Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof

Published: May 16, 2020 doi: 10.3791/60727
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 3, 1,2
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at studere in vivo lokalisering af antistoffer i mus tumor xenograft modeller.

Abstract

Monoklonale antistoffer er høj affinitet multifunktionelle lægemidler, der arbejder ved variable uafhængige mekanismer til at fjerne kræftceller. I løbet af de sidste par årtier, inden for antistof-drug konjugater, bispecifikke antistoffer, kimære antigen receptorer (CAR) og kræft immunterapi har vist sig som det mest lovende område af grundlæggende og terapeutiske undersøgelser. Med talrige vellykkede menneskelige forsøg rettet mod immun checkpoint receptorer og CAR-T celler i leukæmi og melanom i et gennembrud tempo, det er meget spændende tider for onkologisk terapi stammer fra variationer af antistof engineering. Desværre, et betydeligt stort antal antistof og CAR baseret terapeutiske har også vist sig skuffende i menneskelige forsøg med fast kræft på grund af den begrænsede tilgængelighed af immun effektor celler i tumorsengen. Vigtigere, uspecifik fordeling af terapeutiske antistoffer i andre væv end tumorer også bidrage til manglen på klinisk effekt, associeret toksicitet og klinisk svigt. Som trofast oversættelse af prækliniske undersøgelser i humane kliniske stier er stærkt afhængige af mus tumor xenograft effekt og sikkerhedsundersøgelser, her fremhæver vi en metode til at teste tumor og generelle væv fordeling af terapeutiske antistoffer. Dette opnås ved at mærke protein-A renset antistof med nær infrarød fluorescerende farvestof efterfulgt af levende billeddannelse af tumorbærende mus.

Introduction

FDA godkendte det første monoklonale antistof rettet mod CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de næste tyve år, har der været en hurtig eksplosion inden for antistof teknik på grund af den overvældende succes antistoffer mod immun checkpoint hæmmere3. Ved siden af indirekte aktivering af immunsystemet, antistoffer er rettet mod direkte flag kræftceller til præcist at engagere immun effektor celler, udløse cytotoksicitet via død receptor agonist, blokere tumor celle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vækst af blodkar), begrænse immun checkpoint regulatorer, levere radioisotoper, kemoterapi narkotika og siRNA som en konjugerede agenter2. Desuden er undersøgelse af enkeltkædede variable fragmenter (scFv) af forskellige antistoffer på overfladen af patientbaserede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et hurtigt voksende område af kliniske undersøgelser for cellebaserede behandlinger4.

Den ultra-høje affinitet af antistof-baserede lægemidler, der giver selektivitet til antigen udtrykke tumorceller gør det til et attraktivt middel. Ligeledes, den målrettede levering og tumor fastholdelse af et terapeutisk antistof (eller et kemisk stof) er nøglen til at afbalancere effekten over toksicitet. Derfor, et stort antal protein engineering baserede strategier, der omfatter, men er ikke begrænset til bisspecifikke5 og tri-specifikke antistoffer6 bliver udnyttet til væsentligt at øge ivrighed optimeret tumor tilbageholdelse af intravenøst (IV) injiceret terapeutiske5,7. Her beskriver vi en simpel fluorescens-baseret metode til at løse tumor og væv fordeling af potentielt effektive anti-cancer antistoffer.

Fordi animalsk væv besidder auto-fluorescens, når ophidset i synlige spektrum, antistofferne blev oprindeligt mærket med nær infrarød farvestof (f.eks IRDye 800CW). For proofs of concept undersøgelser, har vi gjort brug af folat receptor alpha-1 (FOLR1) rettet mod antistof kaldet farletuzumab og dens afledte kaldet Bispecific anker Cytotoksicitet aktivator (BaCa)7 antistof, der co-mål FOLR1 og død receptor-5 (DR5)8 i en rekombinant antistof. FOLR1 er en veldefineret overexpressed target receptor i æggestokkene og TNBC kræftceller, tumor xenografts og patient tumorer9. Især er der flere bestræbelser på klinisk at udnytte FOLR1 ved hjælp af antistof-baserede tilgange til at engagere immun effektor celler og antistof stof konjugater (ADC) for kræft i æggestokkene og brystkræft10,11.

I denne metode papir, vi klonede, udtrykt og renset klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrol antistoffer ved hjælp af CHO ekspressionssystem. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistof kaldet abagovomab12 blev anvendt som negative kontroller. Efter protein-A rensning, ingavede antistoffer blev mærket med IRDye 800CW og blev administreret i halen vene af nøgne mus enten forsynet ovarietumor xenografter eller stabilt transficeret humant FOLR1 udtrykke murine tyktarmskræft xenografts. Antistoflokaliseringen blev sporet af live imaging ved hjælp af in vivo-billeddannelsesspektrum på flere forskellige tidspunkter7. Denne metode kræver ikke nogen genetisk modifikation eller injektion af substratet for at muliggøre lysemission og er betydeligt hurtigere, omkostningseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, ekspressions-, rensnings- og mærkningsprotokol, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistof, hvis der findes tunge og lette kædesekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr håndtering og tumor xenografts undersøgelser blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her på University of Virginia og overholder de relevante lovgivningsmæssige standarder

1. Ekspression og rensning af antistoffer

  1. Vedligeholdelse af CHO-celler
    1. Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media suppleret med kommercielt tilgængelige 1x glutamin supplement ved 37 °C omrystning ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjælp aflange Erlenmeyer kolber enten glas eller engangs.
      BEMÆRK: Det anbefales på det kraftigste at bruge en forvirret kolbe med ventileret hætte for øget omrøring og for at forbedre gasoverførslen under omrystningstilstand. Der er opnået betydeligt reduceret antistofudbytte med regelmæssige kolber (ikke-forvirrede) på grund af begrænset omrøring af suspensionskulturen.
    2. Vedligehold celletallet mellem 1-5 x 106 celler/ml med >95 % celleets levedygtighed. Hvis celletallet øges over 5 x 106 celler/ml, skal cellerne opdeles. Gør det muligt for CHO-celler at nå under 0,2 x 106 celler/ml.
  2. Transinfektion af CHO-celler
    1. Grow CHO celler i 200 ml medier (2 x 106 celler/ml) i aflange Erlenmeyer forvirret kolber.
      BEMÆRK: Suspensionskulturer, der dyrkes i røgbænte kolber, har altid givet højere proteinudbytter i forhold til, når de dyrkes i ikke-forvirrede kolber.
    2. I et 15 ml rør skal du tage 5 ml CHO FreeStyle-medier og tilsættes 50 μg VH-klon-DNA og 75 μg VL-klon-DNA. Vortex at blande godt.
    3. Inkuber DNA-blandingen ved stuetemperatur i 5 min.
      BEMÆRK: Længere inkubation reducerer proteinudbyttet.
    4. Der tilsættes 750 μL 1 mg/ml polyethylenimin (PEI) til DNA-opløsningen, og blandingen til 30 s. Inkuber ved stuetemperatur i yderligere 5 min.
      BEMÆRK: PEI skal være frisk. Multifrostoptningscyklus for PEI reducerer det samlede udbytte betydeligt.
    5. Der tilsættes hele blandingen af DNA og PEI på cellerne, mens kolben rystes manuelt. De aflange Erlenmeyer-røgbliner med 37 °C omrystning ved 130 omrystninger pr. minut inkuberes straks.
  3. Udtryk
    BEMÆRK: Antistoffet har sekretorerende signal peptid manipuleret til sin N-terminal ende, som hjælper antistoffer, der skal udskilles i medierne.
    1. Dyrk de transficerede celler ved 37 °C med rystelser ved 130 omdr./min. på dag 1.
    2. På dag 2 tilsættes 2 ml 100x antiklumpningsmiddel og 2 ml 100x antibakteriel anti-mykotisk opløsning. Kolben skiftes til lavere temperatur (32-34 °C) med omrystning ved 130 omdrejninger i minuttet.
    3. På hver femte dag, tilføje 10 ml Tryptone N1 foder, og 2 ml 100x glutamin supplement.
    4. Hold tælle cellerne hver tredje dag ved hjælp af hæmocytometer efter farvning en aliquot af celler med trypan blå plet. Sørg for, at cellens levedygtighed forbliver over 80 %.
    5. På dag 10 eller 11 høstes mediet til antistofrensning. Drej kulturen ved 3000 x g,4 °C i 40-60 min. og filtrer derefter det klare medie ved hjælp af 0,22 μM flaskefiltre.
  4. Rensning
    BEMÆRK: Antistofrensning udføres ved hjælp af kommercielt tilgængelige Protein-A-søjle (se Tabel over Materialer)ved hjælp af en peristaltisk pumpe.
    1. Ligevægt kolonnen med to kolonnevolumen af bindingsbuffer (20 mM natriumphosphat ved pH 7.4).
    2. Det filtrerede medie, der indeholder antistof (opnået i trin 1.3.5), overføres gennem kolonnen med en strømningshastighed på 1 ml/min.
    3. Vask kolonnen med to-kolonne volumen af bindende buffer.
    4. Antistoffet eluteres i 500 μL-fraktioner med 5 ml elueringsbuffer (30 mM natriumacetat ved pH 3.4).
    5. Neutralisere pH-chloraftat af elueret antistof ved at tilsætte 10 μL neutraliseringsbuffer (3 M natriumacetat ved pH 9) pr. fraktion.
      BEMÆRK: Brøk nummer 3-6 indeholder det meste af antistoffet. Det tilrådes at beholde alle brøker, hvis antistoffet er opstemt i en senere brøkdel end forventet.
    6. Mål koncentrationen af renset antistof ved hjælp af et spektrofotometer ved at vælge standardprotokollen for IgG. Den endelige koncentration af antistoffet opnås i mg/ml ved at tage hensyn til molekylvægt og absorptionskoefficient.

2. Fluorescerende mærkning

BEMÆRK: Antistoffer er mærket med det infrarøde farvestof, der indeholder en NHS ester reaktiv gruppe, som parrer til proteiner og danner en stabil konjugat. Denne reaktion er pH-følsom og fungerer bedst til pH 8,5. Lysstofrør, der er mærket med farvestofdisplayet, er en absorptionsgrad på 774 nm og et emissionsbeløb på 789 nm. pH 8.5 er nøglen til effektiv bøjning.

  1. Dialyse 0,5 ml af antistoffet ved hjælp af en dialysekassette (0,1-0,5 ml) i 1 L bøjningsbuffer (50 mM fosfatbuffer ved pH 8.5). Efter 4 timer overføres dialysekassetten til frisk buffer og dialyze natten over.
  2. En bøjningsreaktion skal sættes i stand ved at tilsætte 0,03 mg IRDye 800CW pr. 1 mg antistof i et reaktionsvolumen på 500 μL.
    BEMÆRK: IRDye 800CW opløses i DMSO i en koncentration på 10 mg/ml.
  3. Der udføres mærkningsreaktioner i 2 timer ved 20 °C.
    BEMÆRK: Forøgelse af tiden ud over 2 timer forbedrer ikke mærkningen.
  4. Rengør mærket konjugater ved omfattende dialyse mod 1x PBS.
  5. Mærkningsgraden anslås ved måling af farvestoffets absorbans ved 780 nm og absorbans af proteinet ved 280 nm. Farvestoffet bidrag til 280 nm signal er 3%.
  6. Beregn farvestof/proteinforholdet ved hjælp af denne formel:
    Equation 1
    hvor 0,03 er en korrektionsfaktor for absorbansen af det farvestof, der anvendes ved henholdsvis 280 nm (svarende til 3,0 % af absorbansen ved 780 nm), er εDye og εProtein molarudryddelseskoefficienter for henholdsvis farvestoffet og proteinet (antistof).
    BEMÆRK: εDye er 270.000 M-1 cm-1 og εProtein er 203.000 M-1 cm-1 (for en typisk IgG) i 1:1 blanding af PBS: methanol. Andre proteiner end IgG kan have meget forskellige molære udryddelseskoefficienter. Anvendelse af korrekt udryddelseskoefficient for det protein, der er af interesse, er afgørende for en nøjagtig bestemmelse af D/P-forholdet.
  7. Den endelige proteinkoncentration beregnes ved hjælp af denne formel:
    Equation 2
    BEMÆRK: Bekræft altid antigenbindende effekt af mærket og umærket antistof ved hjælp af ELISA (Enzym linked immunosorbent assay) eller flowcytometri, før du går videre til in vivo-studier.

3. Undersøgelser af musexenograft

  1. Forberedelse af tumorceller til injektion
    1. Grow OVCAR-3 celler i RPMI-1640 Medium, suppleret med 10% af FBS og 1x penicillin-streptomycin.
    2. Dagen før injektionen subkultur celler i nye 100 mm kultur retter med 10 ml komplet medium / skål. Brug cellenummer 0,5-1 x 106 celler/skål.
    3. Inkuber kulturer ved 37 °C temperatur, 95% fugtighed og 5% CO2 i 20-24 timer.
    4. På injektionsdagen skal vækstmediet fjernes fra kulturretter. Skyl cellelaget grundigt med Ca2+/Mg2+ fri Dulbeccos fosfatbufferet saltvand (DPBS) for at fjerne døde celler, cellulære rester og alle spor af serum, som kan forstyrre trypsin-handlingen.
    5. Trypsinize cellerne ved at tilføje 1.0-1.5 ml Trypsin-EDTA opløsning til hver skål og forsøge at sprede opløsningen ved at vippe skålen hele vejen rundt efterfulgt af inkubation ved 37 °C i 5-10 min.
      BEMÆRK: Overhold celler under et omvendt mikroskop for at kontrollere den faktiske trypsiniseringsstatus. Under trypsinisering resulterer i lavere antal celle løsrivelse fra overfladen af kultur parabol, over trypsinization inducerer cellulære stress. Så ordentlig trypsinization er vigtig.
    6. Tilføj 1,0-1,5 ml komplet vækstmedium til hver skål for at stoppe trypsin handling, efter at re-suspendere celler ved pipettering forsigtigt.
      BEMÆRK: Skånsom pipettering er vigtigt for at opretholde cellerets sundhed.
    7. Cellesuspensionen opsamls i et konisk rør på 15 ml, og drej ved 250 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Opsaml cellepellet efter fjernelse af supernatanten og vask cellerne ved at suspendere pellet igen i 1x DPBS.
    9. Drej celleaffjedringen ved lav hastighed 250 x g i 5 min.
    10. Tilsæt 500 μL DPBS og re-suspendere celler ved blid pipettering for at få enkelt celle suspension.
    11. Tæl celler ved hjælp af hæmocytometer eller automatiseret celletæller.
      BEMÆRK: For bedre nøjagtighed gentages optællingen i tre gange og tager et gennemsnit.
    12. Juster lydstyrken på en sådan måde, at den endelige celletæthed bliver 1 x 108 celler/ml.
  2. Subkutan injektion af celler til udvikling af muse xenografts
    BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres i et BSL2 sikkerhedsskab. Athymic Nude Foxn1nu/ Foxn1+ mus er blevet brugt i den aktuelle undersøgelse.
    1. Tag 50 μL af cellesuspensionen i et 1,5 ml rør og blandes med 50 μL kældermembranmatrixmedium.
      BEMÆRK: Kældermembran matrix medium tendens til at danne en gel som tilstand ved stuetemperatur, så omhyggeligt vedligeholde cellerne og matrix medium blanding på is. Det er tilrådeligt at holde rør, tips og sprøjter i køleskabet og derefter overføre på is før dyret injektion.
    2. Omgit blandingen for at undgå celleklumpning. Derefter tages denne 100 μL af celle suspension-matrix medium blanding, der indeholder 5 x 106 celler, i en 1 cc sprøjte.
    3. Løft forsigtigt dyrets hud for at adskille huden fra det underliggende muskellag og injicer langsomt cellesuspensionen (100 μL) under huden (5 x 106 celler) med en 26 G nål. Vent et par sekunder, før du tager nålen ud, så kælderen matrix medium kan danne semi-solid gel lignende struktur sammen med celler under huden, forhindrer blandingen kommer ud fra injektionsstedet.
      BEMÆRK: Celler skal testes før injektion for enhver kontaminering, der kan skade immundefekt mus. Mens injektion ikke sætte nålen for dybt ind i huden, da dette kan danne tumoren dybere end forventet.
    4. Hold dyret i et sterilt bur og observere i ca 20 min.
    5. Overhold musene i 2-3 uger og lad tumoren vokse op til 500 mm3 størrelse.

4. Lokalisering af antistof ved hjælp af et in vivo-billedsystem

BEMÆRK: In vivo imaging udstyr (se Tabel over materialer),der anvendes i dette eksperiment bruger et sæt af højeffektive filtre og spektrale un-blanding algoritmer til noninvasive visualisering og sporing af cellulære og genetiske aktivitet i en levende organisme i realtid. Systemet giver både fluorescens og bioluminescens overvågning kapacitet.

  1. Injicer 25 μg farvestof mærket antistof via hale vene.
    1. Bedøve tumor bærende mus ved hjælp af 2% isofluran. Kontroller for den manglende reaktion på pedal reflekser.
    2. Når mus stoppe med at bevæge sig, spile den laterale hale vene ved at anvende orm vand.
    3. Der injiceres 25 μg (i 100 μL) mærket antistof med 1 cc insulinsprøjt med en 26 G nål.
    4. Tilsvarende, som en negativ kontrol, etiket og injicere den ikke-specifikke IgG1 Isotype antistof, som ikke er rettet mod kræftceller.
  2. Udfør in vivo live imaging efter 8, 24, 48 timer osv.
    1. I den tilhørende software skal du klikke på Initialiser i kontrolpanelet og bekræfte, at scenetemperaturen er 37 °C.
    2. Tænd for iltforsyningen, alle pumper på anæstesi systemet, isofluran gasforsyning til bedøvelseskammer og indstille isoflurane vaporizer ventil til 2%.
    3. Overfør musene til bedøvelseskammeret og vent til musene er helt bedøvet. Påfør øjet smørende salve for at undgå tørring af deres øjne.
    4. Gå til kontrolpanelet, skal du konfigurere fluorescensbilleddannelsen gennem indstillingen Billedbehandling, og vælg excitationen ved 773 nm og emission ved 792 nm.
      BEMÆRK: Standardindstillingerne for automatisk eksponering giver et godt lysstofrør. De automatiske eksponeringsindstillinger kan dog ændres i henhold til behovene.
    5. Overfør de bedøvede mus ind i billedbehandlingskammeret, og saml det på billedfeltet ved hjælp af næsekeve. Billeddannelsesfasen giver mulighed for at rumme 5 mus ad gangen.
      BEMÆRK: Få kontrolmus afbilledet sammen med testmusene for at få en tilsvarende mængde eksponering og andre indstillinger under analyse.
    6. Når alt er klar, skal du vælge Hent mulighed på kontrolpanelet for billedet erhvervelse.
    7. Med indstillinger for automatisk udeksponering genererer systemet billedet inden for et minut. Det genererede billede er overlejring af fluorescens på fotografisk billede med optisk fluorescensintensitet, der vises i enheder af tæller eller fotoner, eller med hensyn til effektivitet.
    8. Efter at have erhvervet billedet, overføre musene fra billedbehandling kammer tilbage til deres bur og observere for deres nyttiggørelse i 1 til 2 min.
  3. Finjuster billedet yderligere med de værktøjer og funktioner, der findes i softwaren til billedanalyse. Billedanalyseværktøjer findes på menulinjen og værktøjspaletten.
    1. Juster lysstyrken,kontrasten eller opaciteten under Billedjustering, og vælg farveskalaen.
    2. Brug roi-værktøjerne til at angive et område af interesse (ROI) i et optisk billede og måle signalintensiteten i investeringsafkastet. Hvis det er nødvendigt, skal du eksportere de kvantificerede signaldata til en regnearkssoftware og afbilde dataene.
    3. Til opfølgende undersøgelser skal du analysere mus, der er obduktioner af forskellige væv (f.eks. lever, lunge, hjerte, nyre, milt, hjerne osv.) side om side for en detaljeret ikke-specifik fordeling af fluorescerende mærket antistof.
      BEMÆRK: Data kan yderligere understøttes med vævsspecifik ELISA ved at gøre brug af antigen (FOLR1 i dette tilfælde) i 96 brøndanalyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den beskrevne metode klonede vi først antistoffer rettet mod folatreceptor alfa-1 (FOLR1) med navnet farletuzumab og et bispecifikt antistof kaldet BaCa bestående af farletuzumab og lexatumumab sammen med kontrolantistoffer som abagovomab (sekvenser i supplerende fil 1). Nærmere oplysninger om repræsentative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domæner i DNA kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For at bekræfte de positive kloner udførte vi koloni-PCR ved hjælp af signal peptid fremad (SP For) og CK Rev/CH3 Rev primere (sekvenser i supplerende fil 1). Repræsentative resultater af koloni-PCR bekræfter de forventede størrelser af lette og tunge kæder (Figur 1C). Positive antistof kloner blev også bekræftet ved hjælp af Sanger sekventering. Efter bekræftet pVH- og pVL DNA-kloning blev transinfektioner udført ved hjælp af CHO-suspensionskulturer efterfulgt af protein-A-kolonneaffinitetsrensninger af antistoffer ved 4 °C (se figur 1B og protokol for detaljetrin).

Repræsentative resultater af renset farletuzumab sammen med anden kontrol IgG1 (undtagen BaCa antistof køre på ikke-reducerende og reducerende SDS PAGE er vist i figur 2A. Som indlysende, tunge og lette kæde produceret 50 og 25 KDa bands efter reduktion. Dette blev efterfulgt af bindende bekræftelse af antistoffer mod indfødte proteiner på celleoverfladen. Repræsentativ farletuzumab binding til humane FOLR1 på OVCAR3 celler overflade er vist ved hjælp af flow cytometri (Figur 2B).

Næste fluorescerende mærkede antistoffer blev hale vene injiceret i dyr podet med FOLR1 udtrykke tumorer (Figur 3). Dyr blev live afbildet på flere tidspunkter ved hjælp af IVIS. Dataene bekræfter selektiv berigelse af FOLR1- og BaCa-antistoffer i FOLR1+ tumorerne (figur 4 og figur 5). Vigtigere kontrol antistoffer (negativ for tumor antigen) ikke lokalisere i tumorer.

Figure 1
Figur 1: Skematisk kloning, udtryk og rensning af antistof.
(A) Viser detaljeskemaet af tunge (pVH) og lette (pVL) kædevektorer. (B) pVH vektor regnskabsmæssige variabel domæne sekvens af en IgG1 tung kæde og pVL vektor regnskabsmæssige variabel domæne sekvens af en lyskæde blev blandet sammen (1:2 forholdet) sammen med transinfektion reagenser (såsom mirus eller PEI), før der tilføjes til suspension kultur CHO eller HEK celler. Celler blev fodret med supplerende foder næste dag og kulturer blev overvåget i 10 ekstra dage med intermitterende fodring. På dag 11 blev cellerne høstet gennem 0,2 μm PES-filtre efterfulgt af affinitetskromatografi ved hjælp af protein-A. Renset antistoffer blev derefter analyseret for % monomer (FPLC), bindende aktivitet (ELISA eller SPR) og binding til målantigenet (FACS) på levende celler. Antistoffer kan også kontrolleres for in vivo-analyser (f.eks. cellevæksthæmning, celle levedygtighedsanalyser eller hæmning af signalering af mellemliggende fosforylering osv.). Antistoffer kan også konjugeres med langt røde farvestoffer f.eks. ± IRDye 800CW skal testes for aktiviteter forud for tumor- og vævsfordelingsundersøgelser. (C) Agarose geler af koloni PCR bekræfter størrelsen af positive tunge (1,4 Kb) og lyskæde (0,8 Kb) kloner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: En gelbaseret reduktionsanalyse for at bekræfte antistofintegriteten.
(A) Fire forskellige IgG1 antistoffer (skematisk vist på toppen) blev tilsat ± reduktionsmiddel (såsom BME eller DTT) ved 95 ° C i 10 min. Antistoffer blev derefter indlæst på en 10% SDS-PAGE gel efterfulgt af protein farvning og billeddannelse. Gel billede i venstre og højre viser tydeligt intakt antistof og to separate polypeptider (~ 50 KDa og ~ 25 KDa) hhv. Se også pVH- og pVL-vektorkort (Figur 1) med cDNA svarende til VH/VL-, CH1/CK-, CH2- og CH3-domæner. (B)Flow cytometri bekræftelse af umærket og IRDye 800CW mærket farletuzumab binding til indfødte FOLR1 på kræft i æggestokkene celler. Ikke-reducerende = Antistof køre på gel med ikke-reducerende farvestof, Reduktion = Antistof køre på gel med reducerende farvestof, HC = Heavy chain, LC = Lyskæde, VL = Variabel domæne af lyskæde, VH = Variabel domæne af tunge kæde, CK = Kappa kæde Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksperimentel skematisk af tumorgeneration og antistofbehandlinger.
6-8 uger gamle mus stammer såsom: Immundefekt athymic nøgen /NSG/ Immunokompetente C57BL/6 eller Balb/C mus kunne let podes med tumorceller via subkutan (SQ) tumorer. Lignende undersøgelser kunne udføres ved hjælp af bryst fedt-pad og intraperitoneal (IP) tumorer. 3-4 uger senere (tumor ~ 200 mm3),mus blev IV injiceret med en IRDye mærket indiceret antistoffer, der var ± selektiv mod tumor-overexpressed receptor. Dette blev efterfulgt af live in vivo imaging. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levende in-vivo billeddannelse af human OVCAR3 tumor bærende mus.
Tilfældigt udvalgte 6 til 8 uger gamle (Alder) og 20-25 gram (Vægt) hårløs athymisk Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo)blev podet med FOLR1+ ovarietumorer (OVCAR-3 celler). Efter 3 uger med tydelige tumorer blev mus injiceret med IRDye 800CW mærket IgG1 kontrol, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antistof), farletuzumab (anti-FOLR1 antistof) og BaCa (anti-FOLR1-DR5 antistof) efterfulgt af levende billeddannelse på angivne tidspunkter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Levende in-vivo billeddannelse af humane FOLR1 udtrykke murine MC38 celle afledt tumor bærende mus.
(A) Tilfældigt udvalgt 6 til 8 uger gamle (Alder) og 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ eller nøgne mus blev SQ injiceret med murine MC38 celler stabilt udtrykker menneskelige FOLR1. Ved tumor udseende, mus var hale vene injiceres med IRDye 800CW mærket IgG1 kontrol, abagovomab (CA-125 anti-idiotypic antistof), farletuzumab (anti-FOLR1 antistof) og BaCa (anti-FOLR1-DR5 antistof) efterfulgt af levende billeddannelse på angivne tidspunkter. (B) Efter 7 dage blev dyrene aflivet og isolerede nøgleorganer (som angivet) afbildet sammen med podede tumorer for relativ antistofsignal (IRDye 800CW) distribution. Som forventet, tumorer forblev negativ med IRDye 800CW signal i IgG1 kontrol og CA-125 anti-idiotypic antistof, abagovomab injicerede dyr. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: Sekvenser af alle antistoffer og primere. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selektiv og tumorvæv specifik levering af anti-cancer terapeutisk middel er nøglen til at måle effekten og sikkerheden af en given målrettet behandling13. Her har vi beskrevet en hurtig og effektiv tilgang til at undersøge den detaljerede væv og tumor fordeling af kliniske, farletuzumab og en ikke-klinisk BaCa antistof. Den beskrevne tilgang gælder for alle nygenererede antistof og kan bruges sammen med et klinisk effektivt antistof (med ønskede kvaliteter) for dets tumor / organ fordeling egenskaber. I betragtning af de fleste antistof mål receptorer (såsom HER2 i brystkræft) er meget overudtrykt i tumorceller (væv), i de fleste tilfælde deres suboptimale udtryk og funktion er også kritisk i andre celletyper end tumorceller14. For eksempel ophobes en betydelig andel af EGFR rettet mod kliniske antistoffer hos tyktarmskræftpatienter og forårsager toksicitet for hudvæv15, et noncanceøst væv, hvis vækst og differentiering kræver EGFR-signalering og funktion. Derfor er vi overbevist om, at den slags indledende vævsdistributionsundersøgelser i kombinationer med hepatotoksicitet og vævs histokemianalyser i en større kohorte af dyr er nøglen til en omfattende vurdering af sikkerheden og den terapeutiske levedygtighed af det nygenererede antistof. Desuden vil beskrevne vævsdistributionsundersøgelser også være yderst anvendelige i immun kompetente mus xenograft undersøgelser, hvis det nygenererede antistof opretholder krydsreaktivitet til murin modstykke antigen / receptor. I syngeneic dyreforsøg, sammen med tumor distribution og væv histokemi undersøgelser, detaljerede blod cytokin analyse kan bruges til at styrke effekten og sikkerhedsdata. Et attraktivt træk ved den beskrevne tilgang er, at det giver mulighed for næsten nøjagtig kvantisering af antistoffordeling, hvis data understøttes yderligere med ELISA (mod målantigen) fra tumoren og andre signifikante vævslysater (såsom lever, hjerte, lunge, milt, nyre osv.)7. Et andet vigtigt træk ved beskrevet metode over enkelt foton emission computertomografi (kaldet SPECT) og position emission tomografi (PET) er omkostningseffektivitet16. Både SPECT og PET er meget dyre og gør brug af radioaktive sporstoffer til billeddannelse, hvilket gør hele processen besværlig, hvis teste en stor kohorte af dyr17. Desuden er SPECT- og PET-billedbehandlingsanlæg ikke særlig standard i laboratorier og vivarier for at studere små dyremodeller af sygdomme som mus18.

En begrænsning med beskrevet metode til at opnå en næsten nøjagtig kvantisering af antistof tumor fordeling er afhængigheden af høj affinitet mål antigen binding. Det skyldes, at høj affinitet antigen-antistof interaktioner kan resultere i "target-medieret stof disposition (TMDD)" ved øget endocytose og shuttling til lysosomer19. Derfor, resultaterne af den beskrevne tilgang vil variere afhængigt af den særlige mål receptor i en bestemt tumor type. Således anbefaler vi på det kraftigste at teste mærket antistof / antistoffer i en stor kohorte af dyr med tumor xenografts genereret med mere end én tumorcellelinje(er) med variabel (heterogen) udtryk for målantigenreceptor. Det anbefales også i høj grad at gøre brug af mere end én fluorescerende konjugatfarve(e) og mus stamme (er) for de foreslåede undersøgelser.

I betragtning af at små størrelse antistoffer såsom Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, etc. (mangler bjærgning genanvendelse af neonatal Fc receptor (FcRn) klare hurtigere fra tumorer (med serum halv gange er minutter til timer), bør man være omhyggelig med at sammenligne data mellem forskellige tumortyper, der har meget varierende FcRn udtryk. Endvidere, større molekyler (såsom dobbelt og trispecificitet antistoffer), der er manipuleret med Fc domæne til bjærgning genanvendelse har væv / tumor penetration spørgsmål. I disse scenarier, den beskrevne tilgang vil ikke være egnet til at sammenligne væv / tumor fordeling af antistoffer, der adskiller sig betydeligt i størrelser6. Med hensyn til betydning dog, de beskrevne tumor og detaljerede væv distributionsundersøgelser sammen med deres modstykke monospecifik antistoffer vil tjene som en nøglefaktor i en effektiv dobbelt og trispecifikitet antistof platform design. Endelig, da højere affinitet og avidity-optimeret antistoffer generelt har en betydeligt homogen fordeling i tumorer, målet tumor epitope udvælgelse (mangler TMDD), samlede antistof affinitet og biologisk aktivitet i en bestemt kræftmodel bør altid overvejes, før der drages konklusioner af tumor penetration, sikkerhed og effektivitet.

Sammenfattende har vi beskrevet en hurtig og enkel metode til overvågning af tumor og væv distribution af intravenøst injicerede antistoffer. Den beskrevne tilgang har tilføjet potentiale til at analysere antistof-siRNA konjugater (hvor siRNA er mærket), antistof-drug konjugater (hvor stoffet er mærket) og antistof-nanopartikler (hvor nanopartikel lipider er mærket med fluorescerende farvestof). Ligeledes, en unikt manipuleret cystein rester i en tumor rettet mod scFv (hvis fluorescently mærket med melamid kemi) af kimære antigen receptor T-celler (CAR-T) og CAR-NK vil være en omkostningseffektiv tilgang til at analysere tumor / væv distribution af disse cellebaserede behandlinger uafhængigt af viral transfection baseret GFP / RFP signaler strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolekylær Analyse Facility, Advanced Mikroskopi Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere investigator af kræft i æggestokkene Academy (OCA-DoD). Dette arbejde blev støttet af NCI / NIH tilskud (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gennembrud niveau-1 tildeling til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering tildeling (OC180412) til J. T-S

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle CHO media Gibco Life Technologies Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X) Gibco Life Technologies Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent Gibco Life Technologies Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe BD BioSciences Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum PerkinElmer Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B Gibco Life Technologies Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) Corning Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640 Corning Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X) Gibco Life Technologies Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit Invitrogen Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column GE Healthcare Cat # 11-0034-93
Infusion Takara BioScience STO344
IRDye 800CW NHS Ester LI-COR Cat # 929-70020
Isoflurane, USP Covetrus Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment Refresh Lacri-Lube Cat #4089
Matrigel Corning Cat # 354234
PEI transfection reagent Thermo Fisher Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes Thermo Scientific Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters Millipore Express Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA Gibco Life Technologies Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3 American Type Culture Collection ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells Stable transformed in our lab ATCC CCL-61
Mouse: 4T1 Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38 Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1 Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ Envigo Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson Laboratory Multiple Orders

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
  3. Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
  4. Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
  5. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
  6. Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
  7. Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
  8. Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
  9. Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
  10. Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
  11. Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
  12. Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
  13. Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
  14. Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
  15. Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).
  16. Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
  17. van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
  18. Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
  19. Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).

Tags

Kræftforskning Problem 159 antistof farletuzumab kliniske antistoffer musexenograft infrarødt farvestof fluorescensbilleddannelse tumorberigelse
Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly,… More

Shivange, G., Mondal, T., Lyerly, E., Gatesman, J., Tushir-Singh, J. Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody. J. Vis. Exp. (159), e60727, doi:10.3791/60727 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter