स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी में धातु लीचिंग का परिमाणीकरण
Summary
हम स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करतैयार नमूनों के लिए शुरू की धातुओं के आसान मात्राकरण के लिए एक परख पेश करते हैं । विधि कोलोरीमेट्रिक मेटल इंडिकेटर और डिटेक्टर के रूप में यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथॉल ब्लू का उपयोग करती है।
Abstract
स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) स्तंभों से लीच धातुओं के साथ एंजाइमों का संदूषण एंजाइमों के लिए एक बड़ी चिंता का विषय बन गया है, क्योंकि आईमैक रेजिन में उपयोग किए जाने वाले कई आम डी-और ट्राइवेलेंट कॉइन एंजाइमों पर अवरोधक प्रभाव डालते हैं। हालांकि, धातु लीचिंग की सीमा और विभिन्न eluting के प्रभाव और अभिकर्मकों को कम करने के लिए सरल और व्यावहारिक संक्रमण धातु क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग की अनुपस्थिति के कारण बड़े हिस्से में खराब समझ रहे है बायोकेमिस्ट्री लैब। इस समस्या के समाधान के लिए, हमने एक शुद्धि कदम के रूप में आईमैक का उपयोग करके तैयार नमूनों में धातु संदूषण की मात्रा को जल्दी से निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। विधि 647 एनएम पर एचएनबी स्पेक्ट्रम में परिवर्तन के आधार पर, नैनोमोलर रेंज में धातु की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के साधन के रूप में एक नमूना समाधान में धातु cation सामग्री के लिए एक रंगीन संकेतक के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथॉल ब्लू (एचएनबी) का उपयोग करती है। जबकि एक समाधान में धातु सामग्री ऐतिहासिक रूप से परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी या प्रेरक प्लाज्मा तकनीकों का उपयोग करके निर्धारित की गई है, इन तरीकों को एक विशिष्ट जैव रसायन प्रयोगशाला के दायरे के बाहर विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तावित विधि बायोकेमिस्टों के लिए सटीकता का त्याग किए बिना मौजूदा उपकरणों और ज्ञान का उपयोग करके नमूनों की धातु सामग्री निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करती है।
Introduction
पोरथ और सहकर्मियों द्वारा अपनी स्थापना के बाद से1,स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) जेडएन2 +, नी2 +,सीयू2 +और सीओ 2+जैसे संक्रमण धातु आयनों के साथ संबंध बनाने की उनकी क्षमता के आधार पर प्रोटीन को जल्दी से अलग करने के लिए पसंद की एक विधि बन गई है। यह सबसे अधिक इंजीनियर पॉली-हिस्टीडीन टैग के माध्यम से किया जाता है और अब पुनः संयोजन प्रोटीन2के अलगाव के लिए सबसे आम क्रोमेटोग्राफिक शुद्धिकरण तकनीकों में से एक है। आईमैक ने क्विनोलोन, टेट्रासाइक्लिन, अमीनोग्लिकोसाइड्स, मैक्रोलिड्स और फूड सैंपल एनालिसिस3 के लिए और लिवर और अग्नाशय के कैंसर4,5के लिए रक्त-सीरम प्रोटीन मार्कर की पहचान करने में एक कदम के रूप में रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन शुद्धि से परे अनुप्रयोगों को भी पाया है । आश्चर्य नहीं कि आईमैक कई देशी बायोएनर्जेटिकएंजाइम6,7,8,9,10के अलगाव के लिए पसंद की एक विधि भी बन गई है। हालांकि, एंजाइमैटिक रूप से सक्रिय बायोएनर्जेटिक प्रोटीन पर अध्ययन के लिए इन शुद्धिकरण विधियों का सफल कार्यान्वयन स्तंभ मैट्रिक्स से एल्यूएट में लीच किए गए धातु के एनेक्स के नगण्य स्तरों की उपस्थिति पर निर्भर करता है। आमतौर पर आईमैक में उपयोग किए जाने वाले डाइवेलेंट धातु के नेस में पैथोलॉजिकल जैविक महत्व को जाना जाता है, यहां तक कि कम सांद्रता11,12पर भी। इन धातुओं का शारीरिक प्रभाव जैव ऊर्जावान प्रणालियों में सबसे अधिक स्पष्ट है, जहां वे सेलुलर श्वसन या प्रकाश संश्लेषण13,14,15के अवरोधक के रूप में घातक साबित हो सकते हैं। इसी तरह के मुद्दों प्रोटीन वर्गों के बहुमत के लिए अपरिहार्य हैं, जहां अवशिष्ट प्रदूषक धातुओं एक प्रोटीन के जैविक कार्यों या जैव रासायनिक और जैव भौतिक तकनीकों के साथ लक्षण वर्णन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
जबकि ऑक्सीकरण स्थितियों के तहत धातु संदूषण का स्तर और इमिदाजोल को एक एलुएंट के रूप में उपयोग करना आम तौर पर कम16होता है, प्रोटीन अलगाव साइस्टीन को कम करने वाले एजेंटों (डीटीटी, मर्काप्टोथेनॉल, आदि) या हिस्टिडीन17,18 या एथिलीनडायनेटेस्टेलेस्टिक एसिड (ईडीटीए) जैसे मजबूत चेलेटर के साथ धातु संदूषण19000 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 इसी तरह, चूंकि आईमैक रेजिन में धातु आयनों को अक्सर कार्बोक्सिलिक समूहों द्वारा समन्वित किया जाता है, इसलिए अम्लीय परिस्थितियों में किए गए प्रोटीन वाष्प ों में धातु संदूषण का स्तर बहुत अधिक होने की संभावना है। समाधानों में धातु की सामग्री का मूल्यांकन परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस) का उपयोग करके किया जा सकता है और पीपीबी-पीपीटी रेंज21,22,23,24में पता लगाने की सीमा तक प्लाज्मा-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) को शामिल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, आस और आईसीपी-एमएस एक पारंपरिक जैव रसायन प्रयोगशाला में पता लगाने के लिए यथार्थवादी साधन नहीं हैं क्योंकि उन तरीकों को विशेष उपकरणों और प्रशिक्षण तक पहुंच की आवश्यकता होगी।
ब्रिटाइन25,26 द्वारा पिछले काम ने समाधान में संक्रमण धातुओं की उपस्थिति की पहचान करने के तरीके के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथोल ब्लू (एचएनबी) के उपयोग की जांच की। हालांकि, डेटा20 में कई आंतरिक विरोधाभास थे और वे काम पर्याप्त प्रोटोकॉल पेश करने में विफल रहे । टेमेल एट अल27 और फरेरा एट अल.28 द्वारा अध्ययन एक संभावित धातु संकेतक के रूप में एचएनबी के साथ ब्रिटाइन के काम पर विस्तारित किया गया। हालांकि, टेमेल ने एक प्रोटोकॉल विकसित किया जो नमूना विश्लेषण के लिए एएएस का उपयोग करता है, केवल एक चेलेटिंग एजेंट के रूप में एचएनबी का उपयोग करता है। फरेरा के अध्ययन में ५६३ एनएम, मुक्त रंगे HNB स्पेक्ट्रा का एक क्षेत्र है कि पीएच ५.७ में HNB धातु परिसरों के स्पेक्ट्रा के साथ भारी ओवरलैप के एक क्षेत्र में HNB अवशोषण स्पेक्ट्रा में परिवर्तन का इस्तेमाल किया, assay संवेदनशीलता काफी कम बनाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपेक्षाकृत कमजोर बाध्यकारी धातु आत्मीयता20में जिसके परिणामस्वरूप । IMAC से नी 2+ लीचिंग के साथ हमारी अपनी प्रयोगशाला में मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हमने ब्रिटाइन25,26 और फेरेरिया28 द्वारा किए गए कार्य का विस्तार किया है ताकि कई संक्रमण धातुओं के नैनोमोलर स्तर का पता लगाने में सक्षम एक आसान परख विकसित की जा सके। हमने दिखाया कि एचएनबी उप-नैनोमोलर बाध्यकारी समानताओं के साथ आईमैक धातुओं के लिए निकल और अन्य आम को बांधता है और पीएच मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला पर 1:1 जटिल बनाताहै। यहां बताई गई परख इन निष्कर्षों पर आधारित है और धातु क्वाटिफिकेशन के लिए 647 एनएम पर एचएनबी स्पेक्ट्रम में अवशोषण परिवर्तन का उपयोग करता है। परख शारीरिक पीएच रेंज में किया जा सकता है आम बफ़र्स और उपकरण एक ठेठ बायोकेमिस्ट्री लैब में पाया यंत्र का उपयोग करके colorimetric पता लगाने और धातु के मात्रा का उपयोग करके-डाइ परिसरों और मुक्त रंगे के अवशोषण में जुड़े परिवर्तन जब यह धातु से बांधता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएनबी का उपयोग करके धातुओं का रंगीन पता लगाने से आईमैक रेसिन से संक्रमण धातु आयनों द्वारा प्रोटीन संदूषण की मात्रा निर्धारित करने का एक सरल तरीका प्रदान करता है। जैसा कि हमने रेफरी 20 में स्थापित किया,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह सामग्री ग्रांट एमसीबी-1817448 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है और थॉमस एफ और केट मिलर जेफरीस मेमोरियल ट्रस्ट, बैंक ऑफ अमेरिका, ट्रस्टी और निर्दिष्ट दाता हेज़ल थोर्प कारमैन और जॉर्ज गे कारमैन के एक पुरस्कार से विश्वास.
Materials
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
- Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
- Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
- Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
- Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
- Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
- Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
- Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
- Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
- Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
- Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
- Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
- Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
- Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
- Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
- Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
- Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
- Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
- Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
- Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
- Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
- Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
- Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
- Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
- Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
- Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
- Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
- Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
- Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
- Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
- Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
- Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
- Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).
