Summary
Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.
Abstract
Los anticuerpos monoclonales son fármacos multifuncionales de alta afinidad que funcionan mediante mecanismos independientes variables para eliminar las células cancerosas. En las últimas décadas, el campo de los conjugados de anticuerpos y fármacos, anticuerpos biespecíficos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) e inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como el área más prometedora de las investigaciones básicas y terapéuticas. Con numerosos ensayos en humanos exitosos dirigidos a receptores de punto de control inmune y células CAR-T en leucemia y melanoma a un ritmo revolucionario, es muy emocionante para las terapias oncológicas derivadas de variaciones de la ingeniería de anticuerpos. Lamentablemente, un número significativamente grande de anticuerpos y terapias basadas en CAR también han demostrado ser decepcionantes en los ensayos en humanos de cánceres sólidos debido a la limitada disponibilidad de células de efector inmune en el lecho tumoral. Es importante destacar que la distribución inespecífica de anticuerpos terapéuticos en tejidos distintos de los tumores también contribuye a la falta de eficacia clínica, toxicidad asociada e insuficiencia clínica. Como la traducción fiel de estudios preclínicos en senderos clínicos en humanos se basa en gran medida en los estudios de eficacia y seguridad del xenoinjerto tumoral de ratones, aquí destacamos un método para probar el tumor y la distribución general del tejido de los anticuerpos terapéuticos. Esto se logra mediante la etiqueta del anticuerpo purificado de proteína A con un tinte fluorescente infrarrojo cercano seguido de imágenes en vivo de ratones portadores de tumores.
Introduction
Fda aprobó el primer anticuerpo monoclonal dirigido a CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Desde entonces durante los siguientes veinte años, ha habido una rápida explosión en el campo de la ingeniería de anticuerpos debido al éxito abrumador de los anticuerpos contra los inhibidores del punto de control inmune3. Además de la activación indirecta del sistema inmunitario, los anticuerpos están destinados a marcar directamente las células cancerosas para atacar con precisión las células del efector inmune, desencadenar la citotoxicidad a través del agonista del receptor de la muerte, bloquear la señalización de supervivencia de las células tumorales, obstruir la angiogénesis (crecimiento de los vasos sanguíneos), restringir los reguladores del punto de control inmune, entregar radioisótopos, medicamentos de quimioterapia y siRNA como agentes conjugados2. Además, el estudio de los fragmentos variables de cadena única (scFv) de varios anticuerpos en la superficie de células T y células NK derivadas del paciente (CAR-T y CAR-NK) es un área de rápido crecimiento de las investigaciones clínicas para terapias basadas en células4.
La afinidad ultra alta de los fármacos basados en anticuerpos que proporciona selectividad a los antígenos que expresan las células tumorales lo convierten en un agente atractivo. Del mismo modo, la administración dirigida y la retención tumoral de un anticuerpo terapéutico (o un fármaco químico) es la clave para equilibrar la eficacia sobre la toxicidad. Por lo tanto, un gran número de estrategias basadas en la ingeniería de proteínas que incluyen pero no se limitan a biespecíficos5 y anticuerpos tri-específicos6 están siendo explotados para mejorar significativamente la avidez optimizada de la retención tumoral de la terapia inyectada por vía intravenosa (IV)5,7. Aquí, describimos un método simple basado en la fluorescencia para abordar la distribución del tumor y el tejido de anticuerpos contra el cáncer potencialmente eficaces.
Debido a que los tejidos animales poseen autofluorescencia cuando se excitan en el espectro visible, los anticuerpos fueron inicialmente etiquetados con un tinte infrarrojo cercano (por ejemplo, IRDye 800CW). Para las pruebas de investigaciones conceptuales, hemos hecho uso del receptor de folato alfa-1 (FOLR1) dirigido a anticuerpos llamados farletuzumab y su derivado llamado activador de citotoxicidad de anclaje biespecí (BaCa)7 anticuerpo que se dirige a FOLR1 y receptor de muerte-5 (DR5)8 en un anticuerpo recombinante. FOLR1 es un receptor diana sobreexpresado bien definido en células cancerosas de ovario y TNBC, xenoinjertos tumorales y tumores de pacientes9. En particular, existen múltiples esfuerzos para explotar clínicamente FOLR1 utilizando enfoques basados en anticuerpos para involucrar células efectos inmunes y conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC) para cánceres de ovario y de mama10,11.
En este documento de métodos, clonamos, expresamos y purificamos anti-FOLR1 clínicos (farletuzumab) junto con otros anticuerpos de control utilizando el sistema de expresión CHO. El isotipo IgG1 y un anticuerpo clínico anti-idiotipo mucina-16 llamado abagovomab12 se utilizaron como controles negativos. Tras la purificación de proteínaS A, los anticuerpos indicados se etiquetaron con IRDye 800CW y se administraron en la vena de la cola de ratones desnudos que tenían xenoinjertos tumorales de ovario o se trans infectaron establemente FOLR1 humano que expresan xenoinjertos de cáncer de colon murino. La localización de anticuerpos fue rastreada por imágenes en vivo utilizando espectro de imágenes in vivo en múltiples puntos de tiempo diferentes7. Este método no requiere ninguna modificación genética o inyección del sustrato para permitir la emisión de luz y es significativamente más rápido, rentable y eficiente. El protocolo general de clonación, expresión, purificación y etiquetado descrito a continuación se puede aplicar a cualquier anticuerpo clínico y no clínico si hay secuencias de cadena pesadas y ligeras disponibles.
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Protocol
Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales y estudios de xenoinjertos tumorales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aquí en la Universidad de Virginia y se ajustan a las normas regulatorias pertinentes
1. Expresión y purificación de anticuerpos
- Mantenimiento de células CHO
- Cultivar células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con suplemento de glutamina 1x disponible comercialmente a 37 oC agitando a 130 rpm con 5% CO2 usando matraz Delong Erlenmeyer ya sea de vidrio o desechable.
NOTA: Se recomienda utilizar un matraz desconcertado con tapa ventilada para aumentar la agitación y mejorar la transferencia de gas durante la condición de agitación. Se ha obtenido un rendimiento de anticuerpos significativamente reducido con matraces regulares (no desconcertados) debido a la agitación limitada del cultivo de suspensión. - Mantenga el número de celda entre 1-5 x 106 células/ml con >95% de viabilidad celular. Si el número de celda aumenta más de 5 x 106 celdas/ml, divida las celdas. Nunca permite que las células CHO alcancen por debajo de 0,2 x 106 células/ml.
- Cultivar células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con suplemento de glutamina 1x disponible comercialmente a 37 oC agitando a 130 rpm con 5% CO2 usando matraz Delong Erlenmeyer ya sea de vidrio o desechable.
- Transfección de células CHO
- Cultivar células CHO en 200 ml de medios (2 x 106 células/ml) en matraces deslong Erlenmeyer desconcertados.
NOTA: Los cultivos de suspensión cultivados en matraces desconcertados siempre han producido mayores rendimientos proteicos en comparación con cuando se cultivan en matraces no desconcertados. - En un tubo de 15 ml, toma 5 ml de medios CHO FreeStyle y añade 50 g de ADN clon de VH y 75 g de ADN clon de VL. Vórtice para mezclar bien.
- Incubar la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 5 min.
NOTA: Una incubación más larga reduce los rendimientos proteicos. - Añadir 750 l de 1 mg/ml de material de polietilenimina (PEI) a la solución de ADN y vórtice agresivamente la mezcla durante 30 s. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min adicionales.
NOTA: PEI debe hacerse fresco. El ciclo de deshielo de congelación múltiple de PEI reduce significativamente el rendimiento general. - Añadir toda la mezcla de ADN y PEI en las células mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente los matraces deslong Erlenmeyer desconcertados con células a 37oC agitando a 130 rpm.
- Cultivar células CHO en 200 ml de medios (2 x 106 células/ml) en matraces deslong Erlenmeyer desconcertados.
- Expresión
NOTA: El anticuerpo tiene péptido de señal secretora diseñado para su extremo N-terminal, que ayuda a los anticuerpos a ser secretados en los medios.- Cultivar las células trans infectadas a 37 oC, con temblores a 130 rpm en el día 1.
- En el Día 2, agregue 2 ml de 100x agente anti-clumping y 2 ml de solución antibacteriana anti-micótica 100x. Cambie el matraz a una temperatura más baja (32-34 oC), con agitación a 130 rpm.
- En cada quinto día, añadir 10 mL de pienso de triptona N1, y 2 ml de suplemento de glutamina 100x.
- Siga contando las células cada tercer día usando hemocitociómetro después de manchar una alícuota de células con mancha azul tripano. Asegúrese de que la viabilidad celular permanezca por encima del 80%.
- En el Día 10 u 11, cosecha el medio para la purificación de anticuerpos. Gire el cultivo a 3000 x g,4 oC durante 40-60 min y luego filtre los medios transparentes utilizando filtros de botella de 0,22 oM.
- Purificación
NOTA: La purificación de anticuerpos se realiza utilizando una columna Protein-A disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales),utilizando una bomba peristáltica.- Equilibrar la columna con un volumen de dos columnas de tampón de unión (fosfato sódico de 20 mM a pH 7,4).
- Pasar el medio filtrado que contiene anticuerpos (obtenidos en el paso 1.3.5) a través de la columna a un caudal de 1 ml/min.
- Lave la columna con un volumen de dos columnas del búfer de enlace.
- Eluir el anticuerpo en fracciones de 500 ml utilizando un tampón de elución de 5 ml (30 mM de acetato de sodio a pH 3,4).
- Neutralizar el pH del anticuerpo eluido añadiendo 10 ml de tampón de neutralización (3 M de acetato de sodio a pH 9) por fracción.
NOTA: La fracción número 3-6 contiene la mayor parte del anticuerpo. Es aconsejable mantener todas las fracciones en caso de que el anticuerpo se eluda en una fracción posterior de lo esperado. - Mida la concentración de anticuerpos purificados utilizando un espectrofotómetro seleccionando el protocolo predeterminado para IgG. La concentración final del anticuerpo se obtiene en mg/ml teniendo en cuenta el peso molecular y el coeficiente de absorción.
2. Etiquetado fluorescente
NOTA: Los anticuerpos se etiquetan con el tinte infrarrojo que contiene un grupo reactivo de éster DEL NHS, que se acopla a las proteínas y forman un conjugado estable. Esta reacción es sensible al pH y funciona mejor a pH 8,5. Los conjugados fluorescentes etiquetados con el tinte muestran un máximo de absorción de 774 nm, y un máximo de emisión de 789 nm. pH 8.5 es clave para una conjugación efectiva.
- Dialyze 0,5 ml del anticuerpo utilizando un casete de diálisis (0,1-0,5 ml) en 1 L de tampón de conjugación (tampón de fosfato de 50 mM a pH 8,5). Después de 4 horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche.
- Configure una reacción de conjugación añadiendo 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticuerpo en un volumen de reacción de 500 l.
NOTA: IRDye 800CW se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/ml. - Llevar a cabo reacciones de etiquetado durante 2 h a 20oC.
NOTA: Aumentar el tiempo más allá de 2 h no mejora el etiquetado. - Purificar conjugados etiquetados por diálisis extensa contra 1x PBS.
- Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte a 780 nm y absorbancia de la proteína a 280 nm. La contribución del tinte a la señal de 280 nm es del 3%.
- Calcule la relación colorante/proteína utilizando esta fórmula:
donde 0,03 es un factor de corrección para la absorbancia del tinte utilizado a 280 nm (igual al 3,0 % de su absorbancia a 780 nm), εDye y εProtein son coeficientes de extinción molar para el tinte y la proteína (anticuerpo) respectivamente.
NOTA: εDye es 270,000 M-1 cm-1 y εProtein es 203,000 M-1 cm-1 (para un IgG típico) en 1:1 mezcla de PBS: metanol. Las proteínas distintas de IgG pueden tener coeficientes de extinción molar muy diferentes. El uso del coeficiente de extinción correcto para la proteína de interés es esencial para la determinación precisa de la relación D/P. - Calcule la concentración final de proteína utilizando esta fórmula:
NOTA: Confirme siempre la eficacia de unión a antígenos de anticuerpos etiquetados y no etiquetados utilizando ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) o citometría de flujo antes de proceder a estudios in vivo.
3. Estudios de xenoinjertos de ratón
- Preparación de células tumorales inyectables
- Cultivar células OVCAR-3 en RPMI-1640 Medio, complementado con 10% de FBS y 1x penicilina-estreptomicina.
- El día antes de la inyección, las células de la subcultura se convierten en nuevos platos de cultivo de 100 mm con 10 ml de medio/plato completo. Utilice el número de celda de 0.5-1 x 106 células/plato.
- Incubar cultivos a 37oC de temperatura, 95% de humedad y 5% deCO2 durante 20-24 h.
- El día de la inyección, retire el medio de crecimiento de los platos de cultivo. Enjuague bien la capa celular con Ca2+/Mg2+ la solución salina libre de Dulbecco (DPBS) para eliminar las células muertas, los desechos celulares y todos los rastros de suero, que pueden interferir en la acción de la tripsina.
- Pruebe las células añadiendo 1,0-1,5 ml de solución de Trypsin-EDTA a cada plato y trate de extender la solución inclinando el plato por todas partes seguido de incubación a 37 oC durante 5-10 min.
NOTA: Observe las células bajo un microscopio invertido para comprobar el estado real de la tripsinación. Bajo la tripsinación resulta en un menor número de desprendimiento celular de la superficie de la placa de cultivo, sobre la tripinanización induce estrés celular. Por lo tanto, la tripsinación adecuada es importante. - Añadir 1.0-1.5 mL de medio de crecimiento completo a cada plato para detener la acción de la trippsina, después de que re-suspenda las células por pipeteo suavemente.
NOTA: El pipeteo suave es importante para mantener la salud celular. - Recoger la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y girar a 250 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Recoger el pellet celular después de quitar el sobrenadante y lavar las células mediante la re-suspensión del pellet en 1x DPBS.
- Gire la suspensión celular a baja velocidad 250 x g durante 5 min.
- Agregue 500 l de DPBS y vuelva a suspender las células mediante pipeteo suave para obtener una sola celda de suspensión.
- Recuento de células mediante hemocitociómetro o contador automático de células.
NOTA: Para una mejor precisión, repita el conteo tres veces y tome un promedio. - Ajuste el volumen de tal manera que la densidad final de la celda sea de 1 x 108 celdas/ml.
- Inyección subcutánea de células para desarrollar xenoinjertos de ratón
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de seguridad BSL2. Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ ratones se han utilizado en el estudio actual.- Tome 50 l de la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml y mezcle con 50 ml de medio de matriz de membrana del sótano.
NOTA: El medio de matriz de membrana sótano tiende a formar un gel como estado a temperatura ambiente, así que mantenga cuidadosamente las células y la mezcla media de matriz en hielo. Es aconsejable mantener tubos, puntas y jeringas en la nevera y luego transferirlos en hielo antes de la inyección animal. - Agitar la mezcla para evitar cualquier aglutinamiento celular. A continuación, tome este 100 l de la mezcla media de matriz de suspensión celular que contiene 5 x 106 células, en una jeringa de 1 cc.
- Levante suavemente la piel del animal para separar la piel de la capa muscular subyacente e inyecte lentamente la suspensión celular (100 l) debajo de la piel (5 x 106 células), con una aguja de 26 G. Espere unos segundos antes de sacar la aguja, para que el medio de matriz del sótano pueda formar el gel semisólido como estructura junto con las células debajo de la piel, evitando que la mezcla salga del lugar de la inyección.
NOTA: Las células deben ser probadas antes de la inyección para detectar cualquier contaminación que pueda dañar a ratones inmunodeficientes. Durante la inyección no coloque la aguja demasiado profunda en la piel, ya que esto puede formar el tumor más profundo de lo esperado. - Mantener al animal en una jaula estéril y observar durante unos 20 minutos.
- Observe a los ratones durante 2-3 semanas y permita que el tumor crezca hasta 500 mm3 de tamaño.
- Tome 50 l de la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml y mezcle con 50 ml de medio de matriz de membrana del sótano.
4. Localización de anticuerpos mediante un sistema de imágenes in vivo
NOTA: El equipo de imágenes in vivo (ver Tabla de Materiales)utilizado en este experimento utiliza un conjunto de filtros de alta eficiencia y algoritmos espectrales de desmezcla para la visualización no invasiva y el seguimiento de la actividad celular y genética dentro de un organismo vivo en tiempo real. El sistema proporciona capacidad de monitoreo de fluorescencia y bioluminiscencia.
- Inyectar 25 g de anticuerpos etiquetados con tinte a través de la vena de la cola.
- Anestesia a los ratones con tumor usando 2% de isoflurano. Compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal.
- Una vez que los ratones dejen de moverse, dilate la vena lateral de la cola aplicando agua de gusano.
- Inyectar 25 g (en 100 oL) de anticuerpo etiquetado utilizando jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de 26 G.
- Del mismo modo, como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG1 no específico que no se dirige a las células cancerosas.
- Realizar imágenes en vivo in vivo después de 8, 24, 48 h, etc. de inyecciones de anticuerpos.
- En el software asociado, haga clic en Inicializar ubicado en el panel de control y confirme que la temperatura de la etapa es de 37 oC.
- Encienda el suministro de oxígeno, todas las bombas en el sistema de anestesia, el suministro de gas isoflurano a la cámara anestésica y ajuste la válvula vaporizadora de isoflurano al 2%.
- Transfiera los ratones a la cámara anestésica y espere a que los ratones estén completamente anestesiados. Aplique la pomada lubricante para los ojos para evitar el secado de sus ojos.
- Vaya al panel de control,configure la imagen de fluorescencia a través de la opción Asistente de imágenes y seleccione la excitación a 773 nm y la emisión a 792 nm.
NOTA: Los ajustes de exposición automática predeterminados proporcionan una buena imagen fluorescente. Sin embargo, las preferencias de exposición automática se pueden modificar según las necesidades. - Transfiera los ratones anestesiados a la cámara de imágenes y enséñelos en el campo de la imagen usando cono nasal. La etapa de diagnóstico por imágenes ofrece la opción de acomodar 5 ratones a la vez.
NOTA: Haga que los ratones de control sean imageados junto con los ratones de prueba para tener una cantidad similar de exposición y otros ajustes durante el análisis. - Una vez que todo esté listo, seleccione la opción Adquirir en el panel de control para la adquisición de la imagen.
- Con la configuración de Autoexposición, el sistema genera la imagen en un minuto. La imagen generada es la superposición de fluorescencia en la imagen fotográfica con intensidad de fluorescencia óptica mostrada en unidades de recuentos o fotones, o en términos de eficiencia.
- Después de adquirir la imagen, transfiera los ratones de la cámara de imágenes de vuelta a su jaula y observe su recuperación durante 1 a 2 minutos.
- Ajuste la imagen aún más con las herramientas y funciones proporcionadas dentro del software para el análisis de imágenes. Las herramientas de análisis de imágenes se encuentran en la barra de menús y la paleta de herramientas.
- En Ajuste de imagen, ajuste el brillo, el contraste u opacidad y seleccione la escala de color.
- Utilice las Herramientas de ROI para especificar una región de interés (ROI) en una imagen óptica y medir la intensidad de la señal dentro del ROI. Si es necesario, exporte los datos de señal cuantificados a un software de hoja de cálculo y trace los datos.
- Para estudios de seguimiento, analice las necropsias en ratones de diversos tejidos (por ejemplo, hígado, pulmón, corazón, riñón, bazo, cerebro, etc.) lado a lado para una distribución detallada no específica de anticuerpos con etiqueta fluorescente.
NOTA: Los datos se pueden seguir apoyando con elISA específico del tejido haciendo uso del antígeno (FOLR1 en este caso) en 96 ensayos de pozos.
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Representative Results
En la metodología descrita, primero clonamos anticuerpos dirigidos al receptor de folato alfa-1 (FOLR1) llamado farletuzumab, y un anticuerpo biespecífico llamado BaCa que consiste en farletuzumab y lexatumumab junto con anticuerpos de control como abagovomab (secuencias proporcionadas en el Archivo Suplementario 1). Los detalles de los dominios representativos de la variable pesada (VH) y de la luz variable (VL) en los clones de ADN (pVH, pVL) se muestran en la Figura 1A. Para confirmar los clones positivos, llevamos a cabo la cantidad de PCR utilizando péptido de señal hacia adelante (SP Para) y CK Rev/CH3 Rev imprimaciones (secuencias proporcionadas en el archivo suplementario 1). Los resultados representativos de la PCR de la colonia confirman los tamaños esperados de cadenas ligeras y pesadas(Figura 1C). También se confirmaron clones de anticuerpos positivos mediante la secuenciación de Sanger. Tras la clonación confirmada de pVH y ADN pVL, se llevaron a cabo transfcciones utilizando cultivos de suspensión CHO, seguidas de purificaciones de afinidad de columna de proteína A de anticuerpos a 4 oC (ver Figura 1B y protocolo para pasos detallados).
Los resultados representativos de farletuzumab purificado junto con otros igG1 de control (excepto la ejecución de anticuerpos BaCa en la página SDS no reductora y reductora se muestran en la Figura 2A. Como es evidente, la cadena pesada y ligera produjo 50 y 25 bandas KDa después de la reducción. Esto fue seguido por la confirmación de unión de anticuerpos a proteínas nativas en la superficie celular. La unión representativa de farletuzumab al FOLR1 humano en la superficie de las células OVCAR3 se muestra utilizando la citometría de flujo (Figura 2B).
Los siguientes anticuerpos con etiqueta fluorescente fueron inyectados en animales injertados con FOLR1 expresando tumores (Figura 3). Los animales fueron en vivo en varios puntos de tiempo usando IVIS. Los datos confirman el enriquecimiento selectivo de anticuerpos FOLR1 y BaCa en los tumores FOLR1+ (Figura 4 y Figura 5). Es importante destacar que los anticuerpos de control (negativos para el antígeno tumoral) no se localizaron en los tumores.
Figura 1: Esquema de clonación, expresión y purificación de anticuerpos.
(A) Muestra el esquema de detalle de los vectores de cadena pesados (pVH) y ligeros (pVL). (B) el vector pVH que transportaba la secuencia de dominio variable de una cadena pesada IgG1 y un vector pVL que transportaba secuencia de dominio variable de una cadena ligera se mezclaron (relación 1:2) junto con los reactivos de transfección (como mirus o PEI) antes de añadir al cultivo de suspensión de las células CHO o HEK. Las células fueron alimentadas con alimento suplementario al día siguiente y los cultivos fueron monitoreados durante 10 días adicionales con alimentación intermitente. En el día 11, las células se cosecharon a través de filtros PES de 0,2 m seguidos de cromatografía de afinidad utilizando proteína A. A continuación se analizaron anticuerpos purificados para el % de monómero (FPLC), la actividad de unión (ELISA o SPR) y la unión al antígeno diana (FACS) en células vivas. Los anticuerpos también se pueden comprobar en busca de ensayos in vivo (por ejemplo, inhibición del crecimiento celular, ensayos de viabilidad celular o inhibición de la fosforilación intermedia de señalización, etc.). Los anticuerpos también se pueden conjugar con tintes de color rojo lejano, por ejemplo, IRDye 800CW para imágenes in vivo. ± IRDye 800CW debe analizarse para detectar actividades antes de los estudios de distribución de tumores y tejidos. (C) Geles de agarosa de la colonia PCR que confirman los tamaños de clones positivos pesados (1,4 Kb) y de cadena ligera (0,8 Kb). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un ensayo de reducción a base de gel para confirmar la integridad de los anticuerpos.
(A) Se añadieron cuatro anticuerpos IgG1 diferentes (esquemáticos mostrados en la parte superior) ± agente reductor (como BME o TDT) a 95oC durante 10 min. Los anticuerpos se cargaron a continuación en un gel SDS-PAGE del 10%seguido de tinción de proteínas e imágenes. La imagen de gel en izquierda y derecha muestra claramente el anticuerpo intacto y dos polipéptidos separados (50 KDa y 25 KDa) respectivamente. Consulte también los mapas vectoriales pVH y pVL (Figura 1) que transportan cDNA correspondientes a los dominios VH/VL, CH1/CK, CH2 y CH3. (B) Confirmación de citometría de flujo de unión a farletuzumab sin etiqueta e IRDye 800CW con etiqueta a FOLR1 nativo en células cancerosas de ovario. No reductor de anticuerpos con gel con tinte no reductor, Reducción de anticuerpos con gel con tinte reductor, HC - Cadena pesada, LC - Cadena de luz, VL - Dominio variable de la cadena de luz, VH - Dominio variable de cadena pesada, CK - Cadena Kappa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Esquema experimental de generación de tumores y tratamientos de anticuerpos.
6-8 semanas de edad cepas de ratones de edad tales como: Inmunodeficient athymic nude/NSG / Inmunocompetent C57BL/6 o Balb /C ratones podrían ser fácilmente injertados con células tumorales a través de tumores subcutáneos (SQ). Se podrían llevar a cabo estudios similares utilizando tumores de almohadilla de grasa mama y intraperitoneales (IP). 3-4 semanas más tarde (tumor 200 mm3),los ratones fueron inyectados IV con un IRDye etiquetado anticuerpos indicados que fueron ± selectivos contra el receptor sobreexpresado por tumores. Esto fue seguido por imágenes en vivo en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes en vivo en vivo de ratones portadores de tumores OVCAR3 humanos.
Seleccionados al azar de 6 a 8 semanas de edad (Edad) y 20-25 gramos (Peso) sin pelo Nude Foxn1nu/Foxn1+ (Envigo) fueron injertados con FOLR1+ tumores ováricos (células OVCAR-3). Después de 3 semanas con tumores evidentes, los ratones fueron inyectados en vena de cola con IRDye 800CW etiquetado control IgG1, abagovomab (ca-125 anticuerpo anti-idiotípico), farletuzumab (anticuerpo anti-FOLR1) y BaCa (anti-FOLR1-DR5 anticuerpo) seguido de imágenes en vivo en momentos indicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes en vivo en vivo de ratones portadores de tumores derivados de células murinas MC38.
(A) Seleccionado aleatoriamente de 6 a 8 semanas (Edad) y 20-25 g NOD. Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ o ratones desnudos fueron inyectados SQ con células murinas MC38 expresando establemente FOLR1 humano. Tras la aparición del tumor, los ratones fueron inyectados en la vena de la cola con irdye 800CW etiquetado con control IgG1, abagovomab (anticuerpo anti idiotípico CA-125), farletuzumab (anticuerpo anti-FOLR1) y BaCa (anticuerpo anti-FOLR1-DR5) seguidos de imágenes en vivo en momentos indicados. (B) Después de 7 días los animales fueron eutanizados y los órganos clave aislados (como se indica) fueron imágenes junto con tumores injertados para la distribución de la señal de anticuerpos relativa (IRDye 800CW). Como era de esperar, los tumores permanecieron negativos con la señal IRDye 800CW en el control de IgG1 y el anticuerpo anti idiotípico CA-125, los animales inyectados con abagovomab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario 1: Secuencias de todos los anticuerpos e imprimaciones. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La administración selectiva y específica del tejido tumoral del agente terapéutico contra el cáncer es la clave para medir la eficacia y la seguridad de una terapia dirigida determinada13. Aquí hemos descrito un enfoque rápido y eficiente para investigar la distribución detallada del tejido y tumoral de la clínica, farletuzumab y un anticuerpo BaCa no clínico. El enfoque descrito es aplicable a cualquier anticuerpo recién generado y se puede utilizar junto con un anticuerpo clínicamente eficaz (con las cualidades deseadas) por sus propiedades de distribución de tumores/órganos. Teniendo en cuenta que la mayoría de los receptores diana de anticuerpos (como HER2 en el cáncer de mama) están muy sobreexpresados en las células tumorales (tejidos), en la mayoría de los casos su expresión subóptima y su función también es crítica en tipos celulares distintos de las células tumorales14. Por ejemplo, una proporción significativa de EGFR dirigido a anticuerpos clínicos en pacientes con cáncer de colon se acumulan y causan toxicidad en el tejido de la piel15, un tejido no canceroso cuyo crecimiento y diferenciación requiere señalización y función del EGFR. Por lo tanto, creemos firmemente que este tipo de investigaciones preliminares de distribución de tejidos en combinación con ensayos de hepatotoxicidad e histoquímica de tejidos en una cohorte más grande de animales son clave para evaluar exhaustivamente la seguridad y la viabilidad terapéutica del anticuerpo recién generado. Además, los estudios de distribución de tejidos descritos también serían muy aplicables en estudios de xenoinjertos inmunes competentes en ratones, si el anticuerpo recién generado mantiene la reactividad cruzada ante el antígeno/receptor homólogo murino. En estudios singénicos en animales, junto con estudios de distribución tumoral e histoquímica tisular, se puede utilizar un análisis detallado de citoquinas sanguíneas para fortalecer los datos de eficacia y seguridad. Una característica atractiva del enfoque descrito es que permite una cuantificación casi precisa de la distribución de anticuerpos si los datos se apoyan adicionalmente con ELISA (contra el antígeno objetivo) del tumor y otros colores tisulares significativos (como hígado, corazón, pulmón, bazo, riñón, etc.)7. Otra característica importante del método descrito sobre la tomografía computarizada por emisión de fotón único (llamada SPECT) y la tomografía por emisión de posición (PET) es la rentabilidad16. Tanto SPECT como PET son muy caros y utilizan trazadores radiactivos para la toma de imágenes, lo que hace que todo el proceso sea engorroso si se prueba una gran cohorte de animales17. Además, las instalaciones de imágenes SPECT y PET no son muy estándar en laboratorios y vivarios para estudiar pequeños modelos animales de enfermedades como ratones18.
Una limitación con el método descrito para lograr una cuantificación casi precisa de la distribución del tumor de anticuerpos es la dependencia de la unión de antígenos diana de alta afinidad. Esto se debe a que las interacciones antígeno-anticuerpos de alta afinidad pueden dar lugar a una "disposición de fármacos mediada por objetivos (TMDD)" mediante una mayor endocitosis y un cierre a lisosomas19. Por lo tanto, los resultados del enfoque descrito variarán dependiendo del receptor objetivo particular en un tipo de tumor en particular. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente probar anticuerpos/anticuerpos etiquetados en una gran cohorte de animales con xenoinjertos tumorales generados con más de una línea celular tumoral que tenga una expresión variable (heterogénea) del receptor de antígeno diana. También se recomienda encarecidamente hacer uso de más de un colorante(s) conjugado(s) fluorescente(s) y cepa(s) de ratones para los estudios propuestos.
Teniendo en cuenta que los anticuerpos de pequeño tamaño como Fabs, scFvs, BiTes, DARTs, etc. (que carecen de reciclaje de salvamento por el receptor neonatal Fc (FcRn) se borran más rápidamente de los tumores (con la mitad de los tiempos séricos de minutos a horas), se debe tener cuidado de comparar datos entre diferentes tipos de tumores que tienen una expresión FcRn altamente variable. Además, las moléculas más grandes (como los anticuerpos duales y triespecíficos) que están diseñadas con el dominio Fc para el reciclaje de salvamento tienen problemas de penetración de tejidos/tumores. En esos escenarios, el enfoque descrito no será adecuado para comparar la distribución tisular/tumoral de anticuerpos que difieren significativamente en los tamaños6. Sin embargo, en términos de importancia, los estudios de distribución de tejido tumoral y detallados descritos junto con sus anticuerpos monoespecíficos homólogos servirían como un factor clave en un diseño eficaz de plataforma de anticuerpos duales y triespecíficos. Por último, dado que la mayor afinidad y los anticuerpos optimizados para la avidez generalmente tienen una distribución significativamente homogénea en los tumores, siempre se debe considerar la selección de epítopos tumorales objetivo (falta de TMDD), la afinidad general de anticuerpos y la actividad biológica en un modelo de cáncer en particular antes de llegar a la conclusión de la penetración, seguridad y eficacia del tumor.
En resumen, hemos descrito un método rápido y sencillo para monitorear el tumor y la distribución tisular de los anticuerpos inyectados por vía intravenosa. El enfoque descrito ha añadido potencial para analizar conjugados de anticuerpos-siRNA (donde se etiqueta sirna), conjugados de anticuerpos y fármacos (donde se etiqueta el fármaco) y anticuerpos-nanopartículas (donde los lípidos de nanopartículas están etiquetados con tinte fluorescente). Del mismo modo, un residuo de cisteína de ingeniería única en un tumor dirigido a scFv (si se etiqueta fluorescentemente con química de melamida) de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) y CAR-NK será un enfoque rentable para analizar la distribución tumoral/tejido de estas terapias basadas en células independientemente de las estrategias de señales GFP/RFP basadas en la transfección viral.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a la instalación de imágenes principales del Centro Oncológico de la Universidad de Virginia, a la Instalación de Análisis Biomolecular, a la Instalación de Microscopía Avanzada y a la Instalación Core Vivarium para asistencia. J. T-S es un investigador de carrera temprana de la Academia de Cáncer de Ovario (OCA-DoD). Este trabajo fue apoyado por la subvención NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio de nivel 1 de gran avance a J. T-S (BC17097) y U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio de financiación (OC180412) a J. T-S
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
References
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