यहां, हम नैदानिक परीक्षण में सेंगर अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन 38 अभिव्यक्ति के आणविक लक्षण वर्णन को प्रस्तुत करते हैं।
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक अपक्षयी मांसपेशियों की बीमारी है जो मांसपेशियों की प्रगतिशील हानि का कारण बनती है, जिससे अकाल मृत्यु हो जाती है। उत्परिवर्तन अक्सर एक विकृत पढ़ने के फ्रेम और समय से पहले बंद codons का कारण बनते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डिस्ट्रॉफिन प्रोटीन की लगभग कुल कमी होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स (एओएन) का उपयोग करके रीडिंग फ्रेम को ठीक किया जा सकता है जो एक्सन लंघन को प्रेरित करता है। morpholino AON viltolarsen (कोड नाम: एनएस-065/NCNP-01) exon ५३ लंघन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, exon ५२ विलोपन के साथ रोगियों के लिए पढ़ने के फ्रेम बहाल । हमने हाल ही में एनएस-065/एनसीएनपी-01 को एनएस-065/एनसीएनपी-01 के एक अन्वेषणात्मक अन्वेषक-शुरू किए गए, पहले मानव परीक्षण में डीएमडी रोगियों को नसों के द्वारा प्रशासित किया । इस विधियों के लेख में, हम नैदानिक परीक्षण में सेंगर अनुक्रमण, आरटी-पीसीआर और पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग करके डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति के आणविक लक्षण वर्णन को प्रस्तुत करते हैं। डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन प्रभावकारिता दिखाने के लिए अध्ययन में मौलिक था क्योंकि कोई कार्यात्मक परिणाम परीक्षण नहीं किए गए थे।
ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) एक अपक्षयी मांसपेशियों की बीमारी है जिससे मांसपेशियों में उत्तरोत्तर हानि, श्वसन विफलता और कार्डियोमायोपैथी होती है, और इससे अकाल मृत्यु हो जाती है1। यह रोग बड़ी संरचनात्मक मांसपेशी प्रोटीन डिस्ट्रोफिन2की कमी के कारण होता है । एक्स-क्रोमोसोम पर डीएमडी-जीन में उत्परिवर्तन अप्रभावी होते हैं, और यह रोग 3500-5000 नवजात पुरुषों में 1 को प्रभावित करता है3,,4,,5। उत्परिवर्तन अक्सर एक्सन्स 44 और 55 के बीच एक हॉटस्पॉट क्षेत्र में बड़े विलोपन होते हैं जो विकृत पढ़ने के फ्रेम और समय से पहले स्टॉप कोडन का कारण बनते हैं, जिससे बकवास-मध्यस्थता क्षय होता है और डिस्ट्रॉफिन,प्रोटीन6,,7,8की लगभग कुल कमी होती है। एंटीसेंस ओलिगोन्यूक्लियोटिड्स (एओएन) का उपयोग करके रीडिंग फ्रेम को ठीक किया जा सकता है जो एक्सोन लंघन को प्रेरित करता है और पढ़ने के फ्रेम को बहाल करता है, आंशिक रूप से डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति को बहाल करता है और रोग प्रगति9,10, 11,11में देरी करता है।, मॉर्फोलिनो एओन eteplirsen, जो हाल ही में संघीय दवा एजेंसी (एफडीए) द्वारा अनुमोदित किया गया था, exon ५१ के लंघन लाती है और exon ५२ विलोपन12, 13,13के साथ रोगियों में पढ़ने के फ्रेम बहाल कर सकते हैं । हालांकि, एक्सोन 53 लंघन 52 विलोपन वाले रोगियों के लिए पढ़ने के फ्रेम को पुनर्स्थापित करता है, और यह संभवतः डीएमडी रोगियों के लगभग 10% का इलाज कर सकता है14। मॉर्फोलिनो एऑन दवा एनएस-065/एनसीएनपी-01 को मानव कोशिकाओं में ५३ लंघन को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है, और हमने हाल ही में डीएमडी रोगियों को एक चरण 1 ओपन-लेबल खुराक-एस्केलेशन नैदानिक परीक्षण (इसके बाद, “अध्ययन” के रूप में संदर्भित) (यूमिन के रूप में पंजीकृत: 000010964 और ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14 में एनएस-065/एनसीएनपी-01प्रशासित किया। अध्ययन में पश्चिमी ब्लॉटिंग के आधार पर आरटी-पीसीआर और डिस्ट्रोफिन प्रोटीन के स्तर के आधार पर एक्सोन ५३ लंघन की खुराक पर निर्भर वृद्धि दिखाई गई, और कोई गंभीर प्रतिकूल दवा घटनाओं या ड्रॉपआउट14को नहीं देखा गया ।
सभी नैदानिक परीक्षणों में, परिणामों का विश्लेषण सर्वोपरि महत्व का है । डीएमडी नैदानिक परीक्षणों के लिए, उपचार लाभ दिखाने के लिए सबसे अच्छी विधि के बारे में अभी भी एक बहस चल रही है। 6 मिनट के वॉक टेस्ट जैसे क्लीनिकल टेस्ट में कुछ कमियां होती हैं । डिस्ट्रोफिन अभिव्यक्ति का आणविक लक्षण वर्णन आरटी-पीसीआर, क्यूपीसीआर, डिजिटल-पीसीआर, पश्चिमी ब्लॉटिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे कई तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है। हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति बहाली की सीमा है कि एक नैदानिक लाभ प्रदान करने के लिए आवश्यक है अस्पष्ट रहता है । इस तरीके लेख में, हम विस्तार से आरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग तरीकों का वर्णन करते हैं, जो क्रमशः एऑन लंघन दवा एनएस-065/एनसीएनपी-0114के चरण 1 परीक्षण में, क्रमशः exon लंघन और प्रोटीन के स्तर को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।
डीएमडी के नैदानिक परीक्षणों ने पिछले कुछ वर्षों में सफलताओं और विफलताओं दोनों का उत्पादन किया है। दोनों आरटी-पीसीआर और पश्चिमी दाग रोगियों को प्रशासित exon-लंघन यौगिकों द्वारा उत्पन्न लंघन दक्षता का आकलन करने के लिए आम तकनीक हैं । हालांकि, आरटी-पीसीआर को डिजिटल पीसीआर15की तुलना में लंघन दक्षता का अधिक अनुमान लगाने के लिए सूचित किया गया है । हालांकि यह कई कारणों से है, यह मुख्य रूप से पीसीआर चक्रों के दौरान छोटे छोड़े गए टुकड़ों के अधिक कुशल प्रवर्धन के कारण होता है। ऐसा लगता है कि इस नैदानिक परीक्षण में उपयोग की जाने वाली आरटी-पीसीआर ने पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा अनुमानित प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना में उच्च लंघन क्षमता भी उत्पन्न की। एफडीए के अनुसार, यह डिस्ट्रोफिन बहाली12की मात्रा निर्धारित करने का एक अधिक विश्वसनीय तरीका है। इसलिए, आरटी-पीसीआर लंघन परिणामों की व्याख्या करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए; हालांकि नमूनों की तुलना अभी भी की जा सकती है। आरटी-पीसीआर परिणामों के आधार पर उच्च लंघन क्षमता दिखाने वाले नमूने आमतौर पर पश्चिमी दाग विश्लेषणों में उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को अत्यधिक करते हैं ।
चूंकि डीएमडी नैदानिक परीक्षणों में सभी रोगियों के पास एक ही विलोपन पैटर्न नहीं है, इसलिए सभी नमूनों पर डिजिटल या क्यूपीसीआर करने के लिए पर्याप्त रूप से विशिष्ट प्राइमर और जांच डिजाइन करना मुश्किल हो सकता है। इसलिए, आरटी-पीसीआर अभी भी लंघन दक्षता के पहले आकलन के लिए एक अच्छा विकल्प है। एनएस-065/एनसीएनपी-01 का नैदानिक परीक्षण शुरू होने से पहले, विट्रो में प्रत्येक रोगी के लिए लंघन दक्षता का आकलन करना थकाऊ था क्योंकि रोगी-विशिष्ट मायोब्लास्ट उत्पन्न करने के लिए या तो मांसपेशी या त्वचा बायोप्सी अनिवार्य थी । हालांकि, हमने हाल ही में एक उपन्यास डीएमडी मांसपेशी कोशिका मॉडल16के रूप में रोगी-विशिष्ट MYOD1-परिवर्तित, मूत्र व्युत्पन्न कोशिकाओं (यूडीसी) को उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास तकनीक प्रकाशित की है। इस प्रकार, केवल रोगी से एकत्र मूत्र को मायोब्लास्ट उत्पन्न करने की आवश्यकता होती है, और कोई आक्रामक प्रक्रिया आवश्यक नहीं है। हमारा मानना है कि इस विधि का उपयोग रोगी-विशिष्ट कोशिकाओं में विभिन्न एओएन को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रोगी के किसी भी नैदानिक परीक्षण शुरू होने से पहले विभिन्न प्राइमर और जांच का परीक्षण किया जा सकता है। यह भविष्य में डीएमडी नैदानिक परीक्षणों में माप को छुड़ाने के लिए क्यूपीसीआर या डिजिटल पीसीआर के उपयोग की सुविधा प्रदान कर सकता है।
इस नैदानिक परीक्षण में पश्चिमी दाग विश्लेषण करने के लिए, डिस्ट्रॉफिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, और संदर्भ नमूने के रूप में केवल एक स्वस्थ नियंत्रण का उपयोग किया गया था। इसलिए, एंटीबॉडी की विशिष्टता को उचित रूप से मान्य नहीं किया गया था। यह, इस तथ्य के साथ कि एंटीबॉडी केवल डिस्ट्रॉफिन के सी-टर्मिनल डोमेन को मान्यता देता है, प्रोटोकॉल की एक सीमा है। डिस्ट्रोफिन अणु के विभिन्न डोमेन के खिलाफ निर्देशित अधिक स्वस्थ नियंत्रण और एंटीबॉडी भविष्य में सलाह दी जाती है।
यहां, हमने उन प्रोटोकॉलों का सारांश दिया जिनका उपयोग हाल ही में अन्वेषणात्मक अन्वेषक द्वारा शुरू किए गए, एनएस-065/एनसीएनपी-01 के पहले मानव परीक्षण में किया गया था । एनएस-065/एनसीएनपी-01 संभावित रूप से डीएमडी के साथ 10.1% रोगियों पर लागू होता है।
The authors have nothing to disclose.
हम वैज्ञानिक चर्चा के लिए डॉ ताकाशी साइको, डॉ तेत्सुया नागाटा, श्री सातोशी मसुदा और डॉ एरी तासिता के आभारी हैं ।
100 bp DNA Ladder | Takara | 3407A | marker solution for MultiNA |
1mol/l-Tris-HCl Buffer Solution(pH 7.6) | Nacalai | 35436-01 | |
2-mercaptoethanol | Nacalai | 21418-42 | |
2-Methylbutane (Isopentane) | Sigma-Aldrich | 15-2220 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352235 | |
6× Loading Buffer | Takara | 9156 | |
Agarose ME | Iwai chemical | 50013R | |
Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer | Applied Biosystems | A41046 | |
BD Matrigel Matrix | BD Biosciences | 356234 | |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Bromophenol blue | Nacalai | 05808-61 | |
Centri-Sep 96-Well Plates | Applied Biosystems | 4367819 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DMEM/F-12 | Gibco | 11320033 | |
ECL Prime Blocking Reagent | GE healthcare | RPN418 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | |
Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | |
Experion Automated Electrophoresis Station | Bio-Rad | 7007010 | Microchip electrophoresis system A |
Experion DNA 1K Analysis Kit for 10 Chips | Bio-Rad | 7007107JA | |
Experion Priming Station | Bio-Rad | 7007030 | |
Experion Vortex Station II | Bio-Rad | 7007043 | |
Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | |
EzBlot | Atto | AE-1460 | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41003 | |
glass vial | Iwaki | 1880 SV20 | |
Glycerol | Nacalai | 17045-65 | |
Histofine Simple Stain MAX PO | Nichirei | 424151 | |
Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
Immobilon-P Transfer Membrane | Millipore | IPVH304F0 | |
ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | |
MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis system B |
Multiplate 96-Well PCR Plates | Bio-Rad | mlp9601 | |
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin (C-terminus) | Leica biosystems | NCL-DYS2 | |
NovocastraTM Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Spectrin | Leica biosystems | NCL-SPEC1 | |
NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | |
NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | |
NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | |
NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | |
Oriole Fluorescent Gel Stain | Bio-Rad | 1610496 | |
PBS | Gibco | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin Solution Stabilized | Sigma-Aldrich | P4458 | |
Physcotron Handy micro-homogenizer | MICROTEC | NS-310E3 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
Propidium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 556463 | |
QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | |
RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit | Qiagen | 74704 | |
SDS | Nacalai | 31606-75 | |
Semi-dry transfer machine | Bio Craft | 41-1293 | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S11494 | for MultiNA |
TAE Buffer | Nacalai | 35430-61 | |
Tragacanth Gum | Wako | 200-02245 | |
Tris-EDTA Buffer | Nippon Gene | 316-90025 | for MultiNA |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Urea | Nacalai | 35907-15 | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 |