Summary
我们描述了一种使用亲脂荧光染料逆行追踪果蝇胚胎运动神经元的方法。
Abstract
我们描述了一种在果蝇中逆行标记运动神经元的技术。我们使用一种油溶解的亲脂染料，并通过显微注射器将一小滴滴输送到胚胎圆角制剂中。其膜被滴接触的每个运动神经元可以迅速标记。单个运动神经元被连续标记，使精细的结构细节清晰地可视化。鉴于亲脂染料有多种颜色，该技术还提供了一种获取相邻神经元以多色标记的方法。因此，这种追踪技术对于研究果蝇运动神经元系统的神经元形态发生和突触连接非常有用。
Introduction
果蝇的胚胎运动神经元系统提供了一个强大的实验模型来分析中枢神经系统（CNS）1、2、3的发展机制。运动神经元系统适用于生化、遗传、成像和电生理技术。利用这些技术，基因操作和功能分析可以在单运动神经元2，4，5，6的水平进行。
在神经系统的早期发育过程中，神经细胞分裂并产生大量的胶质和神经元。神经细胞的分层和基因表达特征之间的时空关系，以前曾详细研究过7、8、9。在运动神经元系统的情况下，胚胎神经肌肉结（NMJ）的形成已经被广泛研究使用aCC（前角细胞），RP2（生虾2），和RP5运动神经元2，10。例如，当RP5运动神经元形成新生的突触结时，突触前和突触后filopodia被混合11，12，13。这种直接的蜂窝通信对于启动NMJ的形成至关重要。与我们所知道的周围神经分支相反，我们对运动树突如何在CNS内启动突触连接的知识仍然是原始的。
在这份报告中，我们提出了一种技术，允许通过微移液介导的亲脂染料的传递，在胚胎中逆行标记运动神经元。这项技术使我们能够在产卵（AEL）14后15小时，追踪38个运动神经元在15小时内，在30个身体壁肌肉中各进行内蚀。通过利用这一技术，我们小组彻底调查了许多功能增益/功能损失等位基因15，16，17。我们最近解开了驱动运动树突连接启动的分子机制，并证明Dscam1-Dock-Pak相互作用定义了aCC运动神经元17中树突生长的部位。一般来说，这种技术适用于野生类型或突变菌株中任何胚胎运动神经元的型态分析，增强了我们对果蝇神经系统功能设计提供新见解的能力。
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Protocol
1. 设备和用品
- 收集胚胎和培训成人产卵的材料
- 通过切断 50 mL 管并切开盖上的孔来设置带 100 μm（材料表）的网状过滤器，从而在管和盖之间设置滤芯，从而准备过滤设备。
注：或者，具有100μm孔（材料表）的细胞过滤器可用于胚胎收集的过滤步骤。 - 根据列出的说明，用葡萄琼脂预混料（材料表）制作琼脂板。简单，轻轻搅拌1包粉末混合成500 mL的室温（RT，23°C）dH2O和微波溶解的混合物剧烈沸腾。冷却至 70~75 °C 后，将混合物倒入培养皿（60 mm）。琼脂凝固后，将板储存在4°C。
- 通过将活性干酵母（材料表）和水混合至糊状稠度，制备酵母糊，并保持在4°C。
- 使用蛋收集笼（对于60毫米培养皿，材料表），提供充足的气流。
- 通过切断 50 mL 管并切开盖上的孔来设置带 100 μm（材料表）的网状过滤器，从而在管和盖之间设置滤芯，从而准备过滤设备。
- 解剖针和染料注射微移液器的制备
- 从内径为0.6毫米、外径为1.2毫米（材料表）的同一毛细管中制备染料注射微管和解剖针。由微移管拉拔器以 7% 从 170 V 最大输出（材料表）处拉出毛细管，以形成长度为 ±0.4 厘米的尖针。
- 对于染料注射，使用微移液器（材料表）调整微移液器（材料表），采用仪器手册中描述的气泡转皮技术。
- 简而言之，用润湿剂（材料表）浸泡研磨机，以防止水"拖"针尖。将针头放在微移液夹上，温度为 25[30°]，并将针尖从倾斜表面中心向外倾斜到半径的三分之二。用管子注射器将空气推入针头时研磨针头，以确保微移液器没有玻璃剃须。
- 用细尖永久标记标记微移液器，以指示倾斜后开口在尖端的位置，因为要找到以一定角度形成的微移液器的窄开口是具有挑战性的。
2. 胚胎采集的准备
- 确保成年苍蝇（20-40只野生型广州-S或白蝇），雄性与雌性，保持在年轻（<7天）和健康条件的理想卵子收集。
注：为了刺激产卵，苍蝇在收集卵子前几天在卵子收集笼中训练，每天至少一次用酵母糊状的琼脂片收集卵子。
3. 胚胎分期
- 让苍蝇在RT处产卵过夜（或至少15小时），在15小时AEL（即第1618阶段）收集胚胎，以观察aCC和RP3运动神经元的产卵。早上，用鸡蛋收集盘子。
注：在15 h AEL的胚胎将有一个独特的4室肠道18。对于成像的不同阶段遵循其特定的形态标准和老化条件。 - 为了收集胚胎，用50%漂白剂将产在盘子上的卵子冷冻5分钟。
- 清除切口后，通过过滤装置或细胞过滤器将板中的内容物倒入以分离胚胎。使用挤压瓶水，稀释留在盘子上的漂白剂，并通过将混合物倒入过滤器来收集尽可能多的胚胎。
- 用更多的水清洗过滤器上的胚胎3⁄4倍，或直到漂白气味散去。从设备中取出过滤器，用清水将胚胎洗到另一块干净的盘子上。从胚胎上的新板上分水。
- 将玻璃幻灯片覆盖在中间的两层乙烯基胶带上，形成一个矩形。使用剃刀刀片将矩形池从磁带上切出。在池的上端放置一条薄薄的双面胶带，这是胚胎放置的地方，如图1所示。
- 使用精细的钳子，在 15 h AEL 下单独选择 5×10 个胚胎，并将其放在双面胶带上，背侧朝上。将昆虫林格的盐水19添加到解剖池中，以保护胚胎免受干燥（图1）。
4. 解剖和染色
- 使用解剖显微镜下的玻璃针（材料表），从后部到前端穿过单个胚胎表面的中线。然后，将胚胎从胶带上从玻璃膜中拖出（如图1所示）。小心不要损坏胚胎的内部组织。
- 从中心翻转上皮组织，并将表皮边缘附着在玻璃滑动的表面（图1，内接）。
- 使用开口为 ±300 μm 的管连接针（通过打破解剖针的薄尖端进行准备），吸气或吹气以分离和取出背端纵向气管树干以及任何残留的肠道。
- 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中使用4%的甲醛（PFA），在RT处将胚胎固定5分钟。用PBS清洗胚胎3次。
- 用1μL的抗马萝卜过氧化物酶抗体在PBS的200μL中与青宁3染料（抗HRP Cy3）（材料表）染色1μL，用PBS3x在染色后清洗胚胎。
注：抗HRP染料可根据注射的首选亲脂染料进行更换。
5. 注塑微移液器的填充
- 加热亲脂染料（5mg/mL的DiO或DiD，材料表）至60°C在1：10乙醇混合物：植物油使用前。
- 为注射微移液器准备油溶解染料滑块。将微移液器放入毛细管支架（图2，#1）。使用微操作器（材料表），将微移液器调整到染料滑轨上。然后，调整舞台，将微移液器放在染料上（图2，#2）。
- 要填充微液器，请使用显微注射器（材料表）（图2，#3）。通过将 Pi（注射压力）设置为 200~500 hPa（hectopascal）之间的 P i（注射压力），将 0.1±0.5 s 和 Pc（补偿压力）设置为 0 hPa 之间的 Ti（注射时间）至 0 hPa 5 分钟（图 2，#4）。在微移液器中收集染料。
- 收集染料后，取出染料滑块并将样品放在显微镜台上。接下来，将Pc增加到20~60 hPa的范围，然后再将微移液器放入样品中，以防止毛细管作用污染PBS。
6. 染料注射到神经元
- 使用显微镜使用10x物镜（材料表）定位中心中的胚胎，并将微移液器与胚胎对齐。
注：通过改变Pi或微移液头开口的大小，可以调整染料液滴的大小。水滴应为10~20 μm，约为1块肌肉的宽度。 - 将物镜更改为浸入式 40x 透镜（材料表），并将镜头浸入 PBS 中，以观察胚胎。
- 使用荧光显微镜检查以抗HRP Cy3标记的神经元形态并确定注射部位。
- 在注射过程中，使用明场显微镜观察染料液滴。当胚胎处于焦点时，改变微移液器的位置，以与感兴趣的斧头尖端（例如，aCC、RP3）进行温和接触。
- 使用标记为抗HRP Cy3的神经元，将染料滴在ACC或RP3（图3）的神经肌肉结处的右腹部（A2+A6）半段。使用手动控件（鼠标;图2，5）释放染料，并在用微操作器掉落染料后取出微移液器，并移动到下一个注射部位。
注：与其他染料（例如，路西法黄、钙素）不同，这种染料通过间隙结扩散到邻近细胞，嗜脂染料与细胞膜有关，不会转移到邻居。然而，由于染料滴的尺寸相对较大，这种技术也会导致对搭档肌肉进行标记（图3A）。
- 在成像前，在染料滴落后，在RT上孵育样品1小时。
注：在安装之前，可以在此处暂停该协议，样品可在 4°C 过夜。如果细胞内直接耦合（DC）放大器一应俱全，也可通过电泳来输送。
7. 使用共聚焦显微镜成像
- 在钳子的帮助下，从玻璃滑块上取下双面胶带和乙烯基胶带。
- 在四角用少量真空润滑脂（材料表）准备盖玻片（22 x 22 mm2 2 1 盖玻璃），并小心地放在样品上，避免气泡。使用任务雨刮器清除多余的 PBS。
- 向下推盖滑移以调整物镜和样品之间的工作距离。用指甲油完全密封盖滑的边缘。
- 使用共聚焦显微镜以 10 倍和 100 倍放大倍率进行图像。
- 使用 ImageJ 软件处理来自显微镜的原始图像 （材料表）。
注：安装最佳图像后 10 分钟内必须开始观察。否则，在RT，染料将扩散到注射部位附近的部位，从而产生不需要的成像背景。为了减缓染料的扩散，样品可以在4°C下储存几个小时。
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Representative Results
图3C显示了aCC和RP3运动神经元的代表性图像，以演示在15小时AEL下运动神经元的多色标记。它们的树突形态在胚胎之间基本上都是不变的。使用抗HRP抗体获得的染色模式以灰色显示。一小滴DiO或DiD分别沉积在肌肉1或6/7的NMJ上。图 4演示了定量测量兴趣表型的能力。我们计算了野生类型的树突尖总数，与突变体（例如，dscam1-/-）相比。
图 1：解剖池的设置。玻璃幻灯片上看到的蓝色房间是用乙烯基胶带制作的，将缓冲器放在里面。双面胶带固定在正确对齐的胚胎上。左下角还显示了盐水中解剖胚胎的示例。前端在此和所有后续数字中位于顶部。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：染料注射设备。图中的玻璃移液器标签演示了玻璃移液器 （1） 的安装现场。荧光显微镜配有 LED 光源和一系列滤光片。微操作器 （2） 和显微注射 （3） 设备标有显微镜右侧。内注是显微注射装置（4）的特写，其适当值为Pi、Ti和Pc。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：逆行标记运动神经元的亲脂染料制剂。（A） 逆行标记的运动神经元及其目标肌肉。aCC 运动神经元内骨肌肉 1 （DiO： 激发/发射， 484 nm/501 nm）;RP3 运动神经元内泄肌肉 6/7 （DiD： 激发/发射， 644 nm/665 nm）。请注意，肌肉6/7也接受来自另一个运动神经元（MNISNb/d-Is）在幼虫阶段的内在;然而，MNISNb/d-Is没有胚胎对应物3。圆圈表示染料应用的部位。（B） 15 h AEL 中身体壁肌肉和周围神经分支的示意图。腹腔神经线 （VNC） 由相对于腹腔中线（虚线）的分段重复和双边对称神经线组成。每个隔断段的体壁肌肉由38个运动神经元内侧进行。运动神经元通过六个主要神经分支（ISN [段间神经]、SNa [段神经 a]、SNb、SNc、SNd 和 TN [横向神经]）投射其斧头。（C） 来自 ACC 和 RP3 运动神经元的丹突分支表现出广泛的重叠。两个神经元都是双极神经元，这意味着神经元建立两个不同的树突种群。每个神经元将一个轴投射到侧边神经桩中，另一个项目到反向神经桩中。箭头指向树突状的提示。荧光图像以10倍物镜或100倍油浸物目标采集。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在小时15号胚胎中带有逆行标记的ACC下生。（A） 在野生类型中，ACC 将其树突扩展到两侧和反向神经桩。为简单起见，我们仅显示此图中来自 aCC 的边面树突。aCC 标有 DiO，以绿色显示。（B） 在dscam1突变体（Janelia研究园区的Zumin Lee博士的dscam121/21）中，在多数情况下，ACC几乎没有观察到的17个突子。箭头显示树突状提示。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
与遗传细胞标记技术而言，使用染料标记来研究神经元形态学具有几个优点。染料标记技术可以最大限度地减少标记和成像运动神经元形态所需的时间。染料标记过程相当快，因为它需要不到2小时，使我们能够定义神经元投影的轮廓。作为替代方案，可以通过选择在aCC中表达酵母GAL4转录因子的GAL4线来可视化aCC运动神经元，并穿过由上游活化序列（UAS）21控制的绿色荧光蛋白（GFP）报告器。GFP标签技术，因此需要遗传交叉，因此，需要额外的几天。
染料标记的另一个优点是允许在极高的密度下对等离子膜进行贴标。膜的每个部分都可以有足够密度的亲脂染料，使我们能够解决标记结构的精细细节。相比之下，GFP分子的密度通常取决于UAS-GAL4系统启动后的等待期。例如，aCC 从 10 h AEL 开始表示 GFP。到15小时AEL时，我们观察到GFP分子的密度不足以覆盖整个膜。它导致精细神经元投影（D.K.，未公布的数据）标记不足。
虽然这种技术提供了几个优点，但当电机斧子的错误投影明显时，它不太有利。例如，在没有回避的情况下，运动神经元会表现出严重的斧头缺陷，如过早失速、分段交叉和过度分枝22。因此，到达某个东森终端变得十分麻烦。贴标的效率也依赖于年龄，在20 h AEL以下的胚胎中有效。随着细胞外基质蛋白的发育而增加，运动神经元的标记似乎非常复杂。
这里描述的技术使我们能够测量许多形态学参数，如神经石总长度和数量，以及神经分支模式和形状15，16，17，23，24。由于亲亲霉素染料有多种颜色（如DiO、DiA、DiI、DiD和DiR），因此相邻运动神经元的多色标签也是可以实现的。如图4所示，来自aCC和RP3运动神经元的树突大量重叠。为了进一步了解电机电路的发展，将研究树突-树突相互作用的机制。
在这里，我们详细介绍了多功能技术，该技术为研究电机电路中的神经元连接提供了途径。虽然该演示仅限于15 h AEL中的aCC和RP3运动神经元，但该技术可以应用于胚胎发育的不同阶段的其他运动神经元。如果使用注射微移液器访问斧子端子，该技术也可以应用于苍蝇幼虫和成年阶段，甚至其他生物体的任何神经元的标签。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢金刚山实验室的成员对手稿的评论。这项工作得到了NIH R01 NS107558（到麻省理工学院、K.B.和D.K.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
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