Summary

Kvantifisering av metall utvasking i immobilisert metal affinitet kromatografi

Published: January 17, 2020
doi:

Summary

Vi presenterer en analyse for enkel kvantifisering av metaller introdusert til prøver utarbeidet ved hjelp av immobilisert metall affinitet kromatografi. Metoden bruker hydroxynaphthol blå som fargemetrisk metall indikator og en UV-Vis spektrofotometer som detektoren.

Abstract

Forurensning av enzymer med metaller som utvasket fra immobilisert av metall affinitet kromatografi (IMAC), utgjør en stor bekymring for enzymologists, ettersom mange av de felles di-og trivalent spesifikasjoner som brukes i IMAC-harpiks, har en hemmende effekt på enzymer. Omfanget av metall utvasking og virkningen av ulike tent og reduksjon av reagenser er imidlertid dårlig forstått i stor grad på grunn av fravær av enkle og praktiske overgangs metall kvantifisering protokoller som bruker utstyr som vanligvis er tilgjengelig i biokjemi laboratorier. For å løse dette problemet har vi utviklet en protokoll for raskt å kvantifisere mengden av metall forurensning i prøver som er klargjort ved hjelp av IMAC som et rense trinn. Metoden bruker hydroxynaphthol blå (HNB) som en fargemetrisk indikator for innholdet i en prøve løsning og UV-Vis spektroskopi som et middel for å kvantifisere mengden av metall til stede, i nanomolar rekkevidde, basert på endringen i HNB spektrum ved 647 NM. Mens metall innhold i en løsning har historisk blitt bestemt ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi eller Induktivt kombinert plasma teknikker, disse metodene krever spesialisert utstyr og opplæring utenfor omfanget av en typisk biokjemi laboratorium. Metoden foreslått her gir en enkel og rask måte for Biokjemikere å bestemme metall innhold av prøver å bruke eksisterende utstyr og kunnskap uten å ofre nøyaktighet.

Introduction

Siden oppstarten av Sellbom og medarbeidere1, immobilisert metall affinitet KROMATOGRAFI (iMac) har blitt en metode for valg å raskt skille proteiner basert på deres evne til å obligasjonslån med overgangen metall ioner som Zn2 +, ni2 +, Cu2 +, og co2 +. Dette er vanligvis gjøres via konstruert Poly-histidin koder og er nå en av de vanligste kromatografiske rensing teknikker for isolering av rekombinant proteiner2. IMac har også funnet programmer utover rekombinant protein rensing som en måte å isolere kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider og β-lactams for mat sample analyse3 og som et skritt i å identifisere blod-serum protein markører for lever og bukspyttkjertelen kreft4,5. Ikke overraskende har iMac også blitt en metode for valg for isolering av en rekke innfødte bioenergi enzymer6,7,8,9,10. Imidlertid er vellykket gjennomføring av disse rensing metoder for studier på enzymatisk aktive bioenergetisk proteiner avhengig av tilstedeværelsen av ubetydelige nivåer av metall utvasket fra kolonnen matrisen inn i eluatet. Det divalent metallet som vanligvis brukes i iMac, har kjent patologisk biologisk betydning, selv ved lave konsentrasjoner11,12. Den fysiologiske effekten av disse metaller er mest uttalt i bioenergetisk systemer, hvor de kan bevise dødelige som hemmere av Cellular åndedrett eller fotosyntese13,14,15. Lignende problemer er uunngåelig for flertallet av protein klasser der rester av forurensende metaller kan forstyrre protein biologiske funksjoner eller karakterisering med biokjemiske og Biofysiske teknikker.

Mens nivåene av metall forurensning under oksiderende forhold og bruke imidazole som en eluant er vanligvis lav16, protein isolasjoner utført i nærvær av cystein reduksjonsmidler (DTT, β-mercaptoethanol, etc.) eller med sterkere chelater som histidin17,18 eller ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) resultere i mye høyere nivåer av metall forurensning19,20. På lignende måte, siden metallisk ioner inne IMAC harpikser er hyppig koordinert av kar bok syls holdene, protein elutions utført under syrlig vilkårene er likeledes sikkert å ha mange høyere høyder av metallisk forurense. Metall innhold i løsninger kan vurderes ved hjelp av Atomic absorpsjon spektroskopi (AAS) og Induktivt kombinert plasma-Mass massespektrometri (ICP-MS) ned til en grense for påvisning i ppb-PPT-området21,22,23,24. Dessverre, AAS og ICP-MS er ikke realistiske midler for påvisning i en tradisjonell biokjemi Lab som disse metodene vil kreve tilgang til spesialisert utstyr og opplæring.

Tidligere arbeidav Brittain undersøkte bruken av hydroxynaphthol Blue (HNB) som en måte å identifisere tilstedeværelsen av overgangen metaller i løsningen. Det var imidlertid flere interne motsetninger i dataene20 og disse verkene klarte ikke å tilby en tilstrekkelig protokoll. Studerer ved Temel et al.27 and Ferreira et al.28 utvidet på Brittain arbeid med HNB som en potensiell metall indikator. Men Temel utviklet en protokoll som gjør bruk av AAS for prøveanalyse, ved hjelp av HNB bare som en chelaterande agent. Ferreira studie brukte endringen i HNB absorbansen Spectra kl 563 NM, en region av fri-Dye HNB Spectra som overlapper tungt med Spectra av HNB-metall komplekser ved pH 5,7, noe som gjør analysen følsomheten ganske lav, samt resulterer i relativt svakt metall bindende affinitet20. For å løse problemer i vår egen Lab med ni2 + utvasking fra iMac, har vi utvidet arbeidet gjort av Brittain25,26 og Ferreria28 for å utvikle en enkel analysen i stand til å oppdage nanomolar nivåer av flere overgangs metaller. Vi viste at HNB binder nikkel og andre vanlige for IMAC metaller med sub-nanomolar bindende slektskap og danne 1:1 kompleks over et bredt spekter av pH-verdier20. Analysen rapporteres her er basert på disse funnene og utnytter absorbansen endringer i HNB spektrum på 647 NM for metall kvantifisering. Analysen kan utføres i Fysiologiske pH-området ved hjelp av vanlige buffere og instrumentering som finnes i en typisk biokjemi Lab ved hjelp av fargemetrisk deteksjon og kvantifisering av metall-Dye komplekser og tilhørende endring i absorbansen av fri-Dye når det binder seg til metall.

Protocol

1. analyse komponenten forberedelse Bestem kromatografi fraksjoner som skal analyseres ved hjelp av optiske absorbansen på 280 NM eller alternative metoder for protein kvantifisering å identifisere proteinet beriket fraksjoner.Merk: for dette arbeidet, brukte vi en diode array UV-Vis spektrofotometer. For å øke gjennomstrømningen kan det brukes en plate leser i stand til å måle UV-Vis-absorbansen. Utarbeidelse av nødvendige analysen komponenter Forbered eller Skaff 10-100 mM buffer…

Representative Results

Spekteret av gratis HNB på nøytral pH (svart linje) og representative Spectra av fraksjoner analyseres for ni2 + fra isolering av MSP1E3D129 er vist i figur 2. En vellykket analysen serien skal demonstrere en redusert absorbansen på 647 NM i forhold til HNB kontroll, som tilsvarer dannelsen av HNB komplekser i nærvær av en overgang metall. En mislykket analysen ville være indikert med en økning i absorbansen ved 647 NM. Alternativt mer enn 90% nedgan…

Discussion

Fargemetrisk deteksjon av metaller ved hjelp HNB gir en enkel måte å kvantifisere graden av protein forurensning av overgangen metall ioner fra IMAC harpiks. Som vi etablert i REF. 20, ni2 + binder seg til HNB med 1:1 støkiometri og dissosiasjon konstant for ni-HNB komplekse endringer med pH. Komplekset Kd er imidlertid i sub-nM-serien for alle anbefalte (7-12) pH-verdier. I praksis betyr det at alle ni2 + i alle testede fraksjoner vil BINDE til HNB så lenge ingen andre sterke chelate…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette materialet er basert på arbeid støttet av National Science Foundation under Grant MCB-1817448 og av en pris fra Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, forvalter og spesifisert donor Hazel Thorpe Carman og George Gay Carman Stoler.

Materials

2xYT broth Fisher Scientific BP9743-500 media for E.coli growth
HEPES, free acid BioBasic HB0264 alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin Thermo Scientific 88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt Sigma-Aldrich 219916-5g
Imidazole Fisher Scientific O3196-500
Imidazole BioBasic IB0277
MOPS, free acid BioBasic MB0360 alternative buffer
Sodium chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium phosphate Fisher Scientific S369-500 alternative buffer
Tricine Gold Bio T870-100
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500

References

  1. Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  2. Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  3. Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
  4. Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
  5. Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
  6. Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
  7. Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
  8. Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
  9. Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
  10. Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
  11. Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
  12. Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
  13. Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
  14. Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
  15. Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
  16. Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
  17. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
  18. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
  19. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  20. Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
  21. Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
  22. Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
  23. Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
  24. Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
  25. Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
  26. Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
  27. Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
  28. Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
  29. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  30. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
  31. Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
  32. Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
  33. Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
  34. Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
  35. Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).

Play Video

Cite This Article
Swaim, C. M., Brittain, T. J., Marzolf, D. R., Kokhan, O. Quantification of Metal Leaching in Immobilized Metal Affinity Chromatography. J. Vis. Exp. (155), e60690, doi:10.3791/60690 (2020).

View Video