Kvantifisering av metall utvasking i immobilisert metal affinitet kromatografi

Summary

Vi presenterer en analyse for enkel kvantifisering av metaller introdusert til prøver utarbeidet ved hjelp av immobilisert metall affinitet kromatografi. Metoden bruker hydroxynaphthol blå som fargemetrisk metall indikator og en UV-Vis spektrofotometer som detektoren.

Abstract

Forurensning av enzymer med metaller som utvasket fra immobilisert av metall affinitet kromatografi (IMAC), utgjør en stor bekymring for enzymologists, ettersom mange av de felles di-og trivalent spesifikasjoner som brukes i IMAC-harpiks, har en hemmende effekt på enzymer. Omfanget av metall utvasking og virkningen av ulike tent og reduksjon av reagenser er imidlertid dårlig forstått i stor grad på grunn av fravær av enkle og praktiske overgangs metall kvantifisering protokoller som bruker utstyr som vanligvis er tilgjengelig i biokjemi laboratorier. For å løse dette problemet har vi utviklet en protokoll for raskt å kvantifisere mengden av metall forurensning i prøver som er klargjort ved hjelp av IMAC som et rense trinn. Metoden bruker hydroxynaphthol blå (HNB) som en fargemetrisk indikator for innholdet i en prøve løsning og UV-Vis spektroskopi som et middel for å kvantifisere mengden av metall til stede, i nanomolar rekkevidde, basert på endringen i HNB spektrum ved 647 NM. Mens metall innhold i en løsning har historisk blitt bestemt ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi eller Induktivt kombinert plasma teknikker, disse metodene krever spesialisert utstyr og opplæring utenfor omfanget av en typisk biokjemi laboratorium. Metoden foreslått her gir en enkel og rask måte for Biokjemikere å bestemme metall innhold av prøver å bruke eksisterende utstyr og kunnskap uten å ofre nøyaktighet.

Introduction

Siden oppstarten av Sellbom og medarbeidere¹, immobilisert metall affinitet KROMATOGRAFI (iMac) har blitt en metode for valg å raskt skille proteiner basert på deres evne til å obligasjonslån med overgangen metall ioner som Zn^{2 +}, ni^{2 +}, Cu^{2 +}, og co^{2 +}. Dette er vanligvis gjøres via konstruert Poly-histidin koder og er nå en av de vanligste kromatografiske rensing teknikker for isolering av rekombinant proteiner². IMac har også funnet programmer utover rekombinant protein rensing som en måte å isolere kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider og β-lactams for mat sample analyse³ og som et skritt i å identifisere blod-serum protein markører for lever og bukspyttkjertelen kreft^4,5. Ikke overraskende har iMac også blitt en metode for valg for isolering av en rekke innfødte bioenergi enzymer^6,7,8,9,10. Imidlertid er vellykket gjennomføring av disse rensing metoder for studier på enzymatisk aktive bioenergetisk proteiner avhengig av tilstedeværelsen av ubetydelige nivåer av metall utvasket fra kolonnen matrisen inn i eluatet. Det divalent metallet som vanligvis brukes i iMac, har kjent patologisk biologisk betydning, selv ved lave konsentrasjoner^11,12. Den fysiologiske effekten av disse metaller er mest uttalt i bioenergetisk systemer, hvor de kan bevise dødelige som hemmere av Cellular åndedrett eller fotosyntese^13,14,15. Lignende problemer er uunngåelig for flertallet av protein klasser der rester av forurensende metaller kan forstyrre protein biologiske funksjoner eller karakterisering med biokjemiske og Biofysiske teknikker.

Mens nivåene av metall forurensning under oksiderende forhold og bruke imidazole som en eluant er vanligvis lav¹⁶, protein isolasjoner utført i nærvær av cystein reduksjonsmidler (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) eller med sterkere chelater som histidin^17,18 eller ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) resultere i mye høyere nivåer av metall forurensning^19,20. På lignende måte, siden metallisk ioner inne IMAC harpikser er hyppig koordinert av kar bok syls holdene, protein elutions utført under syrlig vilkårene er likeledes sikkert å ha mange høyere høyder av metallisk forurense. Metall innhold i løsninger kan vurderes ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi (AAS) og Induktivt kombinert plasma-Mass massespektrometri (ICP-MS) ned til en grense for påvisning i ppb-PPT-området^21,22,23,24. Dessverre, AAS og ICP-MS er ikke realistiske midler for påvisning i en tradisjonell biokjemi Lab som disse metodene vil kreve tilgang til spesialisert utstyr og opplæring.

Tidligere arbeid^{av Brittain undersøkte} bruken av hydroxynaphthol Blue (HNB) som en måte å identifisere tilstedeværelsen av overgangen metaller i løsningen. Det var imidlertid flere interne motsetninger i dataene²⁰ og disse verkene klarte ikke å tilby en tilstrekkelig protokoll. Studerer ved Temel et al.²⁷ and Ferreira et al.²⁸ utvidet på Brittain arbeid med HNB som en potensiell metall indikator. Men Temel utviklet en protokoll som gjør bruk av AAS for prøveanalyse, ved hjelp av HNB bare som en chelaterande agent. Ferreira studie brukte endringen i HNB absorbansen Spectra kl 563 NM, en region av fri-Dye HNB Spectra som overlapper tungt med Spectra av HNB-metall komplekser ved pH 5,7, noe som gjør analysen følsomheten ganske lav, samt resulterer i relativt svakt metall bindende affinitet²⁰. For å løse problemer i vår egen Lab med ni^{2 +} utvasking fra iMac, har vi utvidet arbeidet gjort av Brittain^25,26 og Ferreria²⁸ for å utvikle en enkel analysen i stand til å oppdage nanomolar nivåer av flere overgangs metaller. Vi viste at HNB binder nikkel og andre vanlige for IMAC metaller med sub-nanomolar bindende slektskap og danne 1:1 kompleks over et bredt spekter av pH-verdier²⁰. Analysen rapporteres her er basert på disse funnene og utnytter absorbansen endringer i HNB spektrum på 647 NM for metall kvantifisering. Analysen kan utføres i Fysiologiske pH-området ved hjelp av vanlige buffere og instrumentering som finnes i en typisk biokjemi Lab ved hjelp av fargemetrisk deteksjon og kvantifisering av metall-Dye komplekser og tilhørende endring i absorbansen av fri-Dye når det binder seg til metall.

Protocol

1. analyse komponenten forberedelse Bestem kromatografi fraksjoner som skal analyseres ved hjelp av optiske absorbansen på 280 NM eller alternative metoder for protein kvantifisering å identifisere proteinet beriket fraksjoner.Merk: for dette arbeidet, brukte vi en diode array UV-Vis spektrofotometer. For å øke gjennomstrømningen kan det brukes en plate leser i stand til å måle UV-Vis-absorbansen. Utarbeidelse av nødvendige analysen komponenter Forbered eller Skaff 10-100 mM buffer…

Representative Results

Spekteret av gratis HNB på nøytral pH (svart linje) og representative Spectra av fraksjoner analyseres for ni2 + fra isolering av MSP1E3D129 er vist i figur 2. En vellykket analysen serien skal demonstrere en redusert absorbansen på 647 NM i forhold til HNB kontroll, som tilsvarer dannelsen av HNB komplekser i nærvær av en overgang metall. En mislykket analysen ville være indikert med en økning i absorbansen ved 647 NM. Alternativt mer enn 90% nedgan…

Discussion

Fargemetrisk deteksjon av metaller ved hjelp HNB gir en enkel måte å kvantifisere graden av protein forurensning av overgangen metall ioner fra IMAC harpiks. Som vi etablert i REF. 20, ni^{2 +} binder seg til HNB med 1:1 støkiometri og dissosiasjon konstant for ni-HNB komplekse endringer med pH. Komplekset K_d er imidlertid i sub-nM-serien for alle anbefalte (7-12) pH-verdier. I praksis betyr det at alle ni^{2 +} i alle testede fraksjoner vil BINDE til HNB så lenge ingen andre sterke chelate…

Materials

2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500