Vi presenterer en analyse for enkel kvantifisering av metaller introdusert til prøver utarbeidet ved hjelp av immobilisert metall affinitet kromatografi. Metoden bruker hydroxynaphthol blå som fargemetrisk metall indikator og en UV-Vis spektrofotometer som detektoren.
Forurensning av enzymer med metaller som utvasket fra immobilisert av metall affinitet kromatografi (IMAC), utgjør en stor bekymring for enzymologists, ettersom mange av de felles di-og trivalent spesifikasjoner som brukes i IMAC-harpiks, har en hemmende effekt på enzymer. Omfanget av metall utvasking og virkningen av ulike tent og reduksjon av reagenser er imidlertid dårlig forstått i stor grad på grunn av fravær av enkle og praktiske overgangs metall kvantifisering protokoller som bruker utstyr som vanligvis er tilgjengelig i biokjemi laboratorier. For å løse dette problemet har vi utviklet en protokoll for raskt å kvantifisere mengden av metall forurensning i prøver som er klargjort ved hjelp av IMAC som et rense trinn. Metoden bruker hydroxynaphthol blå (HNB) som en fargemetrisk indikator for innholdet i en prøve løsning og UV-Vis spektroskopi som et middel for å kvantifisere mengden av metall til stede, i nanomolar rekkevidde, basert på endringen i HNB spektrum ved 647 NM. Mens metall innhold i en løsning har historisk blitt bestemt ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi eller Induktivt kombinert plasma teknikker, disse metodene krever spesialisert utstyr og opplæring utenfor omfanget av en typisk biokjemi laboratorium. Metoden foreslått her gir en enkel og rask måte for Biokjemikere å bestemme metall innhold av prøver å bruke eksisterende utstyr og kunnskap uten å ofre nøyaktighet.
Siden oppstarten av Sellbom og medarbeidere1, immobilisert metall affinitet KROMATOGRAFI (iMac) har blitt en metode for valg å raskt skille proteiner basert på deres evne til å obligasjonslån med overgangen metall ioner som Zn2 +, ni2 +, Cu2 +, og co2 +. Dette er vanligvis gjøres via konstruert Poly-histidin koder og er nå en av de vanligste kromatografiske rensing teknikker for isolering av rekombinant proteiner2. IMac har også funnet programmer utover rekombinant protein rensing som en måte å isolere kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider og β-lactams for mat sample analyse3 og som et skritt i å identifisere blod-serum protein markører for lever og bukspyttkjertelen kreft4,5. Ikke overraskende har iMac også blitt en metode for valg for isolering av en rekke innfødte bioenergi enzymer6,7,8,9,10. Imidlertid er vellykket gjennomføring av disse rensing metoder for studier på enzymatisk aktive bioenergetisk proteiner avhengig av tilstedeværelsen av ubetydelige nivåer av metall utvasket fra kolonnen matrisen inn i eluatet. Det divalent metallet som vanligvis brukes i iMac, har kjent patologisk biologisk betydning, selv ved lave konsentrasjoner11,12. Den fysiologiske effekten av disse metaller er mest uttalt i bioenergetisk systemer, hvor de kan bevise dødelige som hemmere av Cellular åndedrett eller fotosyntese13,14,15. Lignende problemer er uunngåelig for flertallet av protein klasser der rester av forurensende metaller kan forstyrre protein biologiske funksjoner eller karakterisering med biokjemiske og Biofysiske teknikker.
Mens nivåene av metall forurensning under oksiderende forhold og bruke imidazole som en eluant er vanligvis lav16, protein isolasjoner utført i nærvær av cystein reduksjonsmidler (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) eller med sterkere chelater som histidin17,18 eller ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) resultere i mye høyere nivåer av metall forurensning19,20. På lignende måte, siden metallisk ioner inne IMAC harpikser er hyppig koordinert av kar bok syls holdene, protein elutions utført under syrlig vilkårene er likeledes sikkert å ha mange høyere høyder av metallisk forurense. Metall innhold i løsninger kan vurderes ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi (AAS) og Induktivt kombinert plasma-Mass massespektrometri (ICP-MS) ned til en grense for påvisning i ppb-PPT-området21,22,23,24. Dessverre, AAS og ICP-MS er ikke realistiske midler for påvisning i en tradisjonell biokjemi Lab som disse metodene vil kreve tilgang til spesialisert utstyr og opplæring.
Tidligere arbeidav Brittain undersøkte bruken av hydroxynaphthol Blue (HNB) som en måte å identifisere tilstedeværelsen av overgangen metaller i løsningen. Det var imidlertid flere interne motsetninger i dataene20 og disse verkene klarte ikke å tilby en tilstrekkelig protokoll. Studerer ved Temel et al.27 and Ferreira et al.28 utvidet på Brittain arbeid med HNB som en potensiell metall indikator. Men Temel utviklet en protokoll som gjør bruk av AAS for prøveanalyse, ved hjelp av HNB bare som en chelaterande agent. Ferreira studie brukte endringen i HNB absorbansen Spectra kl 563 NM, en region av fri-Dye HNB Spectra som overlapper tungt med Spectra av HNB-metall komplekser ved pH 5,7, noe som gjør analysen følsomheten ganske lav, samt resulterer i relativt svakt metall bindende affinitet20. For å løse problemer i vår egen Lab med ni2 + utvasking fra iMac, har vi utvidet arbeidet gjort av Brittain25,26 og Ferreria28 for å utvikle en enkel analysen i stand til å oppdage nanomolar nivåer av flere overgangs metaller. Vi viste at HNB binder nikkel og andre vanlige for IMAC metaller med sub-nanomolar bindende slektskap og danne 1:1 kompleks over et bredt spekter av pH-verdier20. Analysen rapporteres her er basert på disse funnene og utnytter absorbansen endringer i HNB spektrum på 647 NM for metall kvantifisering. Analysen kan utføres i Fysiologiske pH-området ved hjelp av vanlige buffere og instrumentering som finnes i en typisk biokjemi Lab ved hjelp av fargemetrisk deteksjon og kvantifisering av metall-Dye komplekser og tilhørende endring i absorbansen av fri-Dye når det binder seg til metall.
Fargemetrisk deteksjon av metaller ved hjelp HNB gir en enkel måte å kvantifisere graden av protein forurensning av overgangen metall ioner fra IMAC harpiks. Som vi etablert i REF. 20, ni2 + binder seg til HNB med 1:1 støkiometri og dissosiasjon konstant for ni-HNB komplekse endringer med pH. Komplekset Kd er imidlertid i sub-nM-serien for alle anbefalte (7-12) pH-verdier. I praksis betyr det at alle ni2 + i alle testede fraksjoner vil BINDE til HNB så lenge ingen andre sterke chelate…
The authors have nothing to disclose.
Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant MCB-1817448 og av en pris fra Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, forvalter og spesifisert donor Hazel Thorpe Carman og George Gay Carman Stoler.
2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |