Kombinere fluidic enheder med mikroskopi og flow cytometri at studere mikrobiel transport i porøse medier på tværs af rumlige skalaer

Summary

Banebrydende kurver (BPC’er) er effektive værktøjer til at studere transport af bakterier i porøse medier. Her introducerer vi værktøjer baseret på flydende enheder i kombination med mikroskopi og flow cytometrisk optælling for at opnå BPC’er.

Abstract

Forståelse af transport, spredning og deposition af mikroorganismer i porøse medier er en kompleks videnskabelig opgave, der omfatter emner så forskellige som hydrodynamik, økologi og miljøteknik. Modellering bakteriel transport i porøse miljøer på forskellige rumlige skalaer er afgørende for bedre at forudsige konsekvenserne af bakteriel transport, men nuværende modeller ofte undlader at op-skala fra laboratorium til feltbetingelser. Her introducerer vi eksperimentelle værktøjer til at studere bakteriel transport i porøse medier på to rumlige skalaer. Formålet med disse værktøjer er at opnå makroskopiske observerbare stoffer (såsom gennembrud kurver eller deposition profiler) af bakterier injiceres i gennemsigtige porøse matricer. I lille skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheder med optisk videomikroskopi og billedbehandling for at opnå gennembrudskurver og samtidig spore individuelle bakterieceller i poreskalaen. I større skala kombineres flowcytometri med en selvskabt robotdispenser for at opnå gennembrudskurver. Vi illustrerer nytten af disse værktøjer til bedre at forstå, hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier såsom hyporheic zone af vandløb. Da disse værktøjer giver samtidige målinger på tværs af skalaer, baner de vejen for mekanismebaserede modeller, hvilket er af afgørende betydning for opskalering. Anvendelsen af disse værktøjer kan ikke kun bidrage til udviklingen af nye bioremedieringsapplikationer, men også kaste nyt lys over mikroorganismers økologiske strategier for kolonisering af porøse substrater.

Introduction

Undersøgelser , der har til formål at forstå transport af mikrober gennem porøse medier , har hovedsagelig været drevet af bekymringer^{om forurening 1}, overførsel af sygdom² og bioremediering³. I denne forbindelse er bakterier for det meste blevet behandlet som partikler i transportmodeller^4, og processer som filtrering, belastning, gravitationel bundfældning eller remobilisering fra biofilm er blevet identificeret som drivkræfter bag retention eller transport af mikrober⁵. Men at studere transport af bakterier gennem porøse landskaber kan også informere os om de økologiske strategier, der ligger til grund for deres succes i disse komplekse miljøer. Men dette kræver nye eksperimenter og matematiske modeller, der opererer på enkelt celle, befolkning eller mikrobielle samfund niveau.

Naturlige porøse miljøer, som dem, der findes i hyporheic zone af vandløb og floder, er tæt koloniseret af forskellige samfund af biofilm-dannende mikrober⁶. Biofilm danner strukturer, der ændrer strømmen og dermed transport og spredning af bakterier i^{væskefasen 7,8}. Transport af bakterier på pore skala afhænger af den begrænsede plads tilgængelighed i porøse matrix og motilitet-relaterede spredning kan være en effektiv måde at øge den individuelle fitness gennem reduceret konkurrence om ressourcer i mindre tæt befolkede områder. På den anden side kan motile bakterier også nå mere isolerede områder af den porøse matrix og den udvidede udforskning af sådanne områder kan give økologiske muligheder for at motile befolkninger¹⁰. På større rumlige skalaer, biofilm vækst afleder flow stier også fører til (delvis) tilstopning af porer og dermed til etablering af endnu mere kanaliseret og heterogene flow betingelser¹¹. Dette har konsekvenser for næringsstofforsyningen og spredningskapaciteten, hyppigheden og afstanden. Præferenceflow, for eksempel, kan generere såkaldte “fast-tracks” og motile bakterier kan opnå endnu højere hastigheder end det lokale flow langs disse spor¹². Dette er en effektiv måde at øge udforskningen af nye levesteder på.

En række værktøjer benytter sig til undersøgelse af transport af motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prædiktiv kapacitet, der er vigtig for anvendelser, men er ofte begrænset af iboende antagelser⁴. Laboratorieskalaforsøg¹³,^{14 kombineret}med btc-modellering (Breakthrough Curve) har givet vigtig indsigt i vigtigheden af bakteriecelleoverfladeegenskaber for at sætte effektivitet¹⁵. Typisk opnås BPC’er (dvs. tidsserier af partikelkoncentration på et fast sted) via konstant hastighedsudsætninger og måling af cellenumre ved udstrømningen af forsøgsanordningen. I denne sammenhæng afspejler BFC’erne bakterienes advection-dispersiondynamik i den porøse matrix og kan forlænges med en vask, der tegner sig for vedhæftet fil. Modellering af BFC alene løser imidlertid ikke den rolle, som den porøse substrat eller biofilm spiller for transportprocesser. Andre makroskopiske observerbare som dispersivitet eller deposition profiler har vist sig at give vigtige oplysninger om den rumlige fordeling eller de tilbageholdte partikler eller voksende samfund. Microfluidics er en teknologi, der gør det muligt at studere transport i porøse medier ved mikroskopi undersøgelse^9,12,16, og bortset fra en nylig arbejde¹⁰, eksperimentelle systemer er typisk begrænset til en enkelt længde skala af opløsning, det vil sige pore skala eller hele flydende enhed skala.

Her introducerer vi en række kombinerede metoder til at studere transport af motile og ikke-motile bakterier i porøse landskaber i forskellige skalaer. Vi kombinerer observationer af bakterietransport i poreskalaen med oplysninger i større skala ved hjælp af BTC-analyse. Mikrofluidiske enheder, der er bygget af blød litografi ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS), er biokompatible, modstandsdygtige over for en række kemikalier, tillader replicerbarhed med lave omkostninger og giver fremragende optisk gennemsigtighed samt lav autofluorescens, der er kritisk for mikroskopisk observation. Mikrofluidics baseret på PDMS er tidligere blevet brugt til at studere transport af mikrober i simple^{kanaler 17} eller i mere komplekse geometrier¹². Men typisk microfluidcs eksperimenter fokuserer på kortsigtede horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observation af levende celler er almindeligvis begrænset til genetisk modificerede stammer (f.eks GFP-mærkede stammer). Her præsenterer vi værktøjer til at studere bakteriel transport ved hjælp af PDMS-baserede mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopi og større enheder fremstillet af poly (methyl methacrylat) (PMMA, også kendt som plexiglas) i kombination med flowcytometri. PDMS og PMMA adskiller sig med hensyn til gaspermeabilitet og overfladeegenskaber, hvilket giver komplementære muligheder for at studere bakterietransport. Mens den mikrofluidiske enhed giver et mere kontrolleret miljø, giver den større enhed mulighed for eksperimenter over længere tid eller ved hjælp af naturlige bakteriesamfund. Mikroskopitælling ved høj tidsopløsning i et dedikeret område bruges til at opnå BTC i den PDMS-baserede mikrofluidiske enhed. For at opnå celletal for BTC-modellering fra den PMMA-baserede enhed introducerer vi en selvkonstrueret automatiseret væskedispenser i kombination med flowcytometri. I denne opsætning passerer celler den flydende enhed og udleveres fortløbende i 96 brøndplader. Den tidsmæssige opløsning begrænses af den mindste volumen, der præcist kan dispenseres og dermed den mellemstore strømningshastighed gennem den flydende enhed. Fiksativ i brøndene forhindrer vækst og letter DNA farvning for downstream flow-cytometrisk optælling. For at forhindre bakterievækst under transportforsøg bruger vi en minimal medium (termed motility buffer).

Da protokoller til fremstilling af flydende anordninger i forskellige skalaer er let tilgængelige, introducerer vi kun kortvarigt teknikkerne til fremstilling af sådanne anordninger og fokuserer snarere på de eksperimentelle procedurer for registrering af BPC’er. Tilsvarende findes der forskellige rutiner for flow cytometrisk optælling af mikrober, og brugerne kræver ekspertviden til at fortolke resultater opnået ved flowcytometri. Vi rapporterer den nye brug af mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopisk billeddannelse til at registrere BTC’er af fluorescerende mærkede celler. På poreskalaen opnås lokale hastigheder og baner ved hjælp af billedbehandling. Desuden demonstrerer vi brugen af en PMMA-baseret fluidic enhed i kombination med flow-cytometrisk optælling for at observere bakteriel transport af motile og ikke-motile celler i porøse miljøer koloniseret af en indfødt stream biofilm.

Protocol

1. Bakterielle kultur betingelser Ved arbejde under laminarflowhætte skal du bruge 100 μL glycerol-beholdning af GFP-mærket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, opbevares ved -80 °C) til at inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuberes ved 30 °C, mens der rystes ved 250 omdrejningstal natten over. Den næste dag, resuspend 100 μL af natten kultur i 5 ml LB medium og inkuberes under de samme betingelser for 5h (eksponentiel fase). Prøve en 1 ml aliquot i…

Representative Results

For at illustrere funktionaliteten af den præsenterede arbejdsgang udførte vi eksperimenter ved hjælp af genetisk modificerede Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motile bakterie, der er vigtig for bioremediering og bioteknologi. Genetisk modificerede versioner af denne stamme, der udtrykker GFP produktion er kommercielt tilgængelige. En ikke-motile stamme af P. putida KT2440, som mangler de relevante strukturelle og lovgivningsmæssige gener for motilitet er …

Discussion

Her foreslår vi to midler til at studere transport af mikrober gennem porøse systemer på encelle- og befolkningsniveau. Mens undersøgelsen af transportfænomener ved hjælp af BTC-modellering har givet værdifuld indsigt i spredningen af patogener eller forurenende stoffer i økosystemskalaerne, er der stadig vanskeligheder med at skalere fra laboratorieforsøg til feltforhold. De værktøjer, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere at forsøge at løse de rumlige og tidsmæssige skalaer for bedre at forst…

Materials

EDTA	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Flow cytometer NovoCyte	Acea
Glucose	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
LB broth	BD
Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit	makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Microscope slides, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 peristaltic pump	Gilson
Plasma bonder Corona SB	BlackHole Lab
Potassium phosphate	Sigma
Syringe pump New Era NE 4000	New Era
Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain	Molecular Probes, Invitrogen
Tygon tubing	Ismatec
WF31SA universal milling machine	Mikron