Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60727
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

Abstract

נוגדנים חד-קלונליים הם תרופות רב-תכליתיות עם זיקה גבוהה שעובדות על ידי מנגנונים עצמאיים משתנים כדי לחסל תאים סרטניים. במהלך העשורים האחרונים, התחום של נוגדנים-סמים התווסדו, נוגדנים דו-ספציפיים, קולטני אנטיגן כימריים (CAR) ואימונותרפיה סרטן התגלה כתחום המבטיח ביותר של חקירות בסיסיות וטיפוליות. עם ניסויים בבני אדם מוצלחים רבים המתמקדים קולטני מחסום חיסוני ותאי CAR-T בלוקמיה ומלנומה בקצב פורץ דרך, זה זמנים מרגשים מאוד עבור טיפולי אונקולוגיים נגזר וריאציות של הנדסת נוגדנים. למרבה הצער, מספר גדול באופן משמעותי של נוגדנים וטיפולים מבוססי רכב הוכיחו גם מאכזב בניסויים בבני אדם של סרטן מוצק בגלל הזמינות המוגבלת של תאי השפעה חיסונית במיטת הגידול. חשוב לציין, הפצה לא ספציפית של נוגדנים טיפוליים ברקמות אחרות מאשר גידולים גם לתרום לחוסר יעילות קלינית, רעילות הקשורים וכשל קליני. כמו תרגום נאמן של מחקרים פרה-קליניים לתוך שבילים קליניים אנושיים הם מאוד להסתמך על עכברים גידול xenograft יעילות ובטיחות מחקרים, כאן אנו מדגישים שיטה כדי לבדוק את הגידול ואת התפלגות רקמות כללית של נוגדנים טיפוליים. זה מושגת על ידי תיוג נוגדן מטוהר חלבון-A עם צבע פלורסנט אינפרא אדום ליד ואחריו הדמיה חיה של עכברים נושאים גידול.

Introduction

ה-FDA אישר את הנוגדן המונוקלונלי הראשון מיקוד CD3 (OKT3, Muromonab) בשנת 19861,2. מאז, בעשרים השנים הבאות, היה פיצוץ מהיר בתחום הנדסת נוגדנים בשל ההצלחה המוחצת של נוגדנים נגד מעכבי מחסום חיסוני3. לצד הפעלה עקיפה של המערכת החיסונית, נוגדנים נועדו ישירות לסמן תאים סרטניים כדי לעסוק במדויק בתאי השפעה חיסונית, לעורר cytotoxicity באמצעות אגוניסט קולטן מוות, לחסום איתות הישרדות תאים סרטניים, לחסום אנגיוגנזה (צמיחה של כלי דם), להגביל את הרגולטורים מחסום חיסוני, לספק radioisotopes, תרופות כימותרפיות siRNAכסוכנים בהסכם 2. בנוסף, לימוד שברי משתנה שרשרת יחיד (scFv) של נוגדנים שונים על פני השטח של המטופל נגזר T-תאים ותאי NK (CAR-T ו CAR-NK) הוא אזור גדל במהירות של חקירות קליניות לטיפולים מבוססי תאים4.

הזיקה הגבוהה במיוחד של תרופות מבוססות נוגדנים המספקת תסנות אנטיגן המביעה תאים סרטניים הופכת אותו לסוכן אטרקטיבי. כמו כן, משלוח ממוקד ושמירה על גידול של נוגדן טיפולי (או תרופה כימית) הוא המפתח לאיזון יעילות על רעילות. לכן, מספר גדול של אסטרטגיות מבוססות הנדסת חלבון הכוללות אך אינן מוגבלות bispecific5 ונוגדנים tri-ספציפיים6 מנוצלים כדי לשפר באופן משמעותי את השמירה גידול אופטימיזציה של תוך ורידי (IV) מוזרקטיפולית 5,7. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת פלואורסץ כדי לטפל בהתפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים אנטי סרטניים יעילים פוטנציאליים.

מכיוון שלרקמות בעלי חיים יש פלואורסצנטיות אוטומטית כאשר הן מתרגשות בספקטרום הנראה לעין, הנוגדנים סומנו בתחילה עם צבע אינפרא אדום ליד (לדוגמה, IRDye 800CW). להוכחת חקירות קונספט, עשינו שימוש קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) מיקוד נוגדן בשם farletuzumab ונגזרתו בשם מפעיל ציטוקסיה עוגן Bispecific (BaCa)7 נוגדן כי מטרות שותפות FOLR1 קולטן מוות-5 (DR5)8 נוגדן רקומביננטי אחד. FOLR1 הוא קולטן יעד מוגדר היטב במטגן יתר בתאים סרטניים בשחלות ו-TNBC, גידול xenografts ותגידוליםהחולה 9. במיוחד, ישנם מאמצים מרובים לנצל קלינית FOLR1 באמצעות גישות מבוססות נוגדנים לעסוק בתאי השפעה חיסונית ותרופת נוגדנים להציות (ADC) לסרטן השחלותוהשד 10,11.

בשיטות אלה נייר, שיכפלנו, ביטאנו ומטוהרים קליני אנטי FOLR1 (farletuzumab) יחד עם נוגדנים שליטה אחרים באמצעות מערכת ביטוי CHO. IgG1 isotype ונוגדן קליני נגד אידיוטי mucin-16 בשם abagovomab12 שימשו כפקדים שליליים. בעקבות טיהור חלבון-A, נוגדנים מסומנים סומנו עם IRDye 800CW וננתן לתוך ויריד הזנב של עכברים עירומים או נושאות xenografts גידול בשחלות או FOLR1 אנושי transfected באופן יציב המביע סרטן המעי הגס murine קסנוגרפטים. ההתקמה הנוגדן היה במעקב על ידי הדמיה חיה באמצעות ספקטרום הדמיה vivo במספר נקודות זמן שונות7. שיטה זו אינה דורשת כל שינוי גנטי או הזרקה של הצוללת כדי לאפשר פליטת אור והוא מהיר יותר באופן משמעותי, חסכוני ויעיל. פרוטוקול השיבוט, הביטוי, הטיהור והתיוג הכללי המתואר להלן יכול להיות מיושם על כל נוגדן קליני ולא קליני אם רצפי שרשרת כבדים וקלים זמינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים ובחקרי גידולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) כאן באוניברסיטת וירג'יניה ותואמת את הסטנדרטים הרגולטוריים הרלוונטיים

1. ביטוי וטיהור נוגדנים

  1. תחזוקה של תאי CHO
    1. לגדול תאי CHO ב FreeStyle CHO מדיה בתוספת עם תוסף גלוטמין 1x זמין מסחרית ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד עם 5% CO2 באמצעות מבחנות ארלנומייר delong או זכוכית או חד פעמי.
      הערה: מומלץ מאוד להשתמש בקבוקון מבולבל עם מכסה מאווררת לתסיסה מוגברת כדי לשפר את העברת גז במהלך מצב רועד. תפוקת נוגדנים מופחתת באופן משמעותי הושגה עם מבחנות רגילות (לא מבולבלות) בשל תסיסה מוגבלת של תרבות ההשעיה.
    2. שמור על מספר התא בין 1-5 x 106 תאים/מ"ל עם >95% יכולת קבילות תא. אם מספר התא גדל מעל 5 x 106 תאים/מ"ל, פצל את התאים. אף פעם לא מאפשר לתאי CHO להגיע מתחת 0.2 x 106 תאים / מ"ל.
  2. טרנסאפציה של תאי CHO
    1. לגדול תאי CHO ב 200 מ"ל של מדיה (2 x10 6 תאים / מ"ל) במבחנות דלונג Erlenmeyer מבולבל.
      הערה: תרביות השעיה הגדלות במבחנות מבולבלות תמיד ייצרו תפוקות חלבון גבוהות יותר לעומת כאשר גדלו במבחנות שאינן מבולבלות.
    2. בצינור 15 מ"ל, לקחת 5 מ"ל של מדיה בסגנון חופשי CHO ולהוסיף 50 μg של VH שיבוט DNA ו 75 μg של DNA שיבוט VL. מערבולת לערבב היטב.
    3. דגירה את תערובת ה-DNA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: דגירה ארוכה יותר מפחיתה את תפוקת החלבון.
    4. להוסיף 750 μL של 1 מ"ג /מ"ל פוליאתילן (PEI) מלאי לתמיסת ה-DNA באגרסיביות מערבולת התערובת עבור 30 s. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות נוספות.
      הערה: יש לעשות PEI טרי. מחזור הפשרה הקפאה מרובה של PEI מפחית את התשואה הכוללת באופן משמעותי.
    5. מוסיפים את כל התערובת של DNA וPEI על התאים תוך ניעור ידני של הבקבוקון. מיד לדגר את delong Erlenmeyer מנוון מבולבל עם תאים ב 37 מעלות צלזיוס רועד ב 130 סל"ד.
  3. ביטוי
    הערה: הנוגדן יש פפטיד אות הפרשה מהונדס לקצה N-מסוף שלה, אשר מסייע נוגדנים להיות מופרשים לתקשורת.
    1. לגדל את התאים הנגועים ב 37 ° C, עם רועד ב 130 סל"ד ביום 1.
    2. ביום 2, להוסיף 2 מ"ל של סוכן 100x נגד clumping ו 2 מ"ל של 100x פתרון אנטי בקטריאלי אנטי-מיקוטי. הזז את הבקבוקון לטמפרטורה נמוכה יותר (32-34°C), עם טלטול של 130 סל"ד.
    3. בכל יום חמישי, להוסיף 10 מ"ל של הזנת 1 ים 1 אחרונות, ו 2 מ"ל של 100x תוסף גלוטמין.
    4. להמשיך לספור את התאים בכל יום שלישי באמצעות hemocytometer לאחר הכתמת aliquot של תאים עם כתם כחול trypan. ודא כי הכדאיות של התא להישאר מעל 80%.
    5. ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים. סובב את התרבות ב- 3000 x g, 4 °C למשך 40-60 דקות ולאחר מכן סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנני בקבוקים של 0.22 μM.
  4. טיהור
    הערה: טיהור נוגדנים מתבצע באמצעות טור חלבון-A זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים),באמצעות משאבה פריסלטית.
    1. לערך את העמודה עם שני נפחי עמודה של מאגר איגוד (20 mM נתרן פוספט ב pH 7.4).
    2. העבר את המדיה המסוננת המכילה נוגדן (שהושג בשלב 1.3.5) דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
    3. שטוף את העמודה עם אמצעי אחסון של שתי עמודות של מאגר איגוד.
    4. הטה את הנוגדן לתוך 500 שברים μL באמצעות מאגר 5 mL elution (30 mM נתרן אצטט ב pH 3.4).
    5. לנטרל את ה-pH של הנוגדן החורץ על ידי הוספת 10 μL של מאגר נטרול (3 M נתרן אצטט ב pH 9) לכל שבר.
      הערה: שבר מספר 3-6 מכיל את רוב הנוגדן. מומלץ לשמור את כל השברים במקרה הנוגדן הוא מצומק בשבר מאוחר מהצפוי.
    6. למדוד את הריכוז של נוגדנים מטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר על-ידי בחירת פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. הריכוז הסופי של הנוגדן מתקבל במ"ג/מ"ל על ידי לשקול את המשקל המולקולרי ואת מקדם הספיגה.

2. תיוג פלורסנט

הערה: נוגדנים מסומנים בצבע אינפרא אדום המכיל קבוצת תגובתיות של NHS ester, אשר זוגות חלבונים ויוצרים התקהלות יציבה. תגובה זו רגישה ל-pH ועובדת בצורה הטובה ביותר ב- pH 8.5. פלואורסצנט מבעבע עם תצוגת הצבע קליטה מקסימלית של 774 מילי-מ', ומקסימום פליטה של 789 מילי-מ"ר. pH 8.5 הוא המפתח להתייחדות יעילה.

  1. דיאליזה 0.5 מ"ל של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה (0.1-0.5 מ"ל) ב- 1 L של מאגר התייחדות (מאגר פוספט 50 mM ב- pH 8.5). לאחר 4 שעות להעביר את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ודיאליזה בן לילה.
  2. הגדרת תגובת התייחדות על ידי הוספת 0.03 מ"ג של IRDye 800CW לכל 1 מ"ג של נוגדן בנפח תגובה של 500 μL.
    הערה: IRDye 800CW מומס DMSO בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
  3. לבצע תגובות תיוג במשך 2 שעות ב 20 °C.
    הערה: הגדלת הזמן מעבר ל- 2 שעות אינה משפרת את התיוג.
  4. טהר את ההתייחדות המסויגת על-ידי דיאליזה מקיפה נגד PBS 1x.
  5. להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע ב 780 נה"מ וספיגה של החלבון ב 280 nm. תרומת הצבע לאות ה-280 נה"מ היא 3%.
  6. חשב את יחס הצבע/חלבון באמצעות נוסחה זו:
    Equation 1
    כאשר 0.03 הוא גורם תיקון לספיגת הצבע המשמש ב 280 נהמ' (שווה ל 3.0 % של הספיגה שלה ב 780 נה"מ), εDye ו εחלבון הם מקדם הכחדה טוחנת עבור הצבע ואת החלבון (נוגדן) בהתאמה.
    הערה: εDye הוא 270,000 M-1 ס"מ-1 ו εחלבון הוא 203,000 M-1 ס"מ-1 (עבור IgG טיפוסי) ב 1:1 תערובת של PBS: מתנול. חלבונים אחרים מאשר IgG עשויים להיות מקדם הכחדה טוחנת שונה מאוד. השימוש במקדם הכחדה נכון עבור חלבון של עניין הוא חיוני לקביעה מדויקת של יחס D/P.
  7. חשב את ריכוז החלבון הסופי באמצעות נוסחה זו:
    Equation 2
    הערה: תמיד לאשר את היעילות מחייב אנטיגן של נוגדן מתויג ללא תווית באמצעות ELISA (אנזים מקושר אימונוסורבנט אסיי) או ציטומטריה זרימה לפני להמשיך במחקרים vivo.

3. מחקרי קסנוגרט עכבר

  1. הכנת תאים סרטניים להזרקה
    1. לגדול OVCAR-3 תאים RPMI-1640 בינוני, בתוספת עם 10% של FBS ו 1x פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. יום לפני ההזרקה, תת-תרבות תאים לתוך מנות תרבות 100 מ"מ חדשות עם 10 מ"ל של בינוני / צלחת מלאה. השתמש במספר תא של 0.5-1 x 106 תאים/צלחת.
    3. דגירה תרביות בטמפרטורה של 37 °C, 95% לחות ו 5% CO2 עבור 20-24 שעות.
    4. ביום ההזרקה, להסיר את מדיום הצמיחה ממנות תרבות. לשטוף ביסודיות את שכבת התא עם Ca2+/ Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם של דולבקו (DPBS) כדי להסיר תאים מתים, פסולת תאית וכל העקבות של סרום, אשר עלול להפריע בפגישה טריפסין.
    5. Trypsinize התאים על ידי הוספת 1.0-1.5 מ"ל של פתרון Trypsin-EDTA לכל מנה ולנסות להפיץ את הפתרון על ידי הטיית המנה בכל רחבי ואחריו דגירה ב 37 ° C במשך 5-10 דקות.
      הערה: שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את מצב trypsinization בפועל. תחת טריפסינוזציה גורמת למספר נמוך יותר של ניתוק תאים מפני השטח של צלחת תרבות, מעל טריפסינון גורם מתח תאי. אז, טריפסינוזציה נכונה היא חשובה.
    6. להוסיף 1.0-1.5 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה לכל מנה כדי לעצור את פעולת trypsin, לאחר מכן להשעות מחדש תאים על ידי pipetting בעדינות.
      הערה: pipetting עדין חשוב כדי לשמור על בריאות התא.
    7. לאסוף את מתלה התא לתוך צינור חסונים 15 מ"ל ולסובב ב 250 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    8. לאסוף את גלולת התא לאחר הסרת supernatant ולשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הכדור ב DPBS 1x.
    9. סובב את מתלי התא במהירות נמוכה 250 x g במשך 5 דקות.
    10. להוסיף 500 μL של DPBS ולהשעות מחדש תאים על ידי pipetting עדין כדי לקבל מתלה תא יחיד.
    11. לספור תאים באמצעות מד המיוציטומטר או מונה תא אוטומטי.
      הערה: לקבלת דיוק טוב יותר, חזור על הספירה שלוש פעמים וקח בממוצע.
    12. כוונן את עוצמת הקול באופן כזה כך צפיפות התא הסופי יהיה 1 x 108 תאים / מ"ל.
  2. הזרקת תאים תת עוריים לפיתוח xenografts עכבר
    הערה: כל ההליכים צריכים להיעשות בקבינט בטיחות BSL2. אתימית עירום Foxn1nu/ Foxn1+ עכברים שימשו במחקר הנוכחי.
    1. קח 50 μL של מתלה התא לתוך צינור 1.5 מ"ל ולערבב עם 50 μL של מטריצת קרום מרתף מדיום.
      הערה: מטריצת קרום מרתף בינוני נוטה ליצור ג'ל כמו מצב בטמפרטורת החדר, כך בזהירות לשמור על התאים ואת תערובת בינונית מטריקס על קרח. מומלץ לשמור צינורות, טיפים ומזרקים במקרר ולאחר מכן להעביר על קרח לפני הזרקת בעלי חיים.
    2. להרגיז את התערובת כדי למנוע כל תא clumping. לאחר מכן, קח את זה 100 μL של תא מתלה-מטריקס תערובת בינונית המכילה 5 x10 6 תאים, לתוך מזרק 1cc.
    3. הרם בעדינות את עור החיה כדי להפריד את העור משכבת השריר הבסיסית ולהזריק לאט את מתלי התא (100 μL) מתחת לעור (5 x 106 תאים), עם מחט 26 G. המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך כי מדיום מטריצת מרתף יכול ליצור ג'ל מוצק למחצה כמו מבנה יחד עם תאים מתחת לעור, מניעת התערובת יוצא מאתר הזריקה.
      הערה: תאים צריכים להיבדק לפני הזרקה לכל זיהום אשר עלול להזיק לעכברים immunodeficient. בעוד הזרקה לא לשים את המחט עמוק מדי לתוך העור כמו זה עשוי ליצור את הגידול עמוק יותר מהצפוי.
    4. יש לשמור את החיה בכלוב סטרילי ולהתבונן במשך כ-20 דקות.
    5. צפה בעכברים במשך 2-3 שבועות ולאפשר לגידול לגדול עד 500 מ"מ3 גודל.

4. התאמה מקומית של נוגדנים באמצעות מערכת הדמיה vivo

הערה: בציוד הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים)המשמש בניסוי זה משתמש סט של מסנני יעילות גבוהה ואלגוריתמים ספקטרליים un-ערבוב עבור הדמיה לא פולשנית ומעקב אחר פעילות סלולרית וגנטית בתוך אורגניזם חי בזמן אמת. המערכת מספקת הן יכולת ניטור פלואורססטי והן יכולת ניטור ביולומטרנציה.

  1. להזריק 25 μg של נוגדן מתויג צבע באמצעות וין זנב.
    1. גידול מברים הנושא עכברים באמצעות 2% isoflurane. בדוק אם חוסר תגובה רפלקסים דוושה.
    2. ברגע שעכברים מפסיקים לזוז, תאט את וית הזנב הרוחית על ידי החלת מי תולעים.
    3. להזריק 25 μg (ב 100 μL) של נוגדן מתויג באמצעות מזרק אינסולין 1 cc עם מחט 26 G.
    4. באופן דומה, כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את הנוגדן IgG1 איזוטיפ לא ספציפי אשר אינו מתמקד תאים סרטניים.
  2. לבצע בהדמיה חיה vivo לאחר 8, 24, 48 שעות, וכו 'של זריקות נוגדנים.
    1. בתוכנה המשויכת, לחץ על אתחל את הממוקם בלוח הבקרה ואשר שטמפרטורת השלב היא 37 °C.
    2. הפעל את אספקת החמצן, כל המשאבות על מערכת ההרדמה, אספקת גז isoflurane לתא הרדמה ולהגדיר את שסתום אידוי isoflurane ל 2%.
    3. להעביר את העכברים לתא הרדמה ולחכות עד עכברים הם הרדמה לחלוטין. למרוח את משחת סיכת העיניים כדי למנוע ייבוש של עיניהם.
    4. עבור אל לוח הבקרה, הגדר את הדמיית הפלואורסצינטי באמצעות האפשרות אשף ההדמיה ובחר את העירור ב- 773 צפון-שעה ופליטה ב- 792 צפון-שעה.
      הערה: הגדרות ברירת המחדל של חשיפה אוטומטית מספקות תמונת פלורסנט טובה. עם זאת, ניתן לשנות את העדפות החשיפה האוטומטית לפי הצרכים.
    5. להעביר את העכברים המהדמה לתוך תא ההדמיה ולהרכיב אותו על שדה ההדמיה באמצעות קונוס האף. שלב ההדמיה מספק את האפשרות להכיל 5 עכברים בכל פעם.
      הערה: יש עכברי שליטה בתמונה יחד עם עכברי הבדיקה יש כמות דומה של חשיפה והגדרות אחרות בעת הניתוח.
    6. לאחר שהכל מוכן, בחר באפשרות רכישה בלוח הבקרה לרכישת התמונה.
    7. באמצעות הגדרות חשיפת אוטומטי המערכת יוצרת את התמונה בתוך דקה. התמונה שנוצרה היא כיסוי של פלואורסצינציה על תמונה מצולמת עם עוצמת פלואורסצית אופטית המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים, או במונחים של יעילות.
    8. לאחר רכישת התמונה, להעביר את העכברים מתא ההדמיה בחזרה לכלוב שלהם ולצפות להחלמתם במשך 1-2 דקות.
  3. כוונן את התמונה עוד יותר עם הכלים והפונקציות המסופקים בתוך התוכנה לניתוח תמונה. כלי ניתוח תמונה נמצאים בשורת התפריטים ובפלוח הכלים.
    1. תחת כוונון תמונה, כוונן את הבהירות, הניגודיות או האטימות ובחר את קנה המידה של הצבע.
    2. השתמש בכלי ROI כדי לציין אזור עניין (ROI) בתמונה אופטית ותמדד את עוצמת האות בתוך ההחזר על ההשקעה. במידת הצורך, יצא את נתוני האות המיומתים לתוכנה של גיליון אלקטרוני והתווה את הנתונים.
    3. לצורך מחקרי מעקב, לנתח עכברים necropsies של רקמות שונות (למשל, כבד, ריאות, לב, כליות, טחול, המוח וכו ') עבור התפלגות מפורטת לא ספציפית של נוגדן פלואורסצנטי.
      הערה: נתונים יכולים להיות נתמכים עוד יותר עם ELISA ספציפית רקמה על ידי עשיית שימוש אנטיגן (FOLR1 במקרה זה) ב 96 גם אומר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המתודולוגיה המתוארת, תחילה שיכפלנו נוגדנים המתמקדים קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) בשם farletuzumab, ונוגדן ביסקי בשם BaCa המורכב farletuzumab ו lexatumumab יחד עם נוגדנים שליטה כגון abagovomab (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). פרטים של תחומים כבדים (VH) משתנים ומשתנים של אור משתנה (pVH, pVL) מוצגים באות 1A. כדי לאשר את השיבוטים החיוביים, ביצענו מושבה PCR באמצעות אות פפטיד קדימה (SP For) ו CK Rev / CH3 Rev פריימרים (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). התוצאות המייצגות של מושבה PCR מאשרות את הגדלים הצפויים של שרשראות קלות וכבדות(איור 1C). שיבוטים נוגדנים חיוביים היו, גם, אושרו באמצעות רצף סנגר. בעקבות שיבוט ה-DNA של PVH ו-pVL שאושרו, בוצעו תרביות השעיית CHO, ולאחרמכן טיהורים של זיקה לעמודת חלבון-A של נוגדנים ב-4°C (ראה איור 1B ופרוטוקול לצעדי פירוט).

תוצאות מייצגות של farletuzumab מטוהר יחד עם שליטה אחרת IgG1 (למעט נוגדן BaCa לרוץ על אי-צמצום והפחתת דף SDS מוצגים באיור 2A. כפי שניכר, שרשרת כבדה וקלה הפיקה 50 ו-25 להקות KDa לאחר הפחתה. זאת לאחר אישור מחייב של נוגדנים לחלבונים מקומיים על פני התא. נציג farletuzumab מחייב FOLR1 אנושי על פני השטח של תאי OVCAR3 מוצג באמצעות ציתום זרימה (איור 2B).

הנוגדנים הבאים שכותרתם פלורסנט היו וורין זנב מוזרק לבעלי חיים מושתלים פולר1 המביע גידולים(איור 3). בעלי חיים תדמיינו בשידור חי בנקודות זמן מרובות באמצעות IVIS. הנתונים מאשרים העשרה סלקטיבית של נוגדני FOLR1 ו BaCa לתוך FOLR1+ גידולים (איור 4 ואיור 5). חשוב לשלוט נוגדנים (שלילי לאנטיגן הגידול) לא מקומי לתוך גידולים.

Figure 1
איור 1: סכמטי של שיבוט נוגדנים, ביטוי וטיהור.
(A) מציג את סכמטי הפירוט של וקטורי שרשרת כבדים (pVH) ואור (pVL). (ב)pVH וקטור נושא רצף תחום משתנה של שרשרת כבדה IgG1 ו- pVL וקטור נושא רצף תחום משתנה של שרשרת אור היו מעורבבים יחד (יחס 1:2) יחד עם ריאגנטים טרנספקציה (כגון mirus או PEI) לפני הוספת תרבות המתלים של תאי CHO או HEK. התאים המוזנים עם מזון משלים למחרת ותרבויות היו במעקב במשך 10 ימים נוספים עם האכלה לסירוגין. ביום 11, תאים נקטפו באמצעות 0.2 μm PES מסננים ואחריו כרומטוגרפיה זיקה באמצעות חלבון-A. נוגדנים מטוהרים נותחו לאחר מכן עבור % מונומר (FPLC), פעילות מחייבת (ELISA או SPR), וכריכה אנטיגן היעד (FACS) על תאים חיים. נוגדנים ניתן גם לבדוק ב- vivo assays (למשל, עיכוב צמיחת תאים, תאי הכדאיות, או עיכוב של איתות זרחן ביניים וכו '). נוגדנים יכולים גם להיות בהתווות עם צבעים אדומים רחוקים למשל, IRDye 800CW עבור הדמיית vivo. ± IRDye 800CW חייב להיבדק עבור פעילויות לפני מחקרים התפלגות גידול ורקמות. (ג)ג'לים Agarose של מושבה PCR המאשר את הגדלים של כבד חיובי (1.4 Kb) ושבוטים שרשרת אור (0.8 Kb). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הפחתת הפחתת ג'ל על בסיס ג'ל כדי לאשר את תקינות הנוגדנים.
(א)ארבעה נוגדנים שונים של IgG1 (סכמטי המוצג למעלה) נוספו ± הפחתת סוכן (כגון BME או DTT) ב- 95°C למשך 10 דקות. נוגדנים הועמסו לאחר מכן על ג'ל SDS-PAGE 10% ואחריו כתמי חלבון והדמיה. תמונת ג'ל משמאל ומימין מציגה בבירור את הנוגדן השלם ושני פוליפפטידים נפרדים (כ-50 KDa ו- ~25 KDa) בהתאמה. נא ראה גם מפות וקטור pVH ו pVL (איור 1) נושא cDNA המתאים VH / VL, CH1/CK, CH2 ו- CH3 תחומים. (ב)ציתום זרימה אישור של ללא תווית ו IRDye 800CW שכותרתו farletuzumab מחייב FOLR1 יליד על תאים סרטניים בשחלות. ללא הפחתת = נוגדן לרוץ על ג'ל עם צבע ללא הפחתת, צמצום = נוגדן לרוץ על ג'ל עם הפחתת צבע, HC = שרשרת כבדה, LC = שרשרת אור, VL = תחום משתנה של שרשרת אור, VH = תחום משתנה של שרשרת כבדה, CK = שרשרת Kappa אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Figure 3
איור 3: סכמטי ניסיוני של ייצור גידולים וטיפולים נוגדנים.
6-8 שבועות עכברים ישנים זנים כגון: Immunodeficient עירום אתימי / NSG / Immunocompetent C57BL/6 או עכברים Balb / C יכול להיות מושתל בקלות עם תאים סרטניים באמצעות גידולים תת עוריים (SQ). מחקרים דומים יכולים להתבצע באמצעות כרית שומן השד ותגידולים תוך-אפריטוניאליים (IP). 3-4 שבועות מאוחר יותר (גידול ~ 200 מ"מ3),עכברים הוזרקו עם IRDye מסומן נוגדנים שצוינו ± סלקטיביים נגד קולטן overexpressed גידול. זה היה אחרי לחיות בהדמיית vivo. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה חיה של גידול OVCAR3 אנושי הנושא עכברים.
נבחר באופן אקראי 6 עד 8 שבועות (גיל) ו 20-25 גרם (משקל) ללא שיער אתימי עירום Foxn1nu/ Foxn1+ (Envigo)הושתלו עם FOLR1+ גידולים בשחלות (OVCAR-3 תאים). לאחר 3 שבועות עם גידולים ברורים, עכברים היו וידיד זנב מוזרק IRDye 800CW שכותרתו IgG1 שליטה, abagovomab (CA-125 נוגדן אנטי אידיוטי), farletuzumab (נוגדן FOLR1) ו BaCa (נוגדן נגד FOLR1-DR5) ואחריו הדמיה חיה בזמנים שצוינו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: לחיות ב-vivo הדמיה של האדם FOLR1 המביע מרין MC38 תא נגזר גידול הנושא עכברים.
(א)נבחר באופן אקראי 6 עד 8 שבועות (גיל) ו 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/ SzJ או עכברים בעירום היו SQ מוזרק עם תאי MC38 מורין בהבעה אנושית FOLR1. עם הופעת הגידול, עכברים היו ווריקט זנב מוזרק IRDye 800CW שכותרתו בקרת IgG1, abagovomab (CA-125 נוגדן אנטי אידיוטי), farletuzumab (נוגדן FOLR1) ו BaCa (נוגדן ANTI FOLR1-DR5) ואחריו הדמיה חיה בזמנים שצוינו. (ב)לאחר 7 ימים בעלי חיים היו המתת חסד ואיברי מפתח מבודדים (כפי שצוין) היו בתמונה יחד עם גידולים מושתלים עבור אות נוגדן יחסי (IRDye 800CW) הפצה. כצפוי, גידולים נשארו שליליים עם אות IRDye 800CW בשליטה IgG1 ו CA-125 נוגדן אנטי אידיוטי, abagovomab הזריק בעלי חיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: רצפים של כל הנוגדנים והמריימרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

משלוח סלקטיבי ותו לא רקמות גידול ספציפי של סוכן טיפולי נגד סרטן הוא המפתח למדיטת יעילות ובטיחות של טיפול ממוקד נתון13. כאן תיארנו גישה מהירה ויעילה לחקור את התפלגות רקמות וגידול מפורט של קליני, farletuzumab ונוגדן BaCa לא קליני. הגישה המתוארת ישימה לכל נוגדן חדש שנוצר וניתן להשתמש בה לצד נוגדן יעיל קלינית (עם התכונות הרצויות) עבור תכונות ההפצה של הגידול/איברים. בהתחשב רוב קולטני היעד נוגדנים (כגון HER2 בסרטן השד) הם ביטויים יתר על המידה בתאים סרטניים (רקמות), ברוב המקרים הביטוי תת אופטימלי שלהם ותפקוד הוא גם קריטי בסוגי תאים אחרים מאשר תאיםסרטניים 14. לדוגמה, חלק משמעותי של EGFR מיקוד נוגדנים קליניים בחולים בסרטן המעי הגס לצבור ולגרום רעילות רקמת העור15, רקמה לא סרטנית אשר צמיחה והבידול דורש EGFR איתות ותפקוד. לכן, אנו מאמינים כי סוגים אלה של חקירות ראשוניות להפצת רקמות בשילובים עם הפטיוקסיה והיסטוכימיה רקמות אומר בחבורה גדולה יותר של בעלי חיים הם המפתח להערכה מקיפה של בטיחות וכדאיות טיפולית של הנוגדן החדש שנוצר. יתר על כן, מחקרים התפלגות רקמות המתוארות יהיה גם ישים מאוד במחקרים xenograft עכברים כשירים חיסונית, אם הנוגדן החדש שנוצר שומר על תגובה צולבת למילוי מקביל אנטיגן / קולטן. במחקרים סינגניים בבעלי חיים, יחד עם התפלגות גידולים מחקרים היסטוכימיה רקמות, ניתוח ציטוקין דם מפורט יכול לשמש כדי לחזק את נתוני היעילות והבטיחות. תכונה אטרקטיבית של הגישה המתוארת היא שהיא מאפשרת כמות כמעט מדויקת של הפצת נוגדנים אם הנתונים נתמכים בנוסף עם ELISA (נגד אנטיגן היעד) מהגידול ורקמות משמעותיות אחרות (כגון כבד, לב, ריאות, טחול, כליה וכו') 7. תכונה חשובה נוספת של שיטה המתוארת על טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטן יחיד (הנקראת SPECT) וטומוגרפיה של פליטת מיקום (PET) היאהעלות-חסכונית 16. הן SPECT והן PET יקרים מאוד והן עושות שימוש במעקבים רדיואקטיביים להדמיה, מה שהופך את כל התהליך מסורבל אם בוחנים קבוצה גדולה של בעליחיים 17. בנוסף SPECT ומתקני הדמיה PET אינם סטנדרטיים מאוד במעבדות vivariums לחקור מודלים בעלי חיים קטנים של מחלות כגון עכברים18.

מגבלה אחת עם שיטה המתוארת כדי להשיג כמות מדויקת כמעט של הפצת גידול נוגדנים היא התלות באיגוד אנטיגן יעד זיקה גבוהה. זה בגלל זיקה גבוהה אנטיגן-נוגדנים אינטראקציות עלול לגרום "טבע סמים בתיווך היעד (TMDD)" על ידי אנדוציטוזיס משופרת וכיבוי לlysosomes19. לכן, התוצאות של הגישה המתוארת ישתנו בהתאם לקולטן היעד הספציפי בסוג גידול מסוים. לכן, אנו ממליצים בחום בדיקות נוגדנים מתויגים / נוגדנים בחבורה גדולה של בעלי חיים עם xenografts גידול שנוצר עם יותר מ קו אחד תא סרטני (ים) בעל משתנה (הטרוגני) ביטוי של קולטן אנטיגן היעד. מומלץ גם לעשות שימוש ביותר מפלורסנט אחד להזות צבע(ים) ועכברים זן(ים) עבור המחקרים המוצעים.

בהתחשב בכך נוגדנים בגודל קטן כגון Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, וכו '(חסר מיחזור הצלה על ידי קולטן Fc יילודים (FcRn) ברור מהר יותר גידולים (עם סרום חצי פעמים להיות דקות עד שעות), יש לנקוט טיפול כדי להשוות נתונים בין סוגי גידולים שונים שיש ביטוי FcRn משתנה מאוד. יתר על כן, מולקולות גדולות יותר (כגון נוגדנים כפולים trispecificity) כי הם מהונדסים עם תחום Fc למיחזור הצלה יש בעיות חדירה רקמה / גידול. בתרחישים אלה, הגישה המתוארת לא תהיה מתאימה להשוות התפלגות רקמות / גידול של נוגדנים השונים באופן משמעותי בגדלים6. במונחים של משמעות עם זאת, הגידול המתואר מחקרים התפלגות רקמות מפורט יחד עם נוגדנים חד ספציפיים מקבילם ישמשו גורם מפתח בעיצוב יעיל כפול trispecificity פלטפורמת נוגדנים. לבסוף, מאז זיקה גבוהה יותר ונוגדנים אופטימיזציה נלהבת בדרך כלל יש הפצה הומוגנית באופן משמעותי בגידולים, בחירת epitope גידול היעד (חסר TMDD), זיקה כללית נוגדנים ופעילות ביולוגית במודל סרטן מסוים תמיד צריך להיחשב לפני סיום של חדירה לגידול, בטיחות ויעילות.

לסיכום, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה לניטור התפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים מוזרקים דרך ויד. הגישה המתוארת הוסיפה פוטנציאל לנתח נוגדנים-siRNA התווים (שם siRNA מסומן), נוגדנים סמים התוויתות (שם התרופה מסומנת) ונוגדנים-חלקיקים (שם שומנים חלקיקים מסומנים עם צבע פלורסנט). כמו כן, שאריות ציסטאין מהונדסות באופן ייחודי בגידול מיקוד scFv (אם פלואורסצנטי תויג עם כימיית melamide) של קולטן אנטיגן כימרית T-תאים (CAR-T) ו CAR-NK תהיה גישה חסכונית לנתח התפלגות גידול / רקמות של טיפולים מבוססי תאים אלה ללא קשר טרנספדציה נגיפית מבוססת GFP / RFP אותות אסטרטגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה אוניברסיטת וירג'יניה סרטן מרכז הליבה הדמיה מתקן, מתקן ניתוח ביומולקולרי, מתקן מיקרוסקופ מתקדם ומתקן הליבה Vivarium לסיוע. J. T-S הוא חוקר קריירה מוקדמת של האקדמיה לסרטן השחלות (OCA-DoD). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI/NIH (R01CA233752) ל J. T-S, ארה"ב. משרד העבודה סרטן השד תוכנית לחקר סרטן השד (BCRP) פריצת דרך ברמה 1 פרס J. T-S (BC17097) ו U.S. משרד העבודה סרטן סרטן התוכנית לחקר (OCRP) פרס מימון (OC180412) כדי J.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

Tags

סרטן מחקר גיליון 159 נוגדן farletuzumab נוגדנים קליניים xenograft העכבר צבע אינפרא אדום הדמיית פלואורסצנטי העשרה גידול
ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly,… More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter