Summary
Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.
Abstract
Vi beskriver en teknikk for retrograd merking av motor neurons i Drosophila. Vi bruker en olje-oppløst lipofile fargestoff og levere en liten dråpe til en embryonale filet forberedelse av en microinjector. Hver motor Nevron som membranen er kontaktet av dråpe kan da være raskt merket. Individuelle motor neurons er kontinuerlig merket, slik at fine strukturelle detaljer å være tydelig visualisere. Gitt at lipofile fargestoffer kommer i ulike farger, gir teknikken også et middel for å få tilstøtende neurons merket i flerfarget. Denne tracing teknikken er derfor nyttig for å studere neuronal morphogenesis og Synaptic tilkobling i motorisk Nevron system av Drosophila.
Introduction
Den embryonale motor Nevron system av Drosophila tilbyr en kraftig eksperimentell modell for å analysere mekanismene underliggende utviklingen av sentralnervesystemet (CNS)1,2,3. Den motoriske Nevron systemet er mottagelig for biokjemiske, genetisk, Imaging, og elektrofysiologisk teknikker. Ved hjelp av teknikker, kan genetiske manipulasjoner og funksjonelle analyser utføres på nivå med én motor neurons2,4,5,6.
I løpet av tidlig utvikling av nervesystemet, neuroblasts dividere og generere et stort antall glia og neurons. Spatiotemporal forholdet mellom delaminering og gen uttrykks profilen til neuroblasts har tidligere blitt undersøkt i detalj7,8,9. I tilfelle av motor Nevron systemet, dannelsen av embryonale nevromuskulær Junction (nmj) har blitt grundig studert ved hjelp av aCC (fremre hjørne celle), RP2 (RAW reke 2), og RP5 motor neurons2,10. For eksempel, når RP5 motor Nevron danner en begynnende Synaptic Junction, pre-Synaptic og post-Synaptic filopodia er blandet11,12,13. Slik direkte cellulær kommunikasjon er avgjørende for å starte NMJ formasjon. I motsetning til hva vi vet om perifere nerve grener, vår kunnskap om hvordan motor dendrites initiere Synaptic tilkobling innenfor CNS er fortsatt primitive.
I denne rapporten presenterer vi en teknikk som gjør at retrograd merking av motor neurons i embryo ved hjelp av micropipette-mediert levering av lipofile fargestoffer. Denne teknikken gjør det mulig for oss å spore 38 motor neurons innervating hver av de 30 kroppen veggen musklene i en hemi-segmentet på 15 h etter egglegging (AEL)14. Ved å bruke denne teknikken, har vår gruppe grundig undersøkt mange gevinst-av-funksjon/tap-of-funksjon alleler15,16,17. Vi har nylig unraveled den molekylære mekanismer som driver initiering av motor dendrit tilkobling og viste at en Dscam1-Dock-Pak interaksjon definerer stedet for dendrit utvekst i aCC motor Nevron17. Generelt, denne teknikken er tilpasningsdyktig for fenotypiske analyse av eventuelle embryonale motoriske neurons i vill type eller mutant stammer, styrke vår evne til å gi ny innsikt i funksjonell design av Drosophila nervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utstyr og forsyninger
- Materialer for innsamling av embryo og trening voksne å legge egg
- Klargjør filtrerings apparatet ved å severing et 50 mL rør og skjære opp et hull i hetten for å sette et maske filter med porene i 100 μm (tabell over materialer) mellom slangen og hetten.
Merk: Alternativt kan celle siler med porer 100 μm (tabell med materialer) brukes til Filtreringstrinnet i embryo-kolleksjonen. - Lag agar plater med drue agar Premix (tabell av materialer) i henhold til de oppførte instruksjonene. Kort, forsiktig rør 1 pakke pulver blandingen i 500 mL romtemperatur (RT, 23 ° c) dH2O og mikrobølgeovn den oppløste blandingen til energisk koke. Etter avkjøling til 70 − 75 ° c, Hell blandingen i Petri retter (60 mm). Etter at agar er befestet, lagre plater ved 4 ° c.
- Forbered gjær lim ved å blande aktiv tørr gjær (tabell over materialer) og vann til en lime konsistens, og holde på 4 ° c.
- Bruk egg-samling bur (for 60 mm Petri parabol, tabell av materialer) som gir tilstrekkelig luftstrøm.
- Klargjør filtrerings apparatet ved å severing et 50 mL rør og skjære opp et hull i hetten for å sette et maske filter med porene i 100 μm (tabell over materialer) mellom slangen og hetten.
- Utarbeidelse av disseksjon nåler og Dye injeksjon Mikropipetter
- Forbered fargestoff injeksjon micropipette og disseksjon nål fra samme kapillær slange med en indre diameter på 0,6 mm og en ytre diameter på 1,2 mm (tabell av materialer). Trekk kapillær slangen med en micropipette avtrekker på 7% fra 170 V maksimal effekt (tabell av materialer) for å lage en skarp nål med en taper på ~ 0,4 cm i lengde.
- For farge injeksjon, Juster micropipette med en micropipette beveler (tabell av materialer) ved en boble beveling teknikk beskrevet i instrumentets bruksanvisning.
- Kort sagt, suge jeksel med et fukte middel (tabell av materialer) for å hindre vann fra å "dra" nålen spissen. Plasser nålen på micropipette klemme ved 25 − 30 ° og senk spissen på to tredjedeler av radiusen ut fra midten av den beveling overflaten. Grind nålen mens en sprøyte med slange presser luft inn i nålen, for å sikre at micropipette vil være klar av glass spon.
- Merk micropipette med en fin spiss permanent markør for å indikere posisjonen til åpningen på spissen etter beveling som det er utfordrende å finne den smale åpningen av micropipette som dannes i en vinkel.
2. forberedelse til embryo innsamling
- Sørg for at de voksne fluene (20 − 40 vill-type Canton-S eller hvite fluer), menn og kvinner, blir opprettholdt i ung (< 7 dager) og sunne forhold for den ideelle egg samlingen.
Merk: for å stimulere egg-legging, fluer er trent i sin egg samling bur et par dager før egg samling på agar plater stripete med gjær lim minst en gang hver dag.
3. Oppsamling av embryo
- La fluene til å legge egg over natten (eller minst 15 h) ved RT å samle embryo på 15 h AEL, dvs, etappe 1618, for å vise Dendritogenesis av ACC og RP3 motor neurons. I morgen, samle tallerkenen med eggene.
Merk: embryo på 15 h AEL vil ha en distinkt 4-kammer gut18. For Imaging forskjellige stadier følge deres spesifikke morfologiske kriterier og aldring forhold. - For å samle embryo, dechorionate eggene lagt på tallerkenen med 50% blekemiddel i 5 min.
- Når chorions har ryddet, helle innholdet i platen gjennom filtrerings apparat eller celle sil å isolere embryo. Ved hjelp av en klem flaske vann, fortynne blekemiddel igjen på tallerkenen og samle så mange embryo som mulig ved å decanting blandingen inn i filteret.
- Vask embryo på filteret 3 − 4X med mer vann eller til bleke lukt avleder. Fjern filteret fra apparatet og vask embryo på en annen ren tallerken med vann. Dekanter vannet fra den nye platen som embryo er på.
- Forbered et glass lysbilde ved å dekke det med to lag med vinyl tape i midten, danner et rektangel. Skjær et rektangulært basseng ut av tapen ved hjelp av et barberblad. Plasser en tynn stripe av dobbeltsidig tape mot den øvre enden av bassenget, er det her embryo vil bli plassert som vist i figur 1.
- Ved hjelp av fine tang, Velg individuelt 5 − 10 embryo ved 15 h AEL og plasser dem på dobbeltsidig tape med rygg side vendt opp. Legg insekts ringer ' s saltvann19 til disseksjon bassenget for å beskytte embryo fra uttørking (figur 1).
4. disseksjon og farging
- Bruk en glass nål under et dissekere mikroskop (tabell av materialer), skjær gjennom midtlinjen av et enkelt embryo på sin overflate fra bakre til sin fremre ende. Deretter drar embryo ut fra eggeplomme membranen fra tapen på glasset (eske i figur 1). Pass på å ikke skade det indre vevet i fosteret.
- Vend epitel vevet fra midten og fest epidermal kanten på overflaten av glasset lysbildet (figur 1, innfelt).
- Ved hjelp av et rør koblet nål med en spiss åpning av ~ 300 μm (tilberedt ved å bryte den tynne tuppen av en disseksjon nål), aspirer eller blåse luft for å løsne og fjerne rygglengde tracheal stammene samt eventuelle gjenværende guts.
- Bruk 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fikse embryo i 5 min ved RT. vask embryo 3x med PBS.
- Stain embryo med 1 μL av anti-pepperrot peroksidase antistoff bøyd med cyanine 3 fargestoff (anti-HRP Cy3) (tabell av materialer) i 200 ΜL av PBS for 1 t. vask EMBRYO med PBS 3x etter farging.
Merk: fargestoffet av anti-HRP kan endres basert på lipofile fargestoffer av valget for injeksjon.
5. fylling av injeksjon Micro-pipette
- Heat lipofile fargestoffer (5 mg/mL av DiO eller gjorde, tabell av materialer) til 60 ° c i en 1:10 blanding av etanol: vegetabilsk olje før bruk.
- Forbered et olje-oppløst fargestoff lysbilde for injeksjon micropipette. Plasser micropipette i kapillær holde ren (figur 2, #1). Bruk micromanipulator (tabell over materialer) til å justere micropipette til å være over farge lysbildet. Deretter justerer du scenen for å plassere micropipette på fargestoffet (figur 2, #2).
- For å fylle opp micropipette, bruk en microinjector (tabell med materialer) (figur 2, #3). Samle fargestoffet i micropipette ved å sette Pi (injeksjons trykk) mellom 200 − 500 HPA (hektopascal), Ti (injeksjons tid) mellom 0,1-0,5 s og Pc (kompensasjons trykk) til 0 HPA i 5 min (figur 2, #4).
- Når fargestoffet er samlet inn, fjerne fargestoff lysbilde og plassere prøven på mikroskopet scenen. Deretter økes Pc til et område på 20 − 60 HPA før du senker micropipette inn i prøven for å forhindre KONTAMINERING av PBS ved kapillær handling.
6. Dye injeksjon i neurons
- Finn fosteret i midten ved hjelp av mikroskopet med 10x objektiv linse (tabell av materialer) og justere micropipette med fosteret.
Merk: størrelsen på fargestoffet dråpe kan justeres ved å endre Pi eller størrelsen på åpningen av micropipette spissen. Dråpestørrelse skal være 10 − 20 μm, som er omtrent på bredden av 1 muskel. - Endre objektivlinsen til en vann-nedsenking 40x linse (tabell av materialer) og senk linsen til PBS å se fosteret.
- Bruk fluorescens mikroskopi å sjekke neuronal morfologi merket av anti-HRP Cy3 og bestemme injeksjonsstedet.
- Under injeksjon, bruk brightfield mikroskopi å se fargestoff dråpe. Når fosteret er i fokus, endre plasseringen av micropipette å gjøre skånsom kontakt med spissen av axon (f. eks, aCC, RP3).
- Slipp fargestoffet i en høyre mage (a2 − a6) hemi-segmentet ved nevromuskulær krysset av aCC eller RP3 (Figur 3) med enten DiD eller DiO, ved hjelp av neurons preget av anti-HRP Cy3. Bruke håndkontroll (mus; Figur 2, 5) løsne fargestoffet og fjerne micropipette etter slippe fargestoff med micromanipulator og flytte til neste injeksjonsstedet.
Merk: i motsetning til andre fargestoffer (f. eks Lucifer gul, calcein) som spredte seg til nærliggende celler gjennom gap veikryss, lipofile fargestoffer forbinder med cellemembraner og ikke overføre til naboer. På grunn av den relativt store størrelsen på Dye dråpe, men denne teknikken også resulterer i merking av partnerskap musklene (Figur 3A).
- Ruge prøven ved RT for 1 time etter fargestoff slipp før bildebehandling.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her før montering, og prøven kan oppbevares ved 4 ° c over natten. Lipofile fargestoffer kan også leveres ved hjelp av Iontoforese, hvis en intracellulære direkte koblet (DC) forsterker er lett tilgjengelig20.
7. Imaging med et Konfokalmikroskopi mikroskop
- Fjern dobbeltsidig tape og vinyl tape fra glasset lysbildet ved hjelp av tang.
- Forbered en cover slip (22 x 22 mm2 nr. 1 dekkglass) med en liten mengde av vakuum fett (tabell av materialer) i de fire hjørnene og forsiktig plass på prøven, unngå luftbobler. Fjern eventuell overflødig PBS med oppgave kluter.
- Trykk ned deksel Seddelen for å justere arbeids avstanden mellom objektivlinsen og prøven. Helt forsegle kantene av dekselet slip med neglelakk.
- Bilde med 10x og 100 ganger forstørrelse ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop.
- Bruk ImageJ programvare for behandling av RAW-bilder fra mikroskopet (tabell av materialer).
Merk: observasjon må begynne innen 10 min etter montering for de beste bildene. Ellers på RT, vil fargestoffet spres til områder ved siden av injeksjonsstedet skape uønsket bakgrunn for Imaging. For å forsinke spredningen av fargestoff, kan prøven lagres ved 4 ° c for et par timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En representativ bilde av aCC og RP3 motor neurons er vist i Figur 3C for å demonstrere flerfarget merking av motor NEURONS ved 15 h AEL. Deres dendrittiske morfologier er i stor grad invariant mellom embryo. Fargemønsteret som oppnås med anti-HRP antistoff, vises i grått. En liten dråpe av DiO eller DiD ble avsatt på NMJ av muskel 1 eller 6/7, henholdsvis. Figur 4 demonstrerer evnen til å kvantitativt måle fenotype av interesse. Vi telte det totale antall dendrit tips i en vill type, sammenlignet med en mutant (f. eks, dscam1-/-).
Figur 1: oppsett av disseksjon bassenget. Den blå kammer sett på glass slide er laget med vinyl tape holde buffere inne. Den tosidige tape holder på embryo som er riktig justert. Også vist i nedre venstre hjørne er et eksempel på et dissekert embryo i saltvann. Den fremre enden er på toppen i denne og alle etterfølgende tall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Dye injeksjon utstyr. Glass pipette merking i figuren demonstrerer installasjonsstedet for glasset pipette (1). Den Epi-fluorescerende mikroskop er utstyrt med en LED lyskilde og en rekke filter sett. Micromanipulator (2) og microinjection (3) er merket til høyre for mikroskopet. Innfelt er et nærbilde av visningen av microinjection enhet (4) med de riktige verdiene av Pi, Ti, og Pc). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: lipofile Dye preparater av retrogradely merket motor neurons. (A) retrograd-merket motor neurons og deres mål muskler. ACC motor Nevron innervating muskel 1 (DiO: eksitasjon/utslipp, 484 NM/501 NM); den RP3 motoriske Nevron innervating musklene 6/7 (DiD: eksitasjon/utslipp, 644 NM/665 NM). Merk at musklene 6/7 også motta innervasjon fra en annen motorisk Nevron (MNISNb/d-er) i larvestadiet stadier; men MNISNb/d-is har ikke en embryonale motstykket3. Sirkler indikerer områder av Dye programmer. (B) et skjematisk diagram av kroppen veggen muskler og perifere nerve grener i 15 h AEL. Den ventrale nerve ledningen (VNC) består av segmentally gjentas og bilateralt symmetriske neuromere med hensyn til ventrale midtlinjen (stiplet linje). Body Wall musklene i hver hemi-segmentet er innervated av 38 motor neurons. Motoren neurons prosjektet sitt axons via seks store nerve grener (ISN [arteria intersegmentalis nerve], SNa [segmental nerve a], SNb, SNc, SNd, og TN [tverrgående nerve]). (C) dendrittiske grener fra ACC og RP3 motor neurons viser omfattende overlapping. Begge neurons er bipolar neurons, noe som betyr at neurons etablere to forskjellige populasjoner av dendrites. Hver Nevron prosjekter en Arbor i ipsilateral neuropil og en annen i kontralateral neuropil. Pilspisser peker til dendrittiske tips. Fluorescens bilder ble anskaffet med et 10x objektiv eller et 100 ganger olje nedsenking mål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: aCC dendritogenesis som avslørt med retrograd merking i time-15 embryo. (A) i vill type, aCC utvider sin dendrites i både ipsilateral og kontralateral neuropils. For enkelhet, vi bare vise ipsilateral dendrites fra aCC i dette tallet. aCC er merket med DiO, vist i grønt. (B) i dscam1 mutanter (Dscam121/21 fra Dr. Tzumin Lee, Janelia Research campus), aCC har få ipsilateral dendrites i de fleste tilfeller observert17. Pilspisser viser dendrittiske tips. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av fargestoff merkingsteknikker for å studere neuronal morfologi har flere fordeler fremfor genetisk celle-merking teknikk. Fargestoffet merkingsteknikker kan minimere mengden tid som trengs for merking og Imaging morfologier av motor neurons. Fargestoffet merkingsprosessen er ganske rask som det tar mindre enn 2 h og gjør oss i å definere omrisset av neuronal anslag. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motoriske Nevron ved å velge en GAL4 linje som uttrykker gjær GAL4 transkripsjon faktor i aCC, og krysser den med en grønn fluorescerende protein (GFP) reporter styrt av oppstrøms aktivisering sekvensen (UAS)21. En GFP merking teknikk som sådan krever et genetisk kors og dermed tar ekstra få dager.
En annen fordel med fargestoff merking er å tillate merking av plasma membranen ved en ekstremt høy tetthet. En tilstrekkelig tetthet av lipofile fargestoffer kan være til stede på alle deler av membranen, slik at vi løser de fine detaljene i en merket struktur. Derimot, tettheten av GFP molekyler er ofte avhengig av ventetiden etter at UAS-GAL4 systemet spark i. For eksempel begynner aCC å uttrykke GFP fra 10 h AEL. Ved 15 h AEL når vi observerer, er tettheten av GFP molekyler utilstrekkelig for å dekke over hele membranen. Det resulterer i utilstrekkelig merking av fine neuronal anslag (dk, upubliserte data).
Selv om denne teknikken gir flere fordeler, er det mindre fordelaktig når den feilaktige projeksjon av motor axons er tydelig. I fravær av omgå, for eksempel, motor neurons vise alvorlig axonal defekter som for tidlig stall, segmental grensekryssing, og overdreven forgrening22. Som en konsekvens, nå til en viss axon Terminal blir tungvint. Effektiviteten av merking er også alders avhengig, er effektiv i embryo yngre enn 20 h AEL. Som ekstracellulære matrise proteiner øke med utvikling, merking av motor neurons synes å være svært intrikate.
Teknikken er beskrevet her tillater oss å måle mange morfologiske parametre som neurite total lengde og antall, og neurite gren mønster og form15,16,17,23,24. Fordi lipofile carbocyanine fargestoffer kommer i mange farger (som DiO, DiA, DiI, DiD og DiR), er flerfarget merking av tilstøtende motor neurons også oppnåelig. Som vist i Figur 4, dendrites fra ACC og RP3 motor neurons mye overlapping. For å fremme vår forståelse i motor krets utvikling, vil mekanismene for dendrit-dendrit interaksjon bli undersøkt.
Her detalj vi den allsidige teknikken som gir en vei å studere neuronal tilkobling i motor kretsen. Selv om demonstrasjonen er begrenset til aCC og RP3 motor neurons i 15 h AEL, denne teknikken kan brukes til andre motoriske neurons i ulike stadier av embryoutvikling. Hvis en axon Terminal er tilgjengelig med en injeksjon micropipette, denne teknikken kan også brukes til merking av noen Nevron i larvestadiet og voksen stadier av fluer eller til og med i andre organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Kamiyama Lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B., og dk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
