Her præsenterer vi den molekylære karakterisering af dystrophin 38 udtryk ved hjælp af Sanger sekventering, RT-PCR, og vestlige blotting i det kliniske forsøg.
Duchenne muskelsvind (DMD) er en degenerativ muskelsygdom, der forårsager progressiv tab af muskelmasse, fører til for tidlig død. Mutationerne forårsager ofte en forvrænget læseramme og for tidlig stop codons, hvilket resulterer i en næsten total mangel på dystrophinprotein. Læserammen kan korrigeres ved hjælp af antisense oligonukleotider (AION), der fremkalder exon springe. Den morpholino AON viltolarsen (kodenavn: NS-065/NCNP-01) har vist sig at fremkalde exon 53 springe, genoprette læserammen for patienter med exon 52 sletninger. Vi har for nylig administreret NS-065/NCNP-01 intravenøst til DMD patienter i en sonderende investigator-initieret, first-in-human forsøg med NS-065/NCNP-01. I denne artikel præsenterer vi den molekylære karakterisering af dystrophinudtryk ved hjælp af Sanger-sekvensering, RT-PCR og vestlig blotting i det kliniske forsøg. Karakteriseringen af dystrophinudtryk var grundlæggende i undersøgelsen for at vise effekten, da der ikke blev udført funktionelle resultattest.
Duchenne muskelsvind (DMD) er en degenerativ muskelsygdom forårsager progressiv tab af muskelmasse, respirationssvigt, og kardiomyopati, og det fører til for tidlig død1. Sygdommen er forårsaget af en mangel på de store strukturelle muskel protein dystrophin2. Mutationer i DMD-genet på X-kromosomet er recessive, og sygdommen påvirker 1 ud af 3500-5000 nyfødte mænd3,4,5. Mutationerne er ofte store sletninger i et hotspot område mellem exons 44 og 55, der fører til en forvrænget læseramme og for tidlig stop codons, forårsager nonsens-medieret forfald og en næsten total mangel på dystrophin protein6,7,8. Læserammen kan korrigeres ved hjælp af antisense oligonukleotider (AION), der fremkalder exon springe og genoprette læserammen, delvist genoprette dystrophin udtryk og forsinke sygdomsprogression9,10,11. Den morpholino AON eteplirsen, som for nylig blev godkendt af Federal Drug Agency (FDA), inducerer springe exon 51 og kan genoprette læserammen hos patienter med exon 52 sletninger12,13. Men exon 53 springer genskaber læserammen for patienter med exon 52 sletninger, og det kan potentielt behandle ca 10% af DMD patienter14. Det har vist sig, at morolino AON-lægemidlet NS-065/NCNP-01 fremkalder exon 53, der springer over i humane celler, og vi har for nylig administreret NS-065/NCNP-01 til DMD patienter i en fase 1 åben dosis-eskalering kliniske forsøg (i det følgende benævnt “undersøgelsen”) (registreret som UMIN: 000010964 og ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. Undersøgelsen viste en dosisafhængig stigning i exon 53 springe baseret på RT-PCR og dystrophin protein niveauer baseret på vestlige blotting, og ingen alvorlige bivirkninger eller frafald blev observeret14.
I alle kliniske forsøg er analysen af resultaterne af afgørende betydning. For DMD kliniske forsøg, er en debat stadig i gang om den bedste metode til at vise en behandling fordel. Kliniske tests såsom 6-minutters gang test har visse ulemper. Molekylær karakterisering af dystrophinudtrykket kan udføres ved hjælp af flere metoder, såsom RT-PCR, qPCR, digital-PCR, western blotting og immunohistochemistry. Men omfanget af proteinudtryk restaurering, der er nødvendig for at give en klinisk fordel er fortsat uklart. I denne artikel beskriver vi i detaljer de RT-PCR og vestlige blotting metoder, der anvendes til at bestemme exon springe og protein niveauer, henholdsvis i fase 1 forsøg med AON springe stof NS-065/NCNP-0114.
Kliniske forsøg med DMD har produceret både succeser og fiaskoer i de sidste par år. Både RT-PCR og vestlige blotting er fælles teknikker til at vurdere springe effektivitet genereret af exon-springe forbindelser administreres til patienterne. RT-PCR er dog blevet rapporteret for at overvurdere springe effektiviteten sammenlignet med digital PCR15. Selv om dette skyldes en række årsager, er det primært forårsaget af den mere effektive forstærkning af de mindre sprunget fragmenter under PCR cykler. Det fremgår, at RT-PCR, der anvendes i dette kliniske forsøg også genereret højere springe effektivitet i forhold til protein udtryk anslået ved vestlige blotting. Ifølge FDA, Dette er en mere pålidelig måde at kvantificere dystrophin restaurering12. Derfor bør der udvises forsigtighed, når du fortolker RT-PCR springe resultater; prøverne kan dog stadig sammenlignes. Prøver, der viser højere springe effektivitet baseret på RT-PCR resultater almindeligvis exhbit højere proteinudtryk niveauer i vestlige blot analyser.
Da alle patienter i dmd kliniske forsøg ikke har det samme sletningsmønster, kan det være svært at designe primere og sonder, der er tilstrækkeligt specifikke til at udføre digital eller qPCR på alle prøver. Derfor rt-PCR er stadig et godt alternativ til en første vurdering af springe effektivitet. Før det kliniske forsøg med NS-065/NCNP-01 begyndte, var det kedeligt at vurdere springe effektivitet for hver patient in vitro, da enten en muskel eller hud biopsi var obligatorisk at generere patient-specifikke myoblaster. Men vi har for nylig offentliggjort en ny teknik til at generere patient-specifikke MYOD1-konverterede, urin-afledte celler (UDCs) som en ny DMD muskel celle model16. Således er kun urin indsamlet fra patienten er forpligtet til at generere myoblaster, og ingen invasiv procedure er nødvendig. Vi mener, at denne metode kan bruges til at screene forskellige AO’er i patientspecifikke celler. Desuden kan forskellige primere og sonder testes, før patienten starter et klinisk forsøg. Dette kan lette brugen af qPCR eller digital PCR til exon springe måling i DMD kliniske forsøg i fremtiden.
Til udførelse af western blot-analyse i dette kliniske forsøg blev der anvendt et enkelt antistof mod dystrophin, og kun én sund kontrol blev anvendt som referenceprøve. Antistoffets specificitet blev derfor ikke valideret korrekt. Dette er sammen med det faktum, at antistoffet kun anerkender dystrophins C-terminaldomæne, en begrænsning af protokollen. Mere sunde kontroller og antistoffer rettet mod forskellige domæner af dystrophin molekyle er tilrådeligt i fremtiden.
Her opsummerede vi de protokoller, der blev brugt i den seneste sonderende investigator-initierede, første-i-menneskelige forsøg med NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 kan muligvis anvendes til 10,1 % af patienterne med DMD.
The authors have nothing to disclose.
Vi er dr. Takashi Saito, dr. Tetsuya Nagata, hr. Satoshi Masuda og dr. Eri Takeshita for videnskabelige drøftelser.
100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
EzBlot | Atto | AE-1460 | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
SDS | Nacalai | 31606-75 | |
Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Urea | Nacalai | 35907-15 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |