Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Retrograd tracing av Drosophila embryonale motor neurons bruke lipofile fluorescerende fargestoffer
Chapters
Summary January 12th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.
Transcript
Sporingsteknikken som er beskrevet i denne protokollen hjelper oss med å studere nevronal morfogenese og snap tilkoblingen i motorneuronsystemet drosophila. Det lipofile fargestoffet kan raskt spre seg til alle deler av cellulær membran med ekstremt høy tetthet. Dette er grunnen til at vår protokoll effektivt løser å finne strukturer av en merket nevron.
Hvis en axonterminal er tilgjengelig med en injeksjonmikropipette, kan denne teknikken påføres enhver nevron i larval- og voksenstadiene av fluer eller i andre organismer. Hvis du ikke har erfaring med å dissekere eller bruke en mikroinjektor nøyaktig, kan operasjonen på prøven være utfordrende. Forstå anatomien til embryoet, vil hjelpe med veiledning til riktig porsjonering av verktøy for å utføre disseksjon eller en dinjection.
For å starte, forberede og layout alle embryo samle materialer. Forbered filtreringsapparatet ved å kutte et 50 milliliter rør, og kutte åpne et hull i hetten. Sett deretter inn et nettingfilter med 100 mikrometerporer mellom røret og hetten.
Forbered fargestoffinjeksjonen mikropipette og disseksjonsnålen fra samme kapillære slange med en indre diameter på 1,2 millimeter. Trekk slangen med en mikropipette, avtrekker på 7% fra 170 volt maksimal effekt for å skape en skarp nål med en taper på ca 0,4 centimeter i lengde. For å forberede fargestoffinjeksjonen mikropipette, suge jeksel med et fuktmiddel og plassere nålen på mikropipette klemmen på 25 til 30 grader.
Senk deretter spissen på to tredjedeler av radiusen ut fra midten av skråoverflaten. Grind nålen mens en sprøyte med rør skyver luft inn i den. Merk mikropipetten med en fin spiss permanent markør for å indikere plasseringen av åpningen på spissen etter skrånende fordi det kan være utfordrende å finne den smale åpningen som dannes i en vinkel.
La fluene legge egg over natten ved romtemperatur og samle røret med eggene om morgenen. For å samle embryoene, deklorer eggene på platen med 50% blekemiddel i fem minutter. Når klorene er ryddet, hell innholdet på platen gjennom filtreringsapparatet eller cellesilen for å isolere embryoene.
Bruk en klemflaske med vann til å fortynne blekemiddelet som er igjen på platen og samle så mange embryoer som mulig ved å dekantere blandingen inn i filteret. Vask embryoene tre til fire ganger med vann til blekemiddellukten forsvinner. Fjern filteret fra apparatet og vask dem på en annen ren plate med vann.
Deretter dekanterer vannet fra den nye platen som embryoene er på. Bruk fine tang til å velge fem til 10 embryoer på 15 timer etter egglegging og plasser dem på dobbeltsidig tape med dorsalsiden vendt opp. Legg insekt ringer saltvann til disseksjon bassenget for å beskytte embryoene mot uticcation.
Bruk en glassnål under et disseksjonsmikroskop for å dra embryoet ut fra middlingmembranen fra båndet på glasset, og vær forsiktig så du ikke skader embryoets indre vev. Skjær deretter gjennom midtlinjen av et enkelt embryo på overflaten fra sin bakre til fremre ende. Vend epitelvevet fra midten og fest epidermalkanten på overflaten av glasslysbildet.
Bruk en rørtilkoblet nål med en tuppåpning på ca. 300 mikrometer for å aspirere eller blåse luft for å fjerne dorsal langsgående trakeale stammer samt eventuelle gjenværende guts. Bruk 4% PFA og PBS for å fikse embryoene i fem minutter ved romtemperatur på en orbital shaker. Vask dem deretter tre ganger med PBS.
Flekk embryoene med en mikroliter anti pepperrot peroksidase antistoff konjugert med Cyanine3 fargestoff og 200 mikroliter PBS i en time på orbital shaker. Og gjenta vaskene i PBS. For å fylle injeksjonmikropipetten, plasser den i kapillærholderen.
Deretter plasserer fargestoffet glidd på scenen og bruk mikromanipulatoren til å plassere den over lysbildet. Juster deretter scenen for å plassere mikropipetten på fargestoffet. Samle fargestoffet i mikropipetten ved å sette injeksjonstrykket til mellom 200 og 500 hektoscal, injeksjonstiden mellom 0,1 og 0,5 sekunder og kompensasjonstrykket til null i fem minutter.
Når fargestoffet er samlet inn, fjern fargelysbildet og plasser prøven på mikroskopstadiet. Øk deretter kompensasjonstrykket til et område på 30 til 60 hektascal og senk mikropipetten i prøven. Bruk 10 ganger objektiv objektiv for å finne embryoet og justere mikropipetten med embryoet.
Endre objektivet til en vannnedsenking 40 ganger linse. Og senk linsen ned i PBS. Bruk fluorescensmikroskopi for å kontrollere den nevronale morfologien merket av anti-HRP Cy3 og bestemme injeksjonsstedet.
Når embryoet er i fokus endre plasseringen av mikropipetten for å gjøre mild kontakt med spissen av akson av interesse. Bruk deretter lys feltmikroskopi under injeksjonen for å se fargedråpen. Slipp fargestoffet i høyre abdominal hemisegment ved det nevromuskulære krysset mellom aCC eller RP3 med enten DiD eller DiO.
Bruk håndkontrollen til å frigjøre fargestoffet og fjerne mikropipetten. Deretter går du videre til neste injeksjonssted. Inkuber prøven i en time ved romtemperatur på en orbital shaker før avbildning.
Bruk fine tang, fjern båndene fra glasslysbildet. For å montere prøven, klargjør en dekselslipp med en liten mengde vakuumfett i de fire hjørnene. Plasser den forsiktig på prøven, og sørg for å unngå luftbobler.
Skyv ned dekselseddelen for å justere plassen fra prøven for å tillate arbeidsavstand mellom objektivet og lysbildet. Fjern overflødig PBS med oppgaveservietter. Fullstendig forsegle kantene av dekselet slip med neglelakk.
Bilde på 10 ganger og 100 ganger forstørrelse med et konfokal mikroskop og behandle bildene, med imageJ-programvaren. Denne protokollen ble brukt til å retrograd merke aCC motor neuron innervating muskel en og RP3 motor neuron innervating muskler seks og syv. Dendrittiske grener fra ACC og RP3 motornevroner viser omfattende overlapping.
Begge nevronene er bipolare, og etablerer to forskjellige populasjoner av dendritter. For å demonstrere de kvantitative egenskapene til denne metoden, ble det totale antallet dendritttips talt i vill type og Dscam1 mutanter. Ipsilaterale dendritter av aCC er vist for vill type, men få ipsilaterale dendritt ble observert for Dscam1 mutant.
Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at størrelsen på fargedråpen er avgjørende, som er ca 10 til 20 mikrometer. Test størrelsen på dobbeltsidig tape og bruk den deretter på injeksjonsstedet. Ved hjelp av denne prosedyren kan vi dra nytte av bildet som kan byttes egenskapen til DiD-sonde for å oppnå superoppløsningsbilder av plasmamembranen.
På denne måten kan vi studere den ultra strukturelle karakteriseringen av synaptiske membraner ved det nevromuskulære krysset. Vi klikket. Vi utførte fenotypisk analyse av aCC dendritt i mutant belastning, og oppdage at en Dscam1-Dock-Pak injeksjon definerer stedet for dendritt utvekst i aCC.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
