدي (3.2 μM) | 2.0 |
| قالب الجيش الملكي النيبالي | 20 نانوغرام |
| مجموع | 20 |
الجدول 4: الكواشف اللازمة لرد فعل تسلسلي. استخدم التمهيدي للأمام أو عكس في الإعداد، وليس كلاهما في نفس الوقت.
| دورة 1 | 1 دقيقة | 96 درجة مئوية |
| 25 دورة | 10 س | 96 درجة مئوية |
| 5 س | 50 درجة مئوية | |
| 4 دقائق | 60 درجة مئوية | |
| عقد | ∞ | 4 درجة مئوية |
الجدول 5: شروط PCR لتسلسل السانجر.
Discussion
وقد أنتجت التجارب السريرية من DMD كل من النجاحات والفشل في السنوات القليلة الماضية. كل من RT-PCR و blotting الغربية هي تقنيات شائعة لتقييم الكفاءة تخطي ولدت من قبل المركبات exon تخطي تدار للمرضى. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن الإفراط في تقدير كفاءة تخطي الـ RT-PCR مقارنة بـ PCR15الرقمية. وعلى الرغم من أن هذا يرجع إلى عدد من الأسباب، إلا أنه يحدث في المقام الأول عن طريق زيادة كفاءة تضخيم الأجزاء الأصغر التي تم تخطيها أثناء دورات PCR. ويبدو أن RT-PCR المستخدمة في هذه التجربة السريرية ولدت أيضا أعلى تخطي الكفاءة مقارنة مع تعبير البروتين المقدرة من قبل النشاف الغربية. وفقا لإدارة الأغذية والعقاقير، وهذا هو وسيلة أكثر موثوقية لتحديد كمي استعادة الديستروفين12. ومن ثم، ينبغي توخي الحذر عند تفسير النتائج التي تتخطى فيها RT-PCR؛ ومع ذلك لا يزال يمكن مقارنة العينات. العينات التي تظهر أعلى تخطي الكفاءة استناداً إلى نتائج RT-PCR عادةً ما تكون أعلى مستويات التعبير البروتين في تحليلات لطخة الغربية.
وبما أن جميع المرضى في التجارب السريرية DMD لا تملك نفس نمط الحذف، يمكن أن يكون من الصعب تصميم التمهيديات والتحقيقات التي هي محددة بشكل كاف لأداء الرقمية أو qPCR على جميع العينات. وبالتالي، RT-PCR لا يزال بديلا جيدا لتقييم أول للكفاءة تخطي. قبل أن تبدأ التجربة السريرية لNS-065/NCNP-01 ، كان من الممل تقييم الكفاءة تخطي كل مريض في المختبر لأن إما خزعة العضلات أو الجلد كانت إلزامية لتوليد myoblasts خاصة بالمريض. ومع ذلك، فقد نشرنا مؤخرا تقنية جديدة لتوليد المرضى الخاصة MYOD1 تحويلها، البول المستمدة من الخلايا (UDCs) باعتبارها رواية DMD العضلات الخلية نموذج16. وبالتالي ، مطلوب البول فقط التي تم جمعها من المريض لتوليد myoblasts ، وليس هناك إجراء الغازية اللازمة. ونحن نعتقد أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لفحص AONs مختلفة في الخلايا الخاصة المريض. وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار البدايات المختلفة والتحقيقات قبل أن يبدأ المريض أي تجربة سريرية. وهذا يمكن أن يسهل استخدام qPCR أو PCR الرقمية لاتخطاء القياس في التجارب السريرية DMD في المستقبل.
لإجراء تحليل البقعة الغربية في هذه التجربة السريرية، تم استخدام جسم مضاد واحد ضد ديستروفين، وتم استخدام واحد فقط من السيطرة الصحية كعينة مرجعية. ومن ثم، لم يتم التحقق من خصوصية الجسم المضاد بشكل مناسب. هذا، جنبا إلى جنب مع حقيقة أن الجسم المضاد يعترف فقط المجال C-المحطة الطرفية من ديستروفين، هو الحد من البروتوكول. أكثر صحة الضوابط والهيئات المضادة الموجهة ضد مجالات مختلفة من جزيء ديستروفين هي المستحسن في المستقبل.
هنا، لخصنا البروتوكولات التي استخدمت في التجربة الاستكشافية التي بدأها المحقق مؤخراً وأول تجربة في الإنسان لـ NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 يحتمل أن تنطبق على 10.1٪ من المرضى الذين يعانون من DMD.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدكتور تاكاشي سايتو، والدكتور تيتسويا ناغاتا، والسيد ساتوشي ماسودا، والدكتور إيري تاكيشيتا على المناقشة العلمية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
References
- Bushby, K., et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care. Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51 (6), 919-928 (1987).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK). European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).
- Greenberg, C. R., et al. Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening. Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).
- Forrest, S. M., et al. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).
- Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).
- Flanigan, K. M., et al. Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort. Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).
- Aoki, Y., et al. In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse. Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).
- Lu, Q. L., et al. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).
- Yokota, T., et al. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).
- Kesselheim, A. S., Avorn, J. Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy. Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).
- Mendell, J. R., et al. Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy. PLoS One. 11 (9), e0162467 (2016).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9 (1), 3807 (2019).
