Vi presenterar en analys för enkel kvantifiering av metaller som introduceras i prover som bereds med immobiliserad metallaffinitetskromatografi. Metoden använder hydroxynaphthol blått som den kolorimetriska metall indikatorn och en UV-VIS spektrofotometer som detektorn.
Förorening av enzymer med metaller som lakats från immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC) kolumner utgör ett stort bekymmer för enzymologer, eftersom många av de gemensamma di-och trivalenta katjoner som används i IMAC hartser har en hämmande effekt på enzymer. Omfattningen av utlakning av metaller och effekten av olika elminerande och reducerande reagenser är dock dåligt förstådd till stor del på grund av avsaknaden av enkla och praktiska kvantifieringsprotokoll för övergångsmetaller som använder utrustning som vanligtvis finns i biokemi Labs. För att lösa detta problem har vi utvecklat ett protokoll för att snabbt kvantifiera mängden metall förorening i prover som förberetts med IMAC som reningssteg. Metoden använder hydroxynaphtol blå (HNB) som en kolorimetrisk indikator för metall katjonhalten i en provlösning och UV-VIS-spektroskopi som ett sätt att kvantifiera mängden metall som finns, i nanomolar-området, baserat på förändringen i HNB-spektrumet vid 647 nm. Medan Metallhalt i en lösning historiskt har fastställts med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi eller induktivt kopplade plasma tekniker, dessa metoder kräver specialiserad utrustning och utbildning utanför tillämpningsområdet för ett typiskt biokemi laboratorium. Den metod som föreslås här ger ett enkelt och snabbt sätt för biokemister att bestämma metallhalten i prover med hjälp av befintlig utrustning och kunskap utan att offra noggrannhet.
Sedan starten av Porath och medarbetare1, immobiliserade metallaffinitetskromatografi (iMac) har blivit en metod för val att snabbt separera proteiner baserat på deras förmåga att binda med övergång metalljoner såsom Zn2+, ni2 +, Cu2 +, och co2 +. Detta görs oftast via konstruerade Poly-Histidine Taggar och är nu en av de vanligaste kromatografiska reningstekniker för isolering av rekombinanta proteiner2. IMac har också funnit tillämpningar utöver rekombinant Proteinrening som ett sätt att isolera kinoloner, tetracykliner, aminoglykosider, makrolider, och β-lactams för mat provanalys3 och som ett steg i att identifiera blod-serumprotein markörer för lever och pankreascancer4,5. Inte överraskande, iMac har också blivit en metod för val för isolering av ett antal infödda blockeringar enzymer6,7,8,9,10. Men framgångsrikt genomförande av dessa reningsmetoder för studier av enzymatiskt aktiva bioenergetiska proteiner är beroende av närvaron av obetydliga nivåer av metallkatjoner som lakas från kolonnmatrisen till eluatet. De divalenta metallkatjoner som vanligen används i iMac har känd patologisk biologisk betydelse, även vid låga koncentrationer11,12. Den fysiologiska effekten av dessa metaller är mest uttalad i bioenergetiska system, där de kan visa sig dödliga som hämmare av cellandning eller fotosyntes13,14,15. Liknande frågor är oundvikliga för de flesta protein klasser där rester av främmande metaller kan störa proteiners biologiska funktioner eller karaktärisering med biokemiska och biofysiska metoder.
Även om halterna av metallkontaminering under oxiderande förhållanden och användning av Imidazol som eluant vanligtvis är låga16, proteinisoleringar utförs i närvaro av cystein reducerande medel (DTT, β-merkaptoetanol, etc.) eller med starkare kelatorer som histidin17,18 eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) resultera i mycket högre nivåer av metall förorening19,20. Likaså, eftersom metalljoner i IMAC hartser ofta samordnas av karboxylska grupper, protein elutioner utförs under sura förhållanden är också sannolikt att ha mycket högre nivåer av metall förorening. Metallhalten i lösningar kan bedömas med hjälp av atomabsorptionsspektroskopi (AAS) och induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) ner till en detektionsgräns i ppb-PPT-intervallet21,22,23,24. Tyvärr, AAS och ICP-MS är inte realistiska sätt för detektion i en traditionell biokemi Lab som dessa metoder skulle kräva tillgång till specialiserad utrustning och utbildning.
Tidigare arbete av Brittain25,26 undersökt användningen av hydroxynaphthol blå (HNB) som ett sätt att identifiera förekomsten av övergångsmetaller i lösning. Det fanns dock flera interna motsägelser i data20 och dessa arbeten misslyckades med att erbjuda ett adekvat protokoll. Studier av Temel et al.27 och Ferreira et al.28 expanderade på BRITTAIN arbete med HNB som en potentiell metall indikator. Dock utvecklade Temel ett protokoll som utnyttjar AAS för provanalys, med HNB endast som en kelat agent. Ferreiras studie använde förändringen i HNB absorbans Spectra på 563 nm, en region av fri-Dye HNB Spectra som överlappar kraftigt med spektra av HNB-metall komplex vid pH 5,7, vilket gör analysens känslighet ganska låg samt resulterar i relativt svag metallbindande samhörighet20. För att lösa problem i vårt eget labb med ni2 + urlakning från iMac har vi utökat det arbete som utförts av Brittain25,26 och Ferreria28 för att utveckla en enkel analys som kan detektera nanomolära nivåer av flera övergångsmetaller. Vi visade att HNB binder nickel och andra vanliga för IMAC metaller med sub-nanomolar bindande tillhörighet och form 1:1 komplex över ett brett spektrum av pH-värden20. Analysen som rapporteras här baseras på dessa fynd och utnyttjar absorbansförändringar i HNB-spektrumet vid 647 Nm för metallkvantifiering. Analysen kan utföras i det fysiologiska pH-intervallet med hjälp av vanliga buffertar och instrumentering som finns i en typisk biokemi Lab med hjälp av kolorimetrisk detektion och kvantifiering av metall-färgkomplex och tillhörande förändring i absorbans av fri-färg när den binder till metall.
Kolorimetrisk detektion av metaller med HNB ger ett enkelt sätt att kvantifiera graden av protein förorening genom övergång metalljoner från IMAC hartser. Som vi etablerat i Ref. 20 binder ni2 + till hnb med 1:1 stoichiometri och dissociationskonstant för ni-HNB-komplexet ändras med pH. Dock är komplexet Kd i sub-nm-området för alla rekommenderade (7-12) pH-värden. I praktiken innebär det att alla ni2 + i alla testade fraktioner kommer att binda till HNB så länge inga andra …
The authors have nothing to disclose.
Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under Grant MCB-1817448 och av en utmärkelse från Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust, Bank of America, förvaltare och specificerade givare Hazel Thorpe Carman och George gay Carman Förtroende.
2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |