Summary
Her presenterer vi en protokoll for å studere in vivo lokalisering av antistoffer i mus tumor xenograft modeller.
Abstract
Monoklonale antistoffer er multifunksjonelle legemidler med høy affinitet som virker ved variable uavhengige mekanismer for å eliminere kreftceller. I løpet av de siste tiårene har feltet antistoff-medikamentkonjugater, bispesifikke antistoffer, kimeriske antigenreseptorer (CAR) og kreftimmunterapi dukket opp som det mest lovende området for grunnleggende og terapeutiske undersøkelser. Med mange vellykkede menneskelige studier rettet mot immun kontrollpunkt reseptorer og CAR-T celler i leukemi og melanom i et gjennombrudd tempo, Det er svært spennende tider for onkologiske terapier avledet fra varianter av antistoff engineering. Dessverre har et betydelig stort antall antistoff- og CAR-baserte terapeutiske midler også vist seg skuffende i menneskelige studier av fast kreft på grunn av begrenset tilgjengelighet av immuneffektorceller i tumorsengen. Viktigere, uspesifikk fordeling av terapeutiske antistoffer i vev annet enn svulster bidrar også til mangel på klinisk effekt, assosiert toksisitet og klinisk svikt. Som trofast oversettelse av prekliniske studier til menneskelige kliniske stier er svært avhengig av mus tumor xenograft effekt og sikkerhetsstudier, her fremhever vi en metode for å teste svulsten og generell vevfordeling av terapeutiske antistoffer. Dette oppnås ved å merke protein-A renset antistoff med nær infrarød fluorescerende fargestoff etterfulgt av levende avbildning av tumorbærende mus.
Introduction
FDA godkjente det første monoklonale antistoffet rettet mot CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de neste tjue årene har det vært en rask eksplosjon innen antistoffteknikk på grunn av den overveldende suksessen til antistoffer mot immunkontrollpunkthemmere3. Ved siden av indirekte aktivering av immunsystemet, antistoffer blir rettet mot å direkte flagge kreftceller for å nøyaktig engasjere immun effektorceller, utløse cytotoksisitet via død reseptoragonist, blokkere tumorcelle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vekst av blodkar), begrense immun kontrollpunkt regulatorer, levere radioisotoper, kjemoterapi narkotika og siRNA som en konjugert agenter2. I tillegg er det å studere enkeltkjedevariable fragmenter (scFv) av ulike antistoffer på overflaten av pasientavledede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et raskt voksende område av kliniske undersøkelser for cellebaserteterapier 4.
Den ultrahøye affiniteten til antistoffbaserte legemidler som gir selektivitet til antigen som uttrykker tumorceller, gjør det til et attraktivt middel. Likeledes, målrettet levering og tumor oppbevaring av et terapeutisk antistoff (eller et kjemisk stoff) er nøkkelen til å balansere effekten over toksisitet. Derfor utnyttes et stort antall proteiningeniørbaserte strategier som inkluderer, men ikke er begrenset til bispesifikke5 og trispesifikkeantistoffer 6 for å forbedre ivrig optimalisert tumorretensjon av intravenøst (IV) injiserte terapeutiskemidler 5,7. Her beskriver vi en enkel fluorescensbasert metode for å håndtere tumor- og vevsfordelingen av potensielt effektive anti-kreftantistoffer.
Fordi dyrevev har autofluorescen når de er begeistret i synlig spektrum, ble antistoffene opprinnelig merket med nær infrarød fargestoff (f.eks. IRDye 800CW). For bevis på konseptundersøkelser har vi benyttet folatreseptor alfa-1 (FOLR1) rettet mot antistoff kalt farletuzumab og dets derivat kalt Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antistoff som er rettet mot FOLR1 og dødreseptor-5 (DR5)8 i ett rekombinant antistoff. FOLR1 er en veldefinert overuttrykt målreseptor i eggstokkreftceller og TNBC kreftceller, tumor xenografts og pasientsvulster9. Spesielt er det flere anstrengelser for å klinisk utnytte FOLR1 ved hjelp av antistoffbaserte tilnærminger for å engasjere immuneffektorceller og antistoffkonjugater (ADC) for eggstokkreft og brystkreft10,11.
I dette metodepapiret klonet, uttrykte og renset vi klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrollantistoffer ved hjelp av CHO-uttrykkssystemet. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistoff kalt abagovomab12 ble brukt som negative kontroller. Etter protein-A rensing, indikerte antistoffer ble merket med IRDye 800CW og ble administrert inn i halen vene av nakne mus enten bærer ovarietumor xenografts eller stabilt transfected menneskelig FOLR1 uttrykker murine tykktarmskreft xenografts. Antistoff lokalisering ble sporet av live imaging ved hjelp av in vivo bildespekteret på flere forskjellige tidspunkter7. Denne metoden krever ingen genetisk modifikasjon eller injeksjon av substratet for å muliggjøre lysutslipp og er betydelig raskere, kostnadseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, uttrykks-, rense- og merkingsprotokollen beskrevet nedenfor kan brukes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistoff hvis tunge og lette kjedesekvenser er tilgjengelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrene som involverer dyr håndtering og tumor xenografts studier ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her ved University of Virginia og i samsvar med de relevante regulatoriske standarder
1. Uttrykk og rensing av antistoffer
- Vedlikehold av CHO-celler
- Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media supplert med kommersielt tilgjengelig 1x glutamin supplement ved 37 ° C risting ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjelp av avlange Erlenmeyer flasker enten glass eller disponibel.
MERK: Det anbefales sterkt å bruke en forvirret kolbe med ventilert hette for økt agitasjon og for å forbedre gassoverføringen under ristingstilstand. Betydelig redusert antistoffutbytte er oppnådd med vanlige flasker (ikke-forvirret) på grunn av begrenset agitasjon av suspensjonskulturen. - Oppretthold cellenummeret mellom 1-5 x 106 celler/ml med >95 % celle levedyktighet. Hvis cellenummeret øker over 5 x 106 celler/ml, deler du cellene. Cho-celler må aldri nå under 0,2 x 106 celler/ml.
- Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media supplert med kommersielt tilgjengelig 1x glutamin supplement ved 37 ° C risting ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjelp av avlange Erlenmeyer flasker enten glass eller disponibel.
- Transfection av CHO celler
- Vokse CHO celler i 200 ml media (2 x 106 celler / ml) i delong Erlenmeyer forvirret flasker.
MERK: Suspensjonskulturer dyrket i forbløffede flasker har alltid produsert høyere proteinavlinger vs når de dyrkes i ikke-forbløffede flasker. - I et 15 ml rør tar du 5 ml CHO FreeStyle-medier og legger til 50 μg VH-klone-DNA og 75 μg VL-klone-DNA. Vortex å blande godt.
- Inkuber DNA-blandingen ved romtemperatur i 5 min.
MERK: Lengre inkubasjon reduserer proteinutbyttet. - Tilsett 750 μL μL 1 mg/ml polyetylenimin (PEI) lager til DNA-oppløsningen og aggressivt vortex blandingen i 30 s. Inkuber ved romtemperatur i ytterligere 5 min.
MERK: PEI må gjøres frisk. Multippel fryse tine syklus av PEI reduserer den totale avkastningen betydelig. - Tilsett hele blandingen av DNA og PEI på cellene mens du rister kolben manuelt. Inkluber umiddelbart de forlengede Erlenmeyer-forbløffede flasker med celler ved 37 °C risting ved 130 o/min.
- Vokse CHO celler i 200 ml media (2 x 106 celler / ml) i delong Erlenmeyer forvirret flasker.
- Uttrykk
MERK: Antistoffet har sekretorisk signalpeptid konstruert til sin N-terminal ende, noe som hjelper antistoffer til å bli utskilles ut i media.- Vokse de trans infiserte cellene ved 37 ° C, med risting på 130 rpm på dag 1.
- På dag 2, tilsett 2 ml 100x anti-klumping agent og 2 ml 100x anti-bakteriell-anti-mycotic løsning. Skift kolben til lavere temperatur (32-34 °C), med risting ved 130 o/min.
- På hver femte dag, legge til 10 ml Tryptone N1 feed, og 2 ml av 100x glutamin supplement.
- Fortsett å telle cellene hver tredje dag ved hjelp av hemocytometer etter flekker en aliquot av celler med trypan blå flekk. Kontroller at cellelevebiliteten holder seg over 80 %.
- På dag 10 eller 11 høst mediet for antistoffrensing. Spinn kulturen ved 3000 x g,4 °C i 40-60 min og filtrer deretter det klare mediet med 0,22 μM flaskefiltre.
- Rensing
MERK: Renserensing av antistoff utføres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige Protein-A-kolonne (se Materialseksjon), ved hjelp av en peristaltisk pumpe.- Likevekt kolonnen med to kolonnevolum av bindingsbuffer (20 mM natriumfosfat ved pH 7,4).
- Før det filtrerte mediet som inneholder antistoff (oppnådd i trinn 1.3.5) gjennom kolonnen med en strømningshastighet på 1 ml/min.
- Vask kolonnen med to-kolonne volum av bindingsbuffer.
- Elute antistoffet i 500 μL fraksjoner ved hjelp av 5 ml elution buffer (30 mM natriumacetat ved pH 3,4).
- Nøytraliser pH-en til det eluterte antistoffet ved å tilsette 10 μL nøytraliseringsbuffer (3 M natriumacetat ved pH 9) per brøk.
MERK: Brøknummer 3-6 inneholder det meste av antistoffet. Det anbefales å holde alle brøkene i tilfelle antistoffet er eluted i en senere brøkdel enn forventet. - Mål konsentrasjonen av renset antistoff ved hjelp av et spektrofotometer ved å velge standardprotokollen for IgG. Den endelige konsentrasjonen av antistoffet oppnås i mg/ml ved å vurdere den molekylære vekten og absorpsjonskoeffisienten.
2. Fluorescerende merking
MERK: Antistoffer er merket med det infrarøde fargestoffet som inneholder en NHS ester reaktiv gruppe, som par til proteiner og danner en stabil konjugat. Denne reaksjonen er pH-sensitiv og fungerer best på pH 8.5. Fluorescerende konjuger merket med fargestoffet viser en absorpsjon maksimalt 774 nm, og et utslipp maksimalt 789 nm. pH 8.5 er nøkkelen til effektiv bøyning.
- Dialyse 0,5 ml av antistoffet ved hjelp av en dialysekassett (0,1-0,5 ml) i 1 L konjugeringsbuffer (50 mM fosfatbuffer ved pH 8,5). Etter 4 timer overføre dialysekassetten til frisk buffer og dialyze over natten.
- Sett opp en konjugeringsreaksjon ved å tilsette 0,03 mg IRDye 800CW per 1 mg antistoff i et reaksjonsvolum på 500 μL.
MERK: IRDye 800CW oppløses i DMSO med en konsentrasjon på 10 mg/ml. - Utfør merkereaksjoner i 2 timer ved 20 °C.
MERK: Økende tid utover 2 timer forbedrer ikke merkingen. - Rens merkede konjugater ved omfattende dialyse mot 1x PBS.
- Anslå graden av merking ved å måle absorpsjonen av fargestoffet ved 780 nm og absorpsjon av proteinet ved 280 nm. Fargebidraget til 280 nm-signalet er 3%.
- Beregn fargestoffet / proteinforholdet ved hjelp av denne formelen:
hvor 0,03 er en korreksjonsfaktor for absorpsjonen av fargestoffet som brukes ved 280 nm (lik 3,0 % av absorbansen ved henholdsvis 780 nm), εFargestoff og εProtein er molarutryddelseskoeffisienter for henholdsvis fargestoffet og proteinet (antistoffet).
MERK: εFargestoff er 270 000 M-1 cm-1 og εProtein er 203 000 M-1 cm-1 (for en typisk IgG) i 1:1 blanding av PBS: metanol. Andre proteiner enn IgG kan ha svært forskjellige molar utryddelseskoeffisienter. Bruk av korrekt utryddelseskoeffisient for protein av interesse er avgjørende for nøyaktig bestemmelse av D / P-forhold. - Beregn den endelige proteinkonsentrasjonen ved hjelp av denne formelen:
MERK: Bekreft alltid den antigenbindende effekten av merket og umerket antistoff ved bruk av ELISA (Enzymbundet immunosorbentanalyse) eller strømningscytometri før du går videre til in vivo-studier.
3. Mus xenograft studier
- Fremstilling av tumorceller til injeksjon
- Vokse OVCAR-3 celler i RPMI-1640 Medium, supplert med 10% av FBS og 1x penicillin-streptomycin.
- Dagen før injeksjonen, subkultur celler i nye 100 mm kulturretter med 10 ml komplett medium / parabolen. Bruk cellenummer på 0,5-1 x 106 celler/fat.
- Inkuber kulturer ved 37 °C temperatur, 95 % fuktighet og 5 % CO2 i 20-24 timer.
- På injeksjonsdagen fjerner du vekstmediet fra kulturretter. Skyll cellelaget grundig med Ca2+/Mg2+ gratis Dulbeccos fosfatbufret saltvann (DPBS) for å fjerne døde celler, cellulært avfall og alle spor av serum, noe som kan forstyrre trypsin-virkning.
- Trypsinize cellene ved å legge til 1,0-1,5 ml Trypsin-EDTA løsning til hver tallerken og prøve å spre løsningen ved å vippe parabolen rundt etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 5-10 min.
MERK: Observer celler under et invertert mikroskop for å kontrollere den faktiske trypsiniseringsstatusen. Under trypsinisering resulterer i lavere antall celleavløsning fra overflaten av kultur parabolen, over trypsinisering induserer cellulær stress. Så riktig trypsinisering er viktig. - Tilsett 1,0-1,5 ml komplett vekstmedium til hver tallerken for å stoppe trypsin-handlingen, etter at re-suspendere celler ved å pipettering forsiktig.
MERK: Skånsom pipettering er viktig for å opprettholde cellehelsen. - Samle cellefjæringen i et konisk rør på 15 ml og spinn ved 250 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Samle cellepellet etter å ha fjernet supernatant og vask cellene ved å re-suspendere pellet i 1x DPBS.
- Spinn cellefjæringen ved lav hastighet 250 x g i 5 min.
- Tilsett 500 μL DPBS og re-suspendere celler ved mild pipettering for å få enkeltcellesuspensjon.
- Telle celler ved hjelp av hemocytometer eller automatisert celle teller.
MERK: For bedre nøyaktighet gjentar du tellingen tre ganger og tar et gjennomsnitt. - Juster volumet på en slik måte slik at den endelige celletettheten vil være 1 x10 8 celler / ml.
- Subkutan injeksjon av celler for å utvikle mus xenografts
MERK: Alle prosedyrer bør gjøres i et BSL2 sikkerhetsskap. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ mus har blitt brukt i den nåværende studien.- Ta 50 μL av cellefjæringen inn i et 1,5 ml rør og bland med 50 μL kjellermembranmatrisemedium.
MERK: Kjellermembranmatrisemediet har en tendens til å danne en gellignende tilstand ved romtemperatur, så hold forsiktig cellene og matrisemediumblandingen på is. Det anbefales å holde rør, tips og sprøyter i kjøleskapet og deretter overføre på is før dyreinjeksjonen. - Agitate blandingen for å unngå celle klumper. Deretter tar du denne 100 μL av cellefjæringsmatrisemediblandingen som inneholder 5 x 106 celler, inn i en 1 cc sprøyte.
- Løft dyrets hud forsiktig for å skille huden fra det underliggende muskellaget og sakte injisere cellefjæringen (100 μL) under huden (5 x 106 celler), med en 26 G nål. Vent noen sekunder før du tar nålen ut, slik at kjellermatrisemediet kan danne den halvfaste gelen som struktur sammen med celler under huden, og forhindrer at blandingen kommer ut fra injeksjonsstedet.
MERK: Celler må testes før injeksjon for kontaminering som kan skade immunsvikt. Mens sprøytebruk ikke sette nålen for dypt inn i huden som dette kan danne svulsten dypere enn forventet. - Hold dyret i et sterilt bur og observer i rundt 20 min.
- Vær oppmerksom på musene i 2-3 uker og la svulsten vokse opp til 500 mm3 størrelse.
- Ta 50 μL av cellefjæringen inn i et 1,5 ml rør og bland med 50 μL kjellermembranmatrisemedium.
4. Lokalisering av antistoffer ved hjelp av et in vivo-bildesystem
MERK: In vivo bildeutstyr (se Materialtabell) som brukes i dette eksperimentet bruker et sett med høyeffektive filtre og spektrale algoritmer for ikke-invasiv visualisering og sporing av cellulær og genetisk aktivitet i en levende organisme i sanntid. Systemet gir både fluorescens og bioluminescens overvåking evne.
- Injiser 25 μg fargestoff merket antistoff via halevenen.
- Bedøve tumorbærende mus ved hjelp av 2% isofluran. Kontroller mangelen på respons på pedalreflekser.
- Når musene slutter å bevege seg, utvider du lateral halevenen ved å bruke ormvann.
- Injiser 25 μg (i 100 μL) merket antistoff ved hjelp av 1 cc insulinsprøyte med en 26 G kanyle.
- Tilsvarende, som en negativ kontroll, etikett og injisere det ikke-spesifikke IgG1 Isotype antistoffet som ikke retter seg mot kreftceller.
- Utfør in vivo live imaging etter 8, 24, 48 h, etc. av antistoffinjeksjoner.
- I den tilknyttede programvaren klikker du initialiser plassert i kontrollpanelet og bekrefter at scenetemperaturen er 37 °C.
- Slå på oksygentilførselen, alle pumpene på anestesisystemet, isoflurangasstilførselen til bedøvelseskammeret og sett isofluranfordamperventilen til 2%.
- Overfør musene til bedøvelseskammeret og vent til musene er helt bedøvet. Påfør øyesmøringssalven for å unngå tørking av øynene.
- Gå til kontrollpanelet,sett opp fluorescensbildebehandling gjennom Bildeveiviser-alternativet og velg eksitasjonen ved 773 nm og utslipp ved 792 nm.
MERK: Standardinnstillingene for automatisk eksponering gir et godt fluorescerende bilde. Innstillingene for automatisk eksponering kan imidlertid endres i henhold til behovene. - Overfør de bedøvede musene inn i bildekammeret og monter den på bildefeltet ved hjelp av nesekjegle. Bildestadiet gir mulighet til å romme 5 mus om gangen.
MERK: Har kontrollmus avbildet sammen med testmusene for å ha en lignende mengde eksponering og andre innstillinger under analyse. - Når alt er klart, velger du Hent alternativet på kontrollpanelet for bildeinnhentelsen.
- Med Autoexposure-innstillinger genererer systemet bildet innen et minutt. Det genererte bildet er overlegget av fluorescens på fotografisk bilde med optisk fluorescensintensitet som vises i enheter av tellinger eller fotoner, eller når det gjelder effektivitet.
- Etter å ha fått bildet, overfør musene fra bildekammeret tilbake til buret og observere for deres utvinning i 1 til 2 min.
- Finjuster bildet ytterligere med verktøyene og funksjonene som tilbys i programvaren for bildeanalyse. Bildeanalyseverktøy er på menylinjen og verktøypaletten.
- Juster lysstyrken,kontrasten eller tettheten under Bildejustering, og velg fargeskalaen.
- Bruk ROI Tools til å angi et interesseområde (ROI) i et optisk bilde og måle signalintensiteten i avkastningen. Eksporter om nødvendig de kvantifiserte signaldataene til en regnearkprogramvare og plotte dataene.
- For oppfølgingsstudier, analysere mus necropsies av ulike vev (f.eks, lever, lunge, hjerte, nyre, milt, hjerne etc.) side om side for en detaljert ikke-spesifikk fordeling av fluorescerende merket antistoff.
MERK: Data kan videre støttes med vevsspesifikk ELISA ved å bruke antigen (FOLR1 i dette tilfellet) i 96 brønnanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den beskrevne metodikken klonet vi først antistoffer rettet mot folatreseptor alfa-1 (FOLR1) kalt farletuzumab, og et bispesifikt antistoff kalt BaCa bestående av farletuzumab og leksatumumab sammen med kontrollantistoffer som abagovomab (sekvenser gitt i supplerende fil 1). Detaljer om representative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domener i DNA-kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For å bekrefte de positive klonene, utførte vi kolonien PCR ved hjelp av signalpeptid fremover (SP For) og CK Rev / CH3 Rev primere (sekvenser gitt i supplerende fil 1). Representative resultater av koloni PCR bekrefter de forventede størrelsene på lette og tunge kjeder (figur 1C). Positive antistoffkloner ble også bekreftet ved hjelp av Sanger sekvensering. Etter bekreftet pVH- og pVL DNA-kloning ble transinfeksjoner utført ved hjelp av CHO-suspensjonskulturer, etterfulgt av protein-A-kolonneaffinitetsrensinger av antistoffer ved 4 °C (se figur 1B og protokoll for detaljtrinn).
Representative resultater av renset farletuzumab sammen med annen kontroll IgG1 (unntatt BaCa antistoff kjøre på ikke-redusere og redusere SDS PAGE er vist i figur 2A. Som tydelig produserte tunge og lette kjeder 50 og 25 KDa-bånd etter reduksjon. Dette ble etterfulgt av bindende bekreftelse av antistoffer mot innfødte proteiner på celleoverflaten. Representativ farletuzumab binding til human FOLR1 på OVCAR3 celler overflaten er vist ved hjelp av strømningscytometri (figur 2B).
Neste fluorescerende merkede antistoffer var halevenen injisert i dyr podet med FOLR1 som uttrykker svulster (figur 3). Dyr ble levende avbildet på flere tidspunkter ved hjelp av IVIS. Dataene bekrefter selektiv berikelse av FOLR1 og BaCa antistoffer i FOLR1+ svulster (figur 4 og figur 5). Viktigere kontroll antistoffer (negativt for tumorantigen) lokaliserte ikke til svulster.
Figur 1: Skjematisk antistoffkloning, uttrykk og rensing.
(A) Viser detaljene skjematisk av tunge (pVH) og lette (pVL) kjedevektorer. (B) pVH vektor bærer variabel domene sekvens av en IgG1 tung kjede og pVL vektor bærer variabel domene sekvens av en lyskjede ble blandet sammen (1:2 ratio) sammen med transfection reagenser (som mirus eller PEI) før du legger til suspensjon kultur av CHO eller HEK celler. Celler ble matet med supplerende fôr neste dag og kulturer ble overvåket i 10 ekstra dager med intermitterende fôring. På dag 11 ble cellene høstet gjennom 0,2 μm PES-filtre etterfulgt av affinitetkromatografi ved hjelp av protein-A. Rensede antistoffer ble deretter analysert for % monomer (FPLC), bindingsaktivitet (ELISA eller SPR) og binding til målantigenet (FACS) på levende celler. Antistoffer kan også kontrolleres for in vivo-analyser (f.eks. celleveksthemming, cellevariabilitetsanalyser eller hemming av signalisering av mellomliggende fosforylering osv.). Antistoffer kan også konjugeres med fjernrøde fargestoffer, for eksempel IRDye 800CW for in vivo-bildebehandling. ± IRDye 800CW må testes for aktiviteter før tumor- og vevsdistribusjonsstudier. (C) Agarose geler av koloni PCR bekrefter størrelsen på positiv tung (1,4 Kb) og lyskjede (0,8 Kb) kloner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: En gelbasert reduksjonsanalyse for å bekrefte antistoffintegriteten.
(A)Fire forskjellige IgG1 antistoffer (skjematisk vist på toppen) ble lagt til ± reduserende middel (for eksempel BME eller DTT) ved 95 ° C i 10 min. Antistoffer ble deretter lastet på en 10% SDS-PAGE gel etterfulgt av proteinfarging og avbildning. Gelbilde i venstre og høyre viser tydelig det intakte antistoffet og to separate polypeptider (henholdsvis ~ 50 KDa og ~ 25 KDa). Se også pVH- og pVL-vektorkart (figur 1) som bærer cDNA tilsvarende VH/VL-, CH1/CK-, CH2- og CH3-domener. (B) Flow cytometri bekreftelse av umerkede og IRDye 800CW merket farletuzumab bindende til innfødte FOLR1 på eggstokkreftceller. Ikke-reduserende = Antistoff kjøre på gel med ikke-reduserende fargestoff, Redusere = Antistoff kjøre på gel med redusere fargestoff, HC = Heavy chain, LC = Lys kjede, VL = Variabelt domene av lyskjede, VH = Variabelt domene av tung kjede, CK = Kappa kjeden Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksperimentell skjematisk av tumorgenerering og antistoffbehandlinger.
6-8 uker gamle mus stammer som: Immunodeficient athymic nude / NSG / Immunocompetent C57BL / 6 eller Balb / C mus kan lett podes med tumorceller via subkutane (SQ) svulster. Lignende studier kan utføres ved hjelp av brystfett-pad og intraperitoneal (IP) svulster. 3-4 uker senere (tumor ~200 mm3),mus ble IV injisert med en IRDye merket indikerte antistoffer som var ± selektive mot tumor-overuttrykt reseptor. Dette ble etterfulgt av live in vivo imaging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Lever in-vivo avbildning av menneskelige OVCAR3 tumorbærende mus.
Tilfeldig valgt 6 til 8 uker gammel (Alder) og 20-25 gram (Vekt) hårløs athymisk Nude Foxn1nu/ Foxn1+ (Envigo) ble podet med FOLR1+ ovarietumorer (OVCAR-3 celler). Etter 3 uker med tydelige svulster ble mus halevene injisert med IRDye 800CW merket IgG1-kontroll, abagovomab (CA-125 anti-idiotypisk antistoff), farletuzumab (anti-FOLR1 antistoff) og BaCa (anti-FOLR1-DR5 antistoff) etterfulgt av levende bildebehandling på angitte tidspunkter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Lever in-vivo avbildning av menneskelig FOLR1 som uttrykker murine MC38 celle avledet tumorbærende mus.
(A) Tilfeldig valgt 6 til 8 uker gammel (Alder) og 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ eller nakne mus ble SQ injisert med murine MC38 celler stabilt uttrykker menneskelig FOLR1. Ved tumorutseende ble mus halevene injisert med IRDye 800CW merket IgG1-kontroll, abagovomab (CA-125 anti-idiotypisk antistoff), farletuzumab (anti-FOLR1 antistoff) og BaCa (anti-FOLR1-DR5 antistoff) etterfulgt av levende avbildning til angitte tider. (B)Etter 7 dager ble dyr eutanisert og isolerte nøkkelorganer (som indikert) avbildet sammen med transplanterte svulster for relativ antistoffsignal (IRDye 800CW) fordeling. Som forventet forble svulster negative med IRDye 800CW signal i IgG1 kontroll og CA-125 anti-idiotypisk antistoff, abagovomab injisert dyr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende fil 1: Sekvenser av alle antistoffer og primere. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektiv og tumorvev spesifikk levering av anti-kreft terapeutisk middel er nøkkelen til å måle effekt og sikkerhet av en gitt målrettet terapi13. Her har vi beskrevet en rask og effektiv tilnærming for å undersøke detaljert vev og tumorfordeling av klinisk, farletuzumab og et ikke-klinisk BaCa-antistoff. Den beskrevne tilnærmingen gjelder for ethvert nylig generert antistoff og kan brukes sammen med et klinisk effektivt antistoff (med ønskede egenskaper) for sine tumor / organfordelingsegenskaper. Tatt i tanke på de fleste antistoffmålreseptorer (som HER2 i brystkreft) er svært overuttrykt i tumorceller (vev), i de fleste tilfeller er deres suboptimale uttrykk og funksjon også kritisk i andre celletyper enn tumorceller14. For eksempel akkumuleres en betydelig andel av EGFR rettet mot kliniske antistoffer hos pasienter med tykktarmskreft og forårsakertoksisitet for hudvev 15, et ikke-kreftvev hvis vekst og differensiering krever EGFR-signalering og funksjon. Derfor tror vi sterkt at slike foreløpige vevsdistribusjonsundersøkelser i kombinasjoner med levertoksisitet og vev histochemistryanalyser i en større kohort av dyr er nøkkelen til å grundig vurdere sikkerhet og terapeutisk levedyktighet av det nylig genererte antistoffet. Videre vil beskrevne vevsdistribusjonsstudier også være svært anvendelige i immunkomentable mus xenograft studier, hvis det nylig genererte antistoffet opprettholder kryssreaktivitet til murine motstykke antigen / reseptor. I syngeneiske dyrestudier, sammen med tumordistribusjon og vev histochemistry studier, detaljert blod cytokin analyse kan brukes til å styrke effekt og sikkerhetsdata. Et attraktivt trekk ved den beskrevne tilnærmingen er at den tillater nær nøyaktig mengde antistofffordeling hvis data i tillegg støttes med ELISA (mot målantigen) fra svulsten og andre betydelige vevslylater (som lever, hjerte, lunge, milt, nyre etc)7. Et annet viktig trekk ved beskrevet metode over enkelt foton utslipp computertomografi (kalt SPECT) og posisjon utslipp tomografi (PET) erkostnadseffektivitet 16. Både SPECT og PET er svært dyre og gjør bruk av radioaktive tracers for avbildning, noe som gjør hele prosessen tungvint hvis du tester en stor kohort av dyr17. I tillegg spect og PET bildebehandling fasiliteter er ikke veldig standard i laboratorier og vivariums å studere små dyremodeller av sykdommer som mus18.
En begrensning med beskrevet metode for å oppnå en nesten nøyaktig mengde antistoffsvulstfordeling er avhengigheten av høy affinitetsmålantigenbinding. Det er fordi høy affinitet antigen-antistoff interaksjoner kan resultere i "målmediert narkotika disposisjon (TMDD)" ved forbedret endocytose og shuttling til lysosomer19. Derfor vil resultatene av den beskrevne tilnærmingen variere avhengig av den bestemte målreseptoren i en bestemt tumortype. Vi anbefaler derfor på det sterkeste å teste merkede antistoffer/antistoffer i en stor kohort av dyr med tumorxenografter generert med mer enn én tumorcellelinje(er) som har variabelt (heterogent) uttrykk for målantigenreseptor. Det anbefales også sterkt å benytte seg av mer enn én fluorescerende konjugatfarge(er) og musstamme(er) for de foreslåtte studiene.
Tatt i tanke på at små størrelse antistoffer som Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, etc. (mangler berging resirkulering av neonatal Fc reseptor (FcRn) klart raskere fra svulster (med serum halv ganger blir minutter til timer), bør det tas hensyn til å sammenligne data mellom ulike tumortyper som har svært variabel FcRn uttrykk. Videre har større molekyler (som doble og trispesifisitetsantistoffer) som er konstruert med Fc-domene for bergingsgjenvinning, vev / tumorpenetrasjonsproblemer. I disse scenariene vil den beskrevne tilnærmingen ikke være egnet til å sammenligne vev / tumorfordeling av antistoffer som varierer betydelig i størrelser6. Når det gjelder betydning, ville imidlertid de beskrevne tumor- og detaljerte vevsdistribusjonsstudiene sammen med deres motstykke monospesifikke antistoffer tjene som en nøkkelfaktor i en effektiv dual and trispecificity antistoffplattformdesign. Til slutt, siden høyere affinitet og aviditetsoptimaliserte antistoffer generelt har en betydelig homogen fordeling i svulster, bør målsvulsten epitopvalg (mangler TMDD), generell antistoffaffinitet og biologisk aktivitet i en bestemt kreftmodell alltid vurderes før man konkluderer med tumorpenetrasjon, sikkerhet og effekt.
Oppsummert har vi beskrevet en rask og enkel metode for overvåking av tumor- og vevsfordelingen av intravenøst injiserte antistoffer. Den beskrevne tilnærmingen har gitt potensial til å analysere antistoff-siRNA konjugater (der siRNA er merket), antistoff-narkotika konjugater (der stoffet er merket) og antistoff-nanopartikler (der nanopartikkellipider er merket med fluorescerende fargestoff). Likeledes, en unikt konstruert cystein rester i en svulst rettet mot scFv (hvis fluorescent merket med melamid kjemi) av kimeriske antigen reseptor T-celler (CAR-T) og CAR-NK vil være en kostnadseffektiv tilnærming til å analysere tumor / vev distribusjon av disse cellebaserte terapier uavhengig av viral transfection basert GFP / RFP signaler strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere etterforsker av Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dette arbeidet ble støttet av NCI/NIH stipend (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gjennombrudd nivå-1 award til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering award (OC180412) til J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
