Summary
यहां, हम नैदानिक परीक्षण में सेंगर अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन 38 अभिव्यक्ति के आणविक लक्षण वर्णन को प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक अपक्षयी मांसपेशियों की बीमारी है जो मांसपेशियों की प्रगतिशील हानि का कारण बनती है, जिससे अकाल मृत्यु हो जाती है। उत्परिवर्तन अक्सर एक विकृत पढ़ने के फ्रेम और समय से पहले बंद codons का कारण बनते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रॉफिन प्रोटीन की लगभग कुल कमी होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स (एओएन) का उपयोग करके रीडिंग फ्रेम को ठीक किया जा सकता है जो एक्सन लंघन को प्रेरित करता है। morpholino AON viltolarsen (कोड नाम: एनएस-065/NCNP-01) exon ५३ लंघन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, exon ५२ विलोपन के साथ रोगियों के लिए पढ़ने के फ्रेम बहाल । हमने हाल ही में एनएस-065/एनसीएनपी-01 को एनएस-065/एनसीएनपी-01 के एक अन्वेषणात्मक अन्वेषक-शुरू किए गए, पहले मानव परीक्षण में डीएमडी रोगियों को नसों के द्वारा प्रशासित किया । इस विधियों के लेख में, हम नैदानिक परीक्षण में सेंगर अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति के आणविक लक्षण वर्णन को प्रस्तुत करते हैं। डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन प्रभावकारिता दिखाने के लिए अध्ययन में मौलिक था क्योंकि कोई कार्यात्मक परिणाम परीक्षण नहीं किए गए थे।
Introduction
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक अपक्षयी मांसपेशियों की बीमारी है जिससे मांसपेशियों में उत्तरोत्तर हानि, श्वसन विफलता और कार्डियोमायोपैथी होती है, और इससे अकाल मृत्यु हो जाती है1। यह रोग बड़ी संरचनात्मक मांसपेशी प्रोटीन डिस्ट्रोफिन2की कमी के कारण होता है । एक्स-क्रोमोसोम पर डीएमडी-जीन में उत्परिवर्तन अप्रभावी होते हैं, और यह रोग 3500-5000 नवजात पुरुषों में 1 को प्रभावित करता है3,,4,,5। उत्परिवर्तन अक्सर एक्सन्स 44 और 55 के बीच एक हॉटस्पॉट क्षेत्र में बड़े विलोपन होते हैं जो विकृत पढ़ने के फ्रेम और समय से पहले स्टॉप कोडन का कारण बनते हैं, जिससे बकवास-मध्यस्थता क्षय होता है और डिस्ट्रॉफिन,प्रोटीन6,,7,8की लगभग कुल कमी होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स (एओएन) का उपयोग करके रीडिंग फ्रेम को ठीक किया जा सकता है जो एक्सोन लंघन को प्रेरित करता है और पढ़ने के फ्रेम को बहाल करता है, आंशिक रूप से डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति को बहाल करता है और रोग प्रगति9,10, 11,11में देरी करता है।, मॉर्फोलिनो एओन eteplirsen, जो हाल ही में संघीय दवा एजेंसी (एफडीए) द्वारा अनुमोदित किया गया था, exon ५१ के लंघन लाती है और exon ५२ विलोपन12, 13,13के साथ रोगियों में पढ़ने के फ्रेम बहाल कर सकते हैं । हालांकि, एक्सोन 53 लंघन 52 विलोपन वाले रोगियों के लिए पढ़ने के फ्रेम को पुनर्स्थापित करता है, और यह संभवतः डीएमडी रोगियों के लगभग 10% का इलाज कर सकता है14। मॉर्फोलिनो एऑन दवा एनएस-065/एनसीएनपी-01 को मानव कोशिकाओं में ५३ लंघन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, और हमने हाल ही में डीएमडी रोगियों को एक चरण 1 ओपन-लेबल खुराक-एस्केलेशन नैदानिक परीक्षण (इसके बाद, "अध्ययन" के रूप में संदर्भित) (यूमिन के रूप में पंजीकृत: 000010964 और ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14 में एनएस-065/एनसीएनपी-01प्रशासित किया। अध्ययन में पश्चिमी ब्लॉटिंग के आधार पर आरटी-पीसीआर और डिस्ट्रोफिन प्रोटीन के स्तर के आधार पर एक्सोन ५३ लंघन की खुराक पर निर्भर वृद्धि दिखाई गई, और कोई गंभीर प्रतिकूल दवा घटनाओं या ड्रॉपआउट14को नहीं देखा गया ।
सभी नैदानिक परीक्षणों में, परिणामों का विश्लेषण सर्वोपरि महत्व का है । डीएमडी नैदानिक परीक्षणों के लिए, उपचार लाभ दिखाने के लिए सबसे अच्छी विधि के बारे में अभी भी एक बहस चल रही है। 6 मिनट के वॉक टेस्ट जैसे क्लीनिकल टेस्ट में कुछ कमियां होती हैं । डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का आणविक लक्षण वर्णन आरटी-पीसीआर, क्यूपीसीआर, डिजिटल-पीसीआर, पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे कई तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति बहाली की सीमा है कि एक नैदानिक लाभ प्रदान करने के लिए आवश्यक है अस्पष्ट रहता है । इस तरीके लेख में, हम विस्तार से आरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग तरीकों का वर्णन करते हैं, जो क्रमशः एऑन लंघन दवा एनएस-065/एनसीएनपी-0114के चरण 1 परीक्षण में, क्रमशः exon लंघन और प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।
Protocol
जांचकर्ता द्वारा शुरू किए गए परीक्षण के लिए परिचालन प्रक्रिया को एनसीएनपी एथिकल कमेटी (अनुमोदन आईडी: A2013-019) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. मांसपेशियों के नमूनों की तैयारी
नोट: बाइसेप्स ब्रैचिई या क्वाड्रिसेप्स मांसपेशियों को अक्सर बायोप्सी साइटों के रूप में चुना जाता है। हालांकि, टिबिलिस पूर्वकाल का उपयोग नैदानिक परीक्षण में किया गया था।
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रोगियों से मांसपेशियों बायोप्सी
- त्वचा की तैयारी से पहले चीरा साइट को चिह्नित करें।
- बायोप्सी नमूने के लिए खारा-घटा धुंध तैयार करें। धुंध को अच्छी तरह निचोड़ें।
- त्वचा और चमड़े के नीचे के ऊतकों में स्थानीय एनेस्थीसिया इंजेक्ट करें, लेकिन मांसपेशियों में नहीं। कटनीस दर्द की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की गहराई का सुनिश्चित करें।
नोट: सामान्य एनेस्थीसिया आम तौर पर 15 साल से कम उम्र के बाल रोगियों में प्रयोग किया जाता है। - त्वचा से चमड़े के नीचे के ऊतकों को चीरा करें। चीरा खोलने और चमड़े के नीचे वसा को अलग करने के लिए छोटे रिट्रैक्टर्स का उपयोग करें।
नोट: इस कदम पर, त्वचा के एक हिस्से को फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति के लिए काटा जा सकता है। - प्रावरणी में एक और छोटा चीरा लगाकर प्रावरणी को आगे काट लें। मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए मच्छर संदंश का उपयोग कर किनारों को दबाएं।
- मांसपेशियों के चयनित हिस्से को खींचने के लिए एक सीवन का उपयोग करें। आइरिस कैंची का उपयोग करके एक छोटी सुरंग बनाएं और सुरंग में मच्छर संदंश डालें।
- बल प्रयोग कर मांसपेशियों के बंडल को अलग करें और लक्ष्य भाग के दोनों सिरों को काट लें।
नोट: मांसपेशी बायोप्सी नमूने वयस्क रोगियों के लिए एक पेंसिल के आकार के आसपास होना चाहिए (लंबाई 1.0-1.5 सेमी, व्यास 0.8-1.0 सेमी)। नमूना लंबाई में लगभग 1 सेमी और बाल रोगियों में व्यास में 5 मिमी होना चाहिए। - खारा घटा धुंध में नमूना लपेटें और कमरे के तापमान (आरटी) पर ताजा मांसपेशी परिवहन तुरंत एक सुविधा है जहां नमूना आगे के विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता है ।
नोट: यदि परिवहन की अवधि 1 घंटे से अधिक है तो नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर ले जाया जाना चाहिए।
2. मांसपेशी नमूना तैयारी
- जब तक गम नरम और चिपचिपा न हो जाए तब तक ट्रागाकेंथ गम और पानी की बराबर मात्रा मिलाएं। मिश्रण को 25 एमएल सीरिंज में लोड करें। सीरिंज को फ्रिज में स्टोर किया जा सकता है।
- कॉर्क डिस्क पर लगभग 0.5 से 1 सेमी ट्रागाकेंथ गम रखें। डिस्क को विपरीत दिशा में लेबल करें।
- तरल नाइट्रोजन में आइसोपेन्टेन का एक कंटेनर रखें जब तक कि कुछ तरल जमा न हो जाए।
- नमूना ट्रागाकनाथ गम में रखें। प्रत्येक मांसपेशी की देशांतर धुरी कॉर्क के लंबवत होनी चाहिए। उचित प्लेसमेंट में मदद करने के लिए प्रत्येक मांसपेशी के नीचे गोंद रखें।
- चिमटी का उपयोग कर, मांसपेशी/काग नमूना ठंड आइसोपेन में कदम २.३ में तैयार करने के लिए फ्रीज करने के लिए जगह है । नमूना लगातार 1 मिनट के लिए या पूरी तरह से जमे हुए जब तक ले जाएँ, और अस्थायी रूप से सूखी बर्फ पर जगह है।
- नमूना कांच की शीशियों में रखें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
3. मांसपेशी अनुभागिंग
- -25 डिग्री सेल्सियस के कामकाजी तापमान के साथ खंड के लिए क्रायोस्टेट स्थापित करें।
- कॉर्क/मांसपेशी ब्लॉक माउंट और ट्रिम जब तक फ्लैट वर्गों प्राप्त कर रहे हैं ।
- आरटी-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए 10 माइक्रोन की एक सेक्शन मोटाई का इस्तेमाल करें । इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या हीमेटोक्सीलिन और इओसिन स्टेनिंग के लिए क्रमशः 6-8 माइक्रोन और 10-12 माइक्रोन की मोटाई का उपयोग करें। 2.0 एमएल ट्यूब में कटा हुआ अनुभाग रखें और आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
4. आरएनए निष्कर्षण और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर)
- क्रायोस्टेट द्वारा जमे हुए मांसपेशियों से 10 माइक्रोन मोटाई के साथ लगभग 10 स्लाइस निकालें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार कुल आरएनए की शुद्धि किट का उपयोग करके शुद्ध कुल आरएनए लीजिए।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता को मापें।
- टेबल 1के अनुसार पीसीआर ट्यूबों में आरटी-पीसीआर रिएक्शन के लिए आवश्यक अभिकर् प को मिलाएं। प्राइमर सीक्वेंस के लिए टेबल 2 देखें।
नोट: फॉरवर्ड प्राइमर रोगी एनएस-03 और रोगी एनएस-07 के लिए 46F के लिए 44F था । रिवर्स प्राइमर एक डिफ़ॉल्ट के रूप में 54/55R था । यदि गैर-विशिष्ट उत्पाद स्पष्ट थे, तो 54R का उपयोग विकल्प के रूप में किया गया था। - मिश्रण युक्त पीसीआर ट्यूबों को थर्मो-साइकिलर में रखें। टेबल 3के अनुसार थर्मो-साइकिलर चलाएं।
- लंबी अवधि के भंडारण के लिए अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर उत्पाद स्टोर करें।
5. माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस और एक्सन लंघन गणना
नोट: एक्सान लंघन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए अक्सर एक माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस (एमसीई) प्रणाली का चयन किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम निर्माता ए के साथ-साथ निर्माता बी द्वारा एमसीई प्रणाली का उपयोग करके एक्सोन लंघन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक कदमों का वर्णन करते हैं, इसके बाद सिस्टम ए और बी कहा जाता है। नैदानिक परीक्षण के दौरान, एक्सोन लंघन दक्षता सिस्टम ए पर विश्लेषण किया गया था। हालांकि, सिस्टम ए अब बिक्री के लिए नहीं है, और हम एक्सन लंघन दक्षता का विश्लेषण करने के लिए सिस्टम बी की सलाह देते हैं। हमने दोनों प्रणालियों के लिए प्रोटोकॉल शामिल किए हैं (सिस्टम ए के लिए धारा 5.1 और सिस्टम बी के लिए 5.2 देखें)। सिस्टम ए और बी के बारे में जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें। इसके अलावा, यह कदम सामान्य एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ भी किया जा सकता है, लेकिन संवेदनशीलता स्पष्ट रूप से कम हो जाती है।
- सिस्टम ए का उपयोग करके माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस
नोट: सिस्टम ए में दो प्रकार के चिप्स होते हैं। यहां, हम डीएनए चिप के लिए कदम का वर्णन करते हैं ।- इक्विलिब्रेट किट रिएजेंट्स (दाग बफर, लोडिंग बफर, सीढ़ी और जेल बफर) आरटी, भंवर और स्पिन डाउन करने के लिए।
- जेल-दाग बफर (जीएस) तैयार करने के लिए, 10 एस के लिए जेल बफर और भंवर के 250 माइक्रोन में दाग बफर के 12.5 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिनट के लिए 2,400 x ग्राम पर स्पिन फिल्टर ट्यूब और सेंट्रलाइज के लिए समाधान ले जाएं। फिल्टर छोड़ दें।
नोट: फ़िल्टर किए गए जीएस को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - यदि नमूने अत्यधिक केंद्रित हैं, तो ते बफर या डैनसे-मुक्त पानी के साथ लगभग 50 एनजी/μL तक पतला करें।
नोट: यदि नमूने नमक एकाग्रता में हैं , तो 200 mM KCl (या NaCl) और/या 15 mM MgCl2,बफर का आदान-प्रदान करें । - डीएनए चिप के जेल प्राइमिंग अच्छी तरह से (हाइलाइट और लेबल किए गए जीएस) में जीएस समाधान के 12 माइक्रोन जोड़ें और चिप को भड़काना स्टेशन में रखें।
नोट: हवा के बुलबुले से बचने के लिए, पिपेट टिप को खड़ी और वितरण करते समय कुएं के नीचे डालें। पिपेट पर पहले स्टॉप पर धीरे-धीरे बांटें, और पाइपिंग चरण के अंत में हवा को निष्कासित न करें। - C3 मोड का चयन करें और स्टार्ट बटन दबाएं। भड़काना पूरा होने के बाद चिप निकाल दें।
- नेत्रहीन फंसे हवा बुलबुले या अधूरे प्राइमिंग के लिए माइक्रोचैनल का निरीक्षण करें।
- तैयार नमूनों और सीढ़ी को नीचे की तरह चिप पर लोड करें।
- अन्य 3 जीएस कुओं में जीएस समाधान के पिपेट 9 माइक्रोन।
- पिपेट 5 माइक्रोल लोडिंग बफर को एल वेल में और प्रत्येक नमूना अच्छी तरह से (1-11)।
- पिपेट 1 μL सीढ़ी एल कुएं में।
- 11 नमूना कुओं में से प्रत्येक में डीएनए नमूना के पिपेट 1 μL ।
- किसी भी अप्रयुक्त कुओं में ते या DNase मुक्त पानी के पिपेट 1 माइक्रोन। किट क्विक गाइड चिप लेआउट का आंकड़ा दिखाता है।
नोट: हल्के रंग की पृष्ठभूमि के ऊपर चिप पकड़ कर हवा के बुलबुले के लिए सभी कुओं का निरीक्षण करें। एक साफ पिपेट टिप के साथ या समाधान को हटाकर और फिर से लोड करके कुएं के तल पर किसी भी फंसे हुए हवा के बुलबुले को उखाड़ फेंकें।
- चिप को भंवर स्टेशन और प्रेस मिक्स में रखें। भंवर स्टेशन अपने आप 1 मिनट के बाद बंद हो जाता है।
- लोडिंग के 5 मिनट के भीतर इलेक्ट्रोफोरेसिस स्टेशन में चिप चलाएं।
- सॉफ्टवेयर टूलबार में नए रन का चयन करें। नई रन स्क्रीन पर, परख पुल-डाउन सूची से डीएनए और डीएनए 1K का चयन करें ।
- या तो प्रोजेक्ट पुल-डाउन सूची से चलाने के लिए एक परियोजना फ़ोल्डर का चयन करें या परियोजना क्षेत्र में नाम दर्ज करके एक नया प्रोजेक्ट फ़ोल्डर बनाएं।
- रन उपसर्ग क्षेत्र में रन के लिए एक नाम दर्ज करें और स्टार्ट रनपर क्लिक करें ।
- विश्लेषण पूरा होने पर उपकरण बीप करता है, और एक खिड़की दौड़ के अंत का संकेत देती है। ठीक करें और चिप प्लेटफॉर्म से चिप निकालें।
- फाइल चुनें । डेटा निर्यात करने के लिए डेटा निर्यात करें। निर्यात संवाद में वांछित विकल्पों का चयन करें।
- इलेक्ट्रोड को साफ करने के लिए, 800 माइक्रोन के साथ एक सफाई चिप भरें और इसे चिप प्लेटफॉर्म पर रखें, ढक्कन बंद करें, और इसे 1 मिनट के लिए बंद छोड़ दें। 1 मिनट के बाद, ढक्कन खोलें, सफाई चिप को हटा दें, और इलेक्ट्रोड को 1 मिनट के लिए सूखने दें।
- सिस्टम बी का उपयोग करके माइक्रोचिप इलेक्ट्रोफोरेसिस
- ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें और सैंपल की जानकारी डालें। जानकारी दर्ज करने के बाद, सॉफ्टवेयर बफर और मार्कर समाधान स्वचालित रूप से अलग करने की राशि की गणना करता है।
- सॉफ्टवेयर द्वारा गणना बफर को अलग करने की आवश्यक राशि तैयार करें। सबसे पहले, ते बफर की उचित मात्रा के साथ 10,000x समाधान को कमजोर करके 100x न्यूक्लिक एसिड जेल दाग समाधान तैयार करें। 100x समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 1x समाधान तैयार करने के लिए कंपनी द्वारा प्रदान की गई विशिष्ट ट्यूब में 100x न्यूक्लिक एसिड जेल दाग विद डिसिपरेशन बफर की उपयुक्त मात्रा में मिलाएं। समाधान भंवर।
- ट्यूब में मार्कर समाधान की आवश्यक मात्रा तैयार करें।
- जांच वॉश प्रोग्राम शुरू करें।
- समाप्त होने पर माइक्रोचिप वॉश प्रोग्राम शुरू करें।
- इसके साथ ही, नमूनों को पीसीआर मल्टीप्लेट (96-वेल, क्लियर) में पिपेट करें और डिएकाइज्ड पानी के साथ 4 बार पतला करें। मशीन को संभालने के लिए न्यूनतम मात्रा 6 μL है, और अधिकतम 30 μL है। हम सुझाव देते हैं कि कुल मात्रा 10 माइक्रोन (2.5 माइक्रोन का नमूना और 7.5 माइक्रोन पानी/ते-बफर) है।
- चिपकने वाला पीसीआर सील पन्नी चादरें और नमूनों स्पिन नीचे के साथ प्लेटों को कवर ।
- मशीन द्वारा दिखाए गए प्लेसमेंट के अनुसार मशीन में प्लेट, मार्कर समाधान और 1x अलग बफर सेट करें। स्टार्ट बटन पुश करें।
- जब रन समाप्त हो जाता है, तो परिणाम डेटा को सॉफ्टवेयर से .csv फ़ाइल के रूप में निर्यात करें और इस प्रकार मोलर एकाग्रता का उपयोग करके एक्सोन लंघन दक्षता की गणना करें:
Exon लंघन दक्षता (%) = (छोड़ दिया बैंड/
6. पूरक डीएनए (सीडीएनए) अनुक्रमण
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एगर उठे जेल की तैयारी
- 1.5 ग्राम एगर उठे पाउडर को मापें और पाउडर को एक माइक्रोवेव योग्य फ्लास्क में 1x टीएई बफर के 100 एमएल के साथ मिलाएं (जिसके परिणामस्वरूप 1.5% एगर उठे जेल)।
- 1-3 मिनट के लिए माइक्रोवेव जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो गया है ।
नोट: समाधान को ओवरबॉयल न करें, क्योंकि कुछ बफर लुप्त हो जाएंगे और जेल के अंतिम एगरेज़ प्रतिशत को बदल देंगे। - एगर उठे समाधान को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
- एगर उठे समाधान में 10 माइक्रोन 10,000x फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड डाई जोड़ें।
- जगह में अच्छी तरह से कंघी के साथ एक जेल ट्रे में agarose डालो। 20-30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ जब तक यह पूरी तरह से जम गया है ।
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Sequencing
- आरटी-पीसीआर उत्पाद के 5 माइक्रोन (स्टेप 4.4 से) और 6x लोडिंग बफर के 1 माइक्रोन मिलाएं। उन्हें 1.5% एगर उठे जेल के कुओं में लोड करें।
- 5 मिनट के लिए 135 वी पर जेल और 20 मिनट के लिए 120 वी चलाएं।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करके बैंड की कल्पना करें।
- जेल से ब्याज के उत्पाद शुल्क और आरटी-पीसीआर उत्पादों को पुनः प्राप्त करने के लिए एक जेल और पीसीआर सफाई किट का उपयोग करें।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता को मापें।
नोट: शुद्ध बैंड एक कंपनी या अनुक्रमण सुविधा में अनुक्रमण के लिए भेजा जा सकता है अगर कोई Sanger अनुक्रमण उपकरण घर में उपलब्ध है । - टेबल 4के अनुसार एक साइकिल अनुक्रमण किट और पिपेट को मल्टीप्लेट पीसीआर प्लेट में तैयार करें। प्राइमर सीक्वेंस के लिए टेबल 2 देखें।
- स्पष्ट चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील।
- भंवर 2 से 3 एस के लिए थाली। एक झूल बाल्टी अपकेंद्रित्र में संक्षेप में सेंट्रलाइज इतना है कि सामग्री 1,000 x ग्रामपर कुओं (5 से 10 एस) के नीचे करने के लिए व्यवस्थित।
नोट: हवा के बुलबुले कुओं में मौजूद हो सकते हैं, लेकिन वे प्रतिक्रिया पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालते हैं। - मिश्रण को थर्मो-साइकिलर में रखें और टेबल 5के अनुसार चलाएं।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लेटों के साथ अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं को शुद्ध करें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार दृश्यों का निर्धारण करने के लिए डीएनए एनालाइजर का उपयोग करें।
- रोगी के अपेक्षित अनुक्रम के लिए प्राप्त अनुक्रम की तुलना करें।
7. पश्चिमी धब्बा
- नमूना तैयार करना
- एसडीएस नमूना बफर (4% एसडीएस, 4 एम यूरिया, 10% 2-मर्केप्टोथेनॉल, 10% ग्लाइसरोल, 70 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.4, 0.001% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, और प्रोटीज अवरोधक) तैयार करें।
- एसडीएस बफर के 150 माइक्रोन में क्रायो-सेक्शनिंग से एकत्र किए गए 10 माइक्रोन मांसपेशी वर्गों के लगभग 100 स्लाइस रखें।
- संक्षेप में एक आसान माइक्रो होमोजेनाइजर का उपयोग कर 30 एस के लिए बर्फ पर प्रोटीन नमूनों समरूप ।
- 15 मिनट के लिए 16,500 x ग्राम पर सेंट्रलाइज, और एक ताजा ट्यूब के लिए सुपरनेट को स्थानांतरित करें। विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें या -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- प्रोटीन एकाग्रता माप के लिए एसडीएस-पेज
नोट: प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए फ्लोरोसेंट जेल दाग का उपयोग किया गया था।- निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके सामान्य स्वस्थ नियंत्रण नमूना वजन और एकाग्रता का निर्धारण करें।
- जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए नमूने तैयार करें। पिपेट स्वस्थ नियंत्रण के कुल प्रोटीन का 10 माइक्रोन और रोगी के नमूनों का 5 माइक्रोन, 4x नमूना बफर के 5 माइक्रोन, 10x नमूना कम करने वाले एजेंट के 2 माइक्रोन। एक बार जब इन्हें मिलाया गया है, तो प्रत्येक नमूने में 20 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में डिएकोनाइज्ड पानी जोड़ें।
- 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के नमूने।
- 40x एसडी के 50 एमएल रनिंग बफर का उपयोग करके 1x एसडीएस रनिंग बफर के 2,000 एमएल तैयार करें। 1,950 एमएल के डिएकीकृत पानी के साथ पतला।
नोट: इस बिंदु पर, बफर चलाने के 1,000 एमएल पर्याप्त है। शेष 1,000 एमएल बफर का उपयोग चरण 7.3.1 पर किया जाता है। - अच्छी तरह से मिलाएं और जेल बॉक्स के निचले (बाहरी) बफर चैंबर में उपयोग के लिए बफर चलाने वाले 1x एसडीएस के 800 एमएल को अलग रखें।
- इलेक्ट्रोफोरेसिस से तुरंत पहले, जेल बॉक्स के ऊपरी (भीतरी) बफर चैंबर में उपयोग करने के लिए बफर चलाने वाले 1x एसडीएस के 200 एमएल में एंटीऑक्सीडेंट बफर के 500 μL जोड़ें।
- निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 3-8% ट्राइस-एसीटेट जेल स्थापित करके जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए तैयार करें। जेल पर प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोन लोड करें।
- 75 मिनट के लिए 150 वी पर इलेक्ट्रोफोरेसिस करें।
- इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, जेल को सीधे एक साफ ट्रे में रखें जिसमें फ्लोरोसेंट जेल दाग समाधान का 50 एमएल होता है।
- ट्रे को कवर करें, एक शेकर पर रखें, और तरल छिड़काव या 90 मिनट के लिए जेल को नुकसान पहुंचाए बिना आंदोलन करें।
- फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए एथिडियम ब्रोमाइड उत्सर्जन फिल्टर के साथ 312 एनएम रोशनी में फ्लोरेसेंस सिस्टम में इमेजिंग से पहले जेल को पानी में स्थानांतरित करें।
- ज्ञात एकाग्रता के साथ सामान्य नियंत्रण का उपयोग करके निर्मित विश्लेषणात्मक वक्र के आधार पर रोगी नमूनों की सांद्रता को मापें।
- पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए एसडीएस-पेज
- चरण 7.2.4-7.2.6 के अनुसार जेल बॉक्स तैयार करें।
- चरण 7.2.11 में प्राप्त एकाग्रता माप के आधार पर, स्वस्थ नियंत्रण के प्रति लेन 100 माइक्रोग्राम लोड और रोगी के नमूने के प्रति लेन 300 माइक्रोन लोड करें। इलेक्ट्रोफोरे चरण 7.2.7 के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर।
- प्रोटीन ट्रांसफर
- ट्रांसफर बफर तैयार करें। मेथनॉल में 20 एस के लिए पीवीडीएफ झिल्ली सोख ें। उपयोग होने तक इसे ब्लॉटिंग बफर बी में ले जाएं।
- बफर ए, बी और सी को कम से कम 30 मिनट प्रति बफर के लिए ब्लोटिंग बफर ए, बी और सी में एक अतिरिक्त मोटी ब्लॉटिंग पेपर भिगोएं।
- इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, जेल को 5 मिनट के लिए बफर बी को ब्लॉटिंग में भिगो दें।
- चित्रा 1में ड्राइंग के अनुसार अर्ध-शुष्क स्थानांतरण मशीन पर ब्लॉटिंग पेपर, पीवीडीएफ झिल्ली और जेल रखें। एक रोलर के साथ जेल और झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले को रोल करें।
- आरटी में 1 घंटे के लिए 2 एमए/सेमी2 झिल्ली पर स्थानांतरण ।
नोट: स्थानांतरित करने के बाद, बड़े आणविक वजन प्रोटीन के सफल हस्तांतरण की पुष्टि करने के लिए Ponceau धुंधला के समान कुल प्रोटीन दाग प्रदर्शन करने की सिफारिश की है।
- अवरुद्ध और एंटीबॉडी धुंधला
- पीबीएसटी (0.1% ट्वीन 20 के साथ 1x पीबीएस) के साथ दो बार झिल्ली कुल्ला।
- झिल्ली को 1% अवरुद्ध एजेंट में रखें, और ब्लॉक करने के लिए आरटी में 1 घंटे के लिए धीरे से रॉक करें।
- ब्लॉकिंग सॉल्यूशन (1:125) और एंटी-स्पेक्ट्रिन एंटीबॉडी (1:25,000) के साथ झिल्ली को आरटी में 1 घंटे या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- आरटी में पीबीएएसटी के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए झिल्ली को तीन बार धोएं।
- सहिजन पेरोक्सिडेज (एचआरपी) के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें-पब्लिश (1:100) में आर टी में ४० मिनट के लिए माध्यमिक एंटी-माउस/खरगोश एंटीबॉडी ।
- आर टी में पीबीएएसटी के साथ 10 मिनट के लिए झिल्ली को फिर से तीन बार धोएं।
- डिटेक्शन
- 1:1 के अनुपात में डिटेक्शन सॉल्यूशंस ए और बी मिलाएं। डिटेक्शन रिएजेंट की अंतिम मात्रा 01 एमएल/सेमी2 झिल्ली है।
- धोया झिल्ली से अतिरिक्त PBST निकालें और यह प्रोटीन की ओर प्लास्टिक की चादर या अन्य उपयुक्त साफ सतहों की एक चादर पर के साथ जगह है। झिल्ली पर मिश्रित पहचान रिएजेंट जोड़ें और आरटी में 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- झिल्ली को धीरे-धीरे संदंश में पकड़कर और ऊतक के खिलाफ किनारे को छूकर अतिरिक्त पहचान अभिकर्मक को हटा दें।
- दाग प्रोटीन साइड को एक नमूना ट्रे पर रखें। उपयोगकर्ता दस्तावेज के अनुसार फ्लोरोसेंट सिस्टम संचालित करें। मशीन को इस प्रकार सेट करें। एक्सपोजर प्रकार: वेतन वृद्धि, अंतराल समय: 10 एस, संवेदनशीलता/संकल्प: उच्च ।
नोट: मापा क्षेत्रों एक नीले आयत के साथ बॉक्स्ड थे(चित्रा 4ए-बी):बीजी: पृष्ठभूमि; D: डिस्ट्रोफिन 427 केडीए, एसएल: स्पेक्ट्रिन बीटा लांग आइसोफॉर्म (274 केडीए); एसएस: शॉर्ट आइसोफॉर्म (253 केडीए)। डिस्ट्रोफिन/स्पेक्ट्रिन सिग्नल रेशियो की गणना (डी-बीजी)/[एसएल-बीजी) + (एसएस-बीजी)] के रूप में की गई थी । सामान्य नियंत्रण का अनुपात 100% के रूप में निर्धारित किया गया था।
Representative Results
एक्सोन लंघन का पता लगाने के लिए आरटी-पीसीआर का उपयोग करने के लिए, छोड़ दिया जाएगा कि exon के दोनों ओर प्राइमर डिजाइन किए गए थे और केवल विशिष्ट बैंड उपज के लिए मूल्यांकन (Exon लंघन और प्राइमर स्थिति के एक योजनाबद्ध आरेख के लिए चित्रा 2 देखें) । प्राइमर को ऐसे उत्पाद उत्पन्न करने चाहिए जिन्हें एमसीई प्रणाली या सामान्य एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस पर आकार से आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है यदि एमसीई उपलब्ध नहीं है। चित्रा 3एक एमसीई प्रणाली से पता चलता है आरटी-पीसीआर प्रतिक्रियाओं की एक जेल छवियों और रोगियों एनएस-03 और एनएस-07 से पहले और खुराक वृद्धि चरण 1 परीक्षण में एनएस-065/NCNP-01 के साथ उपचार के बाद छोड़ दिया बैंड के अनुक्रमण परिणाम । एनएस-03 और एनएस-07 हार्बर विलोपन जो क्रमशः 45-52 और 48-52 हैं। एनएस-03 को 12 सप्ताह के लिए साप्ताहिक एनएस-065/एनसीएनपी-01 साप्ताहिक 5 मिलीग्राम/किलोग्राम और एनएस-07 20 मिलीग्राम/किलोग्राम प्राप्त हुआ। उपचार से पहले की उम्मीद के अनुसार, दोनों रोगियों ने कोई लंघन नहीं दिखाया, और केवल एक गैर-छोड़े गए बैंड की कल्पना की जा सकती है। उपचार के 12 सप्ताह के बाद, एक स्पष्ट छोड़ दिया कम बैंड एनएस-07 के लिए कल्पना की गई थी । हालांकि, रोगी एनएस-03 के लिए किसी भी छोड़े गए उत्पाद का पता लगाना अभी भी मुश्किल था। अनुक्रमण के परिणामों में एनएस-07 के लिए एक्सोन्स ४७ और ५४ के साथ-साथ एनएस-03 के लिए एक्सॉन ४४ और ५४ का संयोजन दिखाया गया । अनुक्रम के अनुसार, ये सैद्धांतिक रूप से एक कार्यात्मक लेकिन छोटा डिस्ट्रोफिन आइसोफॉर्म का उत्पादन कर सकते हैं। चित्रा 3बीमें दिखाए गए लंघन प्रतिशत की गणना करने के लिए, छोड़े गए बैंड के लिए मोलर एकाग्रता को छोड़े गए और संयुक्त राष्ट्र द्वारा छोड़े गए बैंड द्वारा विभाजित किया गया था। रोगी एनएस-07 के लिए उपचार के बाद प्रतिशत 72% था, और एनएस-03 के लिए यह 3.4% था। मरीजों एनएस-03, एनएस-07 से वेस्टर्न ब्लॉट डेटा (ट्रिपलिटेरेट में) और एक स्वस्थ नियंत्रण चित्र 4एमें दिखाया गया है । उम्मीद है कि इलाज से पहले कोई डिस्ट्रोफिन बैंड नहीं पाया गया । उपचार के बाद रोगी एनएस-07 के एक बैंड को स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में कम आणविक वजन के साथ पाया गया (जंगली प्रकार के डिस्ट्रोफिन में 427 केडीए का आणविक वजन होता है, और एनएस-07 डिस्ट्रोफिन का आणविक वजन 389 केडीए होता है)। एक्सॉन हटाने और लंघन के कारण, रोगी एनएस-07 से डिस्ट्रोफिन आइसोफॉर्म में कई एक्सोन्स की कमी थी, और इसमें आणविक वजन कम होने की उम्मीद थी। रोगी एनएस-03 ने उपचार के बाद डिस्ट्रोफिन का कोई पता लगाने योग्य स्तर नहीं दिखाया। चित्रा 4बीमें, रोगी एनएस-07 के लिए स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में डिस्ट्रोफिन की मात्रा दिखाई गई है। डिस्ट्रोफिन बहाली की गणना के लिए संकेत तीव्रता को मापा गया स्थान नीले वर्गों के साथ इंगित किया जाता है। डिस्ट्रोफिन स्पेक्ट्रिन अनुपात का उपयोग स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में डिस्ट्रोफिन की मात्रा की गणना करने के लिए किया गया था। इस उद्देश्य के लिए, डिस्ट्रोफिन माइनस पृष्ठभूमि से संकेत दो स्पेक्ट्रिन आइसोफॉर्म (लंबी और छोटी) माइनस पृष्ठभूमि (चरण 8.6.5 देखें) के योग से विभाजित किया गया था। स्वस्थ नियंत्रण के लिए अनुपात १००% के लिए निर्धारित किया गया था । उपचार के बाद रोगी एनएस-07 में स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में डिस्ट्रोफिन की मात्रा 9.1% थी। हालांकि, प्रतिशत एक कमजोर डिस्ट्रोफिन बैंड है, जो दोनों रोगियों के लिए पूर्व उपचार के नमूनों के लिए प्राप्त उन लोगों के समान के कारण रोगी एनएस-03 के लिए गणना नहीं की जा सकी ।
चित्रा 1: पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए स्थानांतरण ढेर के योजनाबद्ध आरेख। नीचे में ब्लॉटिंग बफर ए में भिगोए गए ब्लॉटिंग पेपर के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग पेपर के साथ असेंबली, इसके बाद ब्लॉटिंग बफर बी, पीवीडीएफ झिल्ली में भिगोए गए पेपर को दागदार करके, 3-8% ट्रिस-एसीटेट जेल और ब्लॉटिंग बफर सी में भिगोए गए शीर्ष 2 ब्लॉटिंग पेपर्स पर दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: डीएमडी जीन में एक्सन 45-52 विलोपन के साथ एक मरीज में exon ५३ के exon लंघन की योजनाबद्ध ड्राइंग । उदाहरण के लिए, खुराक-वृद्धि नैदानिक परीक्षण में रोगी एनएस-03 ने यह विलोपन किया था। यदि exon ५३ बनाए रखा है, mRNA फ्रेम से बाहर हो जाएगा के बाद से exon-exon ४४ और ५३ के बीच जंक्शन पढ़ने के फ्रेम में बाधा, exon ५३ में एक बंद codon के कारण । जब एक्सोन 53 को छोड़ दिया जाता है, तो पढ़ने का फ्रेम बहाल किया जाता है, और डिस्ट्रॉफिन का एक छोटा आइसोफॉर्म उत्पादित किया जाता है। आरटी-पीसीआर द्वारा एक्सोन ५३-लंघन का पता लगाने के लिए, एक्सन ४४ और ५४ में प्राइमर का उपयोग किया जाता है ताकि छोड़े गए और संयुक्त राष्ट्र के बीच पीसीआर-उत्पाद-छोड़ दिया गया एमआरएनए आसानी से पता लगाया जा सके । एफडब्ल्यूडी: फॉरवर्ड प्राइमर, रेव: रिवर्स प्राइमर, पीएमओ: फॉस्फोरोडिडोमीडेट मॉर्फोलिनो ओलिगोमर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: टिबियालिस पूर्वकाल मांसपेशियों के बायोप्सी नमूनों से रोगियों एनएस-03 और एनएस-07 के लिए दक्षता लंघन करना। क)इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम ए द्वारा उत्पन्न जेल इमेज मरीजों एनएस-03 और एनएस-07 से अनुपचारित और इलाज किए गए नमूनों के आरटी-पीसीआर नमूनों की एक । अपर पैनल ट्रिपलआईटी में एनएस-03 और लोअर पैनल एनएस-07 को दिखाता है। एनएस-03 के लिए, संयुक्त राष्ट्र छोड़ दिया बैंड ४२२ बीपी है, और छोड़ दिया बैंड २१२ बीपी है । एनएस-07 के लिए बैंड क्रमश 836 बीपी और 624 बीपी हैं। अनुक्रम विश्लेषण में एनएस-03 के लिए एक्सोन 44 और एक्सोन 54 और एनएस-07 के लिए 54 को एक्सोन 44 का एक संयोजन दिखाया गया। ख)उपचार से पहले और बाद में लंघन रोगियों एनएस-03 और एनएस-07 के लिए दिखाया गया है, दो बैंड के मोलर एकाग्रता से गणना की प्रणाली द्वारा प्रदान की के रूप में छोड़ दिया बैंड/ उपचार के बाद एनएस-03 के लिए लंघन दक्षता बहुत कम थी; एनएस-07 के लिए, लंघन दक्षता 70% से अधिक थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एक्सोन लंघन थेरेपी से पहले और बाद में डिस्ट्रोफिन आइसोफॉर्म का प्रोटीन क्वांटिफिकेशन। क)एक्सोन लंघन थेरेपी से पहले और बाद में डिस्ट्रोफिन आइसोफॉर्म का प्रोटीन क्वांटिफिकेशन। रोगियों एनएस-03 और एनएस-07 से रोगियों एनएस-03 और एनएस-07 से और उपचार के बाद और ट्रिपलीकेट में स्वस्थ नियंत्रण से टिबिलिस पूर्ववर्ती से मांसपेशी बायोप्सी का पश्चिमी दाग। डिस्ट्रोफिन को स्वस्थ नियंत्रण के लिए 427 केडीए में और उपचार के बाद एनएस-07 के लिए 389 केडीए पर देखा जा सकता है। उपचार से पहले या तो रोगी के लिए कोई डिस्ट्रोफिन का पता नहीं लगाया जा सकता है, या न ही रोगी एनएस-03 के लिए उपचार के बाद किसी का पता लगाया जा सकता है । ब्लैक बॉक्स में क्षेत्र चित्रा 4bमें दिखाया गया है । प्रत्येक दाग में बाईं ओर मार्कर दिखाया गया है। ख)रोगी एनएस-07 के उपचार के बाद डिस्ट्रोफिन की मात्रा बहाल। डिस्ट्रोफिन बहाली की गणना डिस्ट्रोफिन, पृष्ठभूमि के लिए बैंड की तीव्रता के आधार पर की गई थी, और सूत्र के अनुसार स्पेक्ट्रिन के लंबे और छोटे आइसोफॉर्म: (डिस्ट्रोफिन - पृष्ठभूमि)/(स्पेक्ट्रिन एल-बैकग्राउंड) + (स्पेक्ट्रिन एस - बैकग्राउंड) जहां स्वस्थ नियंत्रण के लिए अनुपात 100% तक सेट है। प्रत्येक बैंड की तीव्रता को आंकड़े में दिखाए गए नीले बक्से के अंदर मापा गया था। उपचार के बाद एनएस-07 के लिए डिस्ट्रोफिन बहाली 9.1% थी। डिस्ट्रोफिन सिग्नल अनुपचारित नमूनों में मापने के लिए बहुत कमजोर था। मार्कर आकार किलोडलटन में दिखाए जाते हैं। Dys: Dystrophin, बीजी: पृष्ठभूमि, SL: स्पेक्ट्रिन लांग आइसोफॉर्म, एसएस: स्पेक्ट्रिन शॉर्ट आइसोफॉर्म, माय: मायोसिन टाइप 1। मार्कर आकार किलोडलटन में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| समाधान | वॉल्यूम/रिएक्शन (μl) | अंतिम एकाग्रता |
| RNase मुक्त पानी (प्रदान) | चर | - |
| 5x QIAGEN OneStep आरटी-पीसीआर बफर | 5.0 | 1x |
| डीएनटीपी मिक्स (प्रत्येक डीएनटीपी के 10 एमएमएम युक्त) | 1.0 | प्रत्येक डीएनटीपी के 400 माइक्रोन |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10 माइक्रोन) | 1.5 | 0.6 माइक्रोन |
| रिवर्स प्राइमर (10 माइक्रोन) | 1.5 | 0.6 माइक्रोन |
| QIAGEN OneStep आरटी-पीसीआर एंजाइम मिक्स | 1.0 | - |
| RNase अवरोधक (वैकल्पिक) | चर | 5-10 यूनिट/रिएक्शन |
| टेम्पलेट आरएनए | 50 एनजी | |
| कुल | 25 |
तालिका 1: आरटी-पीसीआर रिएजेंट्स। आरटी-पीसीआर की एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक यौगिक।
| प्राइमर | अनुक्रम |
| 44F | 5'-CCTGAGAACATGC-3' |
| 46F | 5'-AACCTGGAAGAAGAAGAA-3 ' |
| 48F | 5'-CCAAGAAGATTTGACG-3' |
| 54/55R | 5'-टीसीटीसीटीसीटीसीटीसीटीसीएसीसीटीटीटीटी-3' |
| 54R | 5'-GTGGACTTTTCTGGTATCAT-3' |
तालिका 2: प्राइमर सूची। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर के लिए दृश्य। एफ: फॉरवर्ड, आर: रिवर्स ।
| 1 चक्र | रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन | 30 मिनट | 50 डिग्री सेल्सियस |
| 1 चक्र | प्रारंभिक पीसीआर सक्रियण कदम | 15 मिनट | 95 डिग्री सेल्सियस |
| 35 चक्र | डेनैचेशन | 1 मिनट | 94 डिग्री सेल्सियस |
| एनीलिंग | 1 मिनट | 60 डिग्री सेल्सियस | |
| एक्सटेंशन | 1 मिनट | 72 डिग्री सेल्सियस | |
| 1 चक्र | अंतिम विस्तार | 7 मिनट | 72 डिग्री सेल्सियस |
| पकड़ | ∞ | 4 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 3: पीसीआर वातानुकूलित का उपयोग किया जाता है। आरटी-पीसीआर रिएक्शन के लिए पीसीआर की शर्तें दिखाएं।
| समाधान | वॉल्यूम/रिएक्शन (μl) |
| RNase मुक्त पानी | चर |
| BigDye टर्मिनेटर 3.1 रेडी रिएक्शन मिक्स | 3.5 |
| फॉरवर्ड प्राइमर/रिवर्स प्राइमर (३.२ μM) | 2.0 |
| टेम्पलेट आरएनए | 20 एनजी |
| कुल | 20 |
तालिका 4: अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिकर् ता। सेटअप में या तो फॉरवर्ड या रिवर्स प्राइमर का उपयोग करें, दोनों एक ही समय में नहीं।
| 1 चक्र | 1 मिनट | 96 डिग्री सेल्सियस |
| 25 चक्र | 10 एस | 96 डिग्री सेल्सियस |
| 5 एस | 50 डिग्री सेल्सियस | |
| 4 मिनट | 60 डिग्री सेल्सियस | |
| पकड़ | ∞ | 4 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 5: सेंगर अनुक्रमण के लिए पीसीआर की स्थिति।
Discussion
डीएमडी के नैदानिक परीक्षणों ने पिछले कुछ वर्षों में सफलताओं और विफलताओं दोनों का उत्पादन किया है। दोनों आरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग रोगियों को प्रशासित exon-लंघन यौगिकों द्वारा उत्पन्न लंघन दक्षता का आकलन करने के लिए आम तकनीक हैं । हालांकि, आरटी-पीसीआर को डिजिटल पीसीआर15की तुलना में लंघन दक्षता का अधिक अनुमान लगाने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि यह कई कारणों से है, यह मुख्य रूप से पीसीआर चक्रों के दौरान छोटे छोड़े गए टुकड़ों के अधिक कुशल प्रवर्धन के कारण होता है। ऐसा लगता है कि इस नैदानिक परीक्षण में उपयोग की जाने वाली आरटी-पीसीआर ने पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा अनुमानित प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना में उच्च लंघन क्षमता भी उत्पन्न की। एफडीए के अनुसार, यह डिस्ट्रोफिन बहाली12की मात्रा निर्धारित करने का एक अधिक विश्वसनीय तरीका है। इसलिए, आरटी-पीसीआर लंघन परिणामों की व्याख्या करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए; हालांकि नमूनों की तुलना अभी भी की जा सकती है। आरटी-पीसीआर परिणामों के आधार पर उच्च लंघन क्षमता दिखाने वाले नमूने आमतौर पर पश्चिमी दाग विश्लेषणों में उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को अत्यधिक करते हैं ।
चूंकि डीएमडी नैदानिक परीक्षणों में सभी रोगियों के पास एक ही विलोपन पैटर्न नहीं है, इसलिए सभी नमूनों पर डिजिटल या क्यूपीसीआर करने के लिए पर्याप्त रूप से विशिष्ट प्राइमर और जांच डिजाइन करना मुश्किल हो सकता है। इसलिए, आरटी-पीसीआर अभी भी लंघन दक्षता के पहले आकलन के लिए एक अच्छा विकल्प है। एनएस-065/एनसीएनपी-01 का नैदानिक परीक्षण शुरू होने से पहले, विट्रो में प्रत्येक रोगी के लिए लंघन दक्षता का आकलन करना थकाऊ था क्योंकि रोगी-विशिष्ट मायोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए या तो मांसपेशी या त्वचा बायोप्सी अनिवार्य थी । हालांकि, हमने हाल ही में एक उपन्यास डीएमडी मांसपेशी कोशिका मॉडल16के रूप में रोगी-विशिष्ट MYOD1-परिवर्तित, मूत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी) को उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास तकनीक प्रकाशित की है। इस प्रकार, केवल रोगी से एकत्र मूत्र को मायोब्लास्ट उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है, और कोई आक्रामक प्रक्रिया आवश्यक नहीं है। हमारा मानना है कि इस विधि का उपयोग रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं में विभिन्न एओएन को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रोगी के किसी भी नैदानिक परीक्षण शुरू होने से पहले विभिन्न प्राइमर और जांच का परीक्षण किया जा सकता है। यह भविष्य में डीएमडी नैदानिक परीक्षणों में माप को छुड़ाने के लिए क्यूपीसीआर या डिजिटल पीसीआर के उपयोग की सुविधा प्रदान कर सकता है।
इस नैदानिक परीक्षण में पश्चिमी दाग विश्लेषण करने के लिए, डिस्ट्रॉफिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, और संदर्भ नमूने के रूप में केवल एक स्वस्थ नियंत्रण का उपयोग किया गया था। इसलिए, एंटीबॉडी की विशिष्टता को उचित रूप से मान्य नहीं किया गया था। यह, इस तथ्य के साथ कि एंटीबॉडी केवल डिस्ट्रॉफिन के सी-टर्मिनल डोमेन को मान्यता देता है, प्रोटोकॉल की एक सीमा है। डिस्ट्रोफिन अणु के विभिन्न डोमेन के खिलाफ निर्देशित अधिक स्वस्थ नियंत्रण और एंटीबॉडी भविष्य में सलाह दी जाती है।
यहां, हमने उन प्रोटोकॉलों का सारांश दिया जिनका उपयोग हाल ही में अन्वेषणात्मक अन्वेषक द्वारा शुरू किए गए, एनएस-065/एनसीएनपी-01 के पहले मानव परीक्षण में किया गया था । एनएस-065/एनसीएनपी-01 संभावित रूप से डीएमडी के साथ 10.1% रोगियों पर लागू होता है।
Disclosures
कोई नहीं.
Acknowledgments
हम वैज्ञानिक चर्चा के लिए डॉ ताकाशी साइको, डॉ तेत्सुया नागाटा, श्री सातोशी मसुदा और डॉ एरी तासिता के आभारी हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
| 1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
| 6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
| Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
| Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
| BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
| Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
| ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
| Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
| Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
| Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
| Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| EzBlot | Atto | AE-1460 | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
| glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
| Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
| Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
| Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
| NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
| Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
| RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
| SDS | Nacalai | 31606-75 | |
| Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
| TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
| Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
| Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | Nacalai | 35907-15 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |
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