Summary
המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.
Abstract
הסמיכות תיוג (PL) טכניקות באמצעות הנדסה ascorbate peroxidase (איפקס) או esהמאנוכיה קולי ביוטין ליגאז בירה (המכונה bioid) השתמשו בהצלחה לזיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון (ppis) בתאי מיונקים. עם זאת, דרישות של תחמוצת מימן רעילים (H2O2) ב איפקס מבוסס PL, זמן דגירה ארוך יותר עם ביוטין (16 – 24 שעות), וטמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) ב bioid מבוססי PL מגביל באופן חמור את היישומים שלהם בצמחים. האובייקט המבוסס על TurboID שתואר לאחרונה מטפל במגבלות רבות של BioID ו-איפקס. TurboID מאפשר תיוג הקירבה מהירה של חלבונים רק 10 דקות תחת טמפרטורת החדר (RT) תנאים. למרות שכלי השירות של TurboID הוכח במודלים בעלי חיים, לאחרונה הראו כי מבוססי TurboID PL מבצעת טוב יותר בצמחים לעומת BioID עבור תיוג של חלבונים העומדים בפני חלבון של ריבית. מסופק כאן הוא פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי של שותפים אינטראקציה חלבונים באמצעות מסוף N-terminal מספר/interleukin 1 (טיר) התחום של מבני נוקלאוטיד-מחייב לוקמיה עשיר (NLR) חלבון משפחה כמודל. השיטה מתארת בנייה וקטורית, הסתננות של ביטויים של חלבונים, טיפול ביוטין, חילוץ חלבונים והתפלה, כימות והעשרה של חלבונים ביולוגיים על ידי טיהור אהדה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד חלבונים אחרים של עניין טבק ומינים צמחים אחרים.
Introduction
PPIs הבסיס לתהליכים סלולריים שונים. שיטות מסורתיות לזיהוי PPIs כוללים שמרים-two-היברידית (Y2H) הקרנה immunoprecipitation בשילוב עם ספקטרומטר מסה (IP-MS)1. עם זאת, שניהם סובלים מכמה חסרונות. לדוגמה, הקרנת Y2H מחייבת זמינות של ספריית Y2H של מפעל היעד או של מינים של בעלי חיים. בניית ספריות אלה היא אינטנסיבית ויקרה. יתר על כן, הגישה Y2H מבוצעת הטרוולוגי תא יחיד איקריוטית האורגניזם שמרים, אשר עשוי לא לייצג את הסטטוס הסלולר של תאים איקריוטית גבוה יותר.
לעומת זאת, ה-IP-MS מראה יעילות נמוכה ב לכידת ארעי או חלש PPIs, וזה גם לא מתאים לאותם חלבונים עם שפע נמוך או הידרופוטטי גבוה. חלבונים חשובים רבים המעורבים במסלולים איתות הצמח כגון kinases כמו קולטן (RLKs) או משפחת NLR של קולטנים החיסונית מבוטאים ברמות נמוכות ולעתים קרובות אינטראקציה עם חלבונים אחרים באופן מתמיד. לכן, היא מגבילה מאוד את ההבנה של מנגנונים המשמשים לוויסות החלבונים הללו.
לאחרונה, הסמיכות תיוג (PL) שיטות מבוסס על הנדסה ascorbate peroxidase (פיסגה) ו מוטציה esהמאשכיה coli ביוטין ליגאז בירהR118G (המכונה bioid) פותחו ומנוצל למחקר של ppis2,3,4. העיקרון של PL הוא כי חלבון היעד של עניין הוא התמזגו עם אנזים, אשר מזרז את היווצרות של יציב משך biotinyl-amp (ביו-amp). אלה bio-AMP חינם משתחררים על ידי אנזימים PL לפזר לסביבה של חלבון היעד, המאפשר ביולציה של חלבונים האבובית על אמינים העיקרי בתוך רדיוס מוערך של 10 ננומטר5.
לגישה זו יש יתרונות משמעותיים על הגישות המסורתיות של Y2H ו-IP-MS, כגון היכולת ללכוד PPIs ארעי או חלש. יתר על כן, PL מאפשר תיוג של חלבונים האבותאיים של חלבון היעד בסביבות הסלולר הילידים שלהם. לאנזימי PL שונים יש חסרונות ייחודיים בעת החלתם על מערכות שונות. לדוגמה, למרות שהפיסגה מציעה הרבה יותר קינטיקה בהשוואה ל-BioID, והיא מיושמת בהצלחה במערכות היונקים, הדרישה של תחמוצת מימן רעילה (H2O2) בגישה זו הופכת את הדבר לאינו מתאים למחקרים מסוימים בצמחים.
לעומת זאת, BioID-מבוססי PL מונע שימוש ב-H2O רעיל 2,אבל שיעור התיוג הוא איטי (המחייב 18 – 24 H כדי להשלים biotinylation), ובכך עושה לכידת של ppis ארעי פחות יעיל. יתר על כן, טמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) נדרש עבור PL יעיל על ידי BioID מציג לחץ חיצוני על אורגניזמים מסוימים, כגון צמחים4. לכן, הפריסה המוגבלת של ביואיד מבוססי PL בצמחים (כלומר, הפרוטופזיס אורז, arabidopsis, ו N. benthamiana) דווחו6,7,8,9. האנזים ה-TurboID שתואר לאחרונה מתגבר על הליקויים של איפקס וביואיד מבוססי PL. TurboID הראה פעילות גבוהה המאפשרת הישג של PL בתוך 10 דקות ב-RT10. PL מבוססי TurboID הוחל בהצלחה בתאים מיונקים, זבובים, ותולעים10. לאחרונה, אנחנו וקבוצות מחקר אחרים באופן עצמאי אופטימיזציה המורחבת השימוש turboid מבוסס PL עבור לימוד ppis במערכות צמחים שונות, כולל נ. בנדיאמיאנה וצמחים arabidopsis שורשים עגבניות שעירים11,12,13,14. מנתח השוואתי עולה כי turboid מבצע טוב יותר עבור PL בצמחים לעומת bioid11,14. היא גם הוכיחה את החוסן של מבוססי turboid PL ב רצפה על ידי זיהוי מספר אינטראקציות הרומן עם הקולטן nlr11, חלבון שהשותפים אינטראקציה שלהם בדרך כלל קשה להשיג באמצעות שיטות מסורתיות.
פרוטוקול זה ממחיש את הקוד המבוסס על turboid ב-רצפה על ידי תיאור הזיהוי של חלבונים אינטראקציה של התחום N-terminal טיר של קולטן החיסון nlr ב -N. benthamiana צמחים. ניתן להרחיב את השיטה לכל חלבונים מעניינים ב- N. benthamiana. חשוב מכך, הוא מספק התייחסות חשובה לחקירת PPIs במינים צמחיים אחרים כגון Arabidopsis, עגבניה, ועוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: מבט כולל על השיטה מוצג באיור 1.
1. הכנת חומרים צמחיים
- הגדל N. benthamiana זרעים באדמה רטובה בצפיפות גבוהה ולשמור אותם בחדר האקלים עם אור 16 h (כ 75 μm/מטר2) ו-8 h photoperiod כהה ב 23 – 25 ° c.
- כשבוע לאחר מכן, בזהירות להעביר כל שתיל צעיר כדי 4 ' x 4 ' סירים ולשמור את השתילים באותו חדר.
- לשמור על הצמחים בחדר במשך כ 4 שבועות עד שהם גדלים לשלב עלה של 4 – 8 לצורך הסתננות הגידול15.
2. בניית מfusions TurboID
- השתמש בטכניקת שיבוט מולקולרית סטנדרטי כדי ליצור פיוז'ן של חלבון היעד עם TurboID (PCR TurboID מ-Addgene ה#107177). כאן, השתמשנו בתחום של N-terminal טיר של קולטן החיסון NLR כמו חלבון היעד של עניין ובנוי טיר התמזגו TurboID תחת השליטה של כרובית וירוס פסיפס 35 s יזם (p35S:: טיר-TurboID).
הערה: פיוז ' ן של האנזים TurboID הטרמינוס או הסופית של חלבון היעד יהיה תלוי בחלבון הריבית. בדרך כלל, עבור חלבון cytoplasmic, הן טרמיני צריך להיות מקובל, כל עוד היתוך TurboID לא משפיע על הפונקציה של חלבון היעד. עם זאת, עבור חלבון קרום מקומי, הטופולוגיה חלבון צריך להיות מאופיין מראש לפני קביעת איזו הטרמינוס הוא הטוב ביותר עבור היתוך TurboID. - בנו את הסיטרין של TurboID-התמזגו תחת אותו יזם שישמש לשליטה בניתוח פרוטמית כמותי.
הערה: חשוב לבנות בקרת TurboID לזיהוי האבובית העומד בפני חלבון היעד. בקרת המיזוג של TurboID צריכה להראות רמת ביטוי דומה לזו של חלבון היעד של TurboID-התמזגו. זה יכול להיות מדעית נקבע על ידי התאמת ריכוז Agrobacterium במהלך אגרוחדירה. בנוסף, חשוב כי חלבון הבקרה יש דפוס לוקליזציה subcellular דומה לזה של חלבון היעד של הריבית.
3. אגרוהסתננות
- טרנספורמציה של הפלמידים לאגרובאכטריום
- הוסף 0.5 μg של הפלמידים שנוצרו משלבים 2.1 ו 2.2 כדי 50 μL של Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים מוכשרים, הכין כמתואר בעבר16.
הערה: זנים Agrobacterium אחרים, כגון GV2260, ניתן להשתמש גם. - . מודקון על קרח במשך 30 דקות
- הלם חום באמבט מים ב 42 ° c עבור 60 s.
- הוסף 400 μL של LB בינונית (10 גרם/L טריטונים, 5 g/L לחלץ שמרים, ו 10 g/L הפקודה; pH = 7.0) כדי Agrobacterium ו הדגירה ב 28 ° צ' עבור 90 דקות.
- לוחית את כל התוכן בצינור על LB אגר שיושלם עם אנטיביוטיקה המתאים כדי לבחור את הפלביניים, כמו גם עבור Agrobacterium (עבור GV3101:50 Mg/l gentamicin ו 50 Mg/l גריסופלובין).
- לוחות הדגירה ב 28 ° צ' עבור 36 – 48 h עד מושבות הפרט גלויים.
- הוסף 0.5 μg של הפלמידים שנוצרו משלבים 2.1 ו 2.2 כדי 50 μL של Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 תאים מוכשרים, הכין כמתואר בעבר16.
- לבחור רצף מושבות מספר בודדים על צלחת מחדש LB אגר עם אנטיביוטיקה (ראה שלב 3.1.5) ולצמוח ב 28 ° c לילה.
הערה: יותר אופטימלי לבצע את ה-PCR של המושבה כדי לאשר את נוכחותו של המבנה הבינארי הספציפי באגרואכטריום. בניסיון שלנו, מעל 95% של המושבות מכילים את המבנים הבינאריים הציג. - האיחסן 3 מ ל של LB בינונית פלוס המתאים אנטיביוטיקה (ראה שלב 3.1.4) עם מושבת Agrobacterium מחסה את המבנה של עניין, ו דגירה על ידי טלטול לילה ב 28 ° צ' עד OD600 של התרבות agrobacterium מגיע 2.0.
- צנטריפוגה את התאים ב 3,000 x g ו להשעות אותם כדי OD600 = 1.0 במאגר אגרוחדירה (10 מ"מ mgcl2, 10 מ"מ MES [PH = 5.6], 250 μm acetosyringone).
הערה: למרות שהוא אופטימלי כדי לעבור את האינומנט עבור 2 h ב RT לפני אגרוחדירה, בניסיון שלנו עם GV3101 זן, לא היה הבדל גדול בין הביטוי חלבון היעד עם vs. ללא דגירה. - השתמש ב-mL מזרק ללא שימוש 1 כדי לחדור את האינוציות באפידרמיס (האבציר) של N. benthamiana בוגרת לחלוטין.
הערה: כדי להכין כמות מספקת של חומרי עלה לשלוש משכפל ביולוגי: עלה שלם מסתנן בדרך כלל, שלושה עלים מוחדרו לכל צמח, ושלושה עד ארבעה מפעלים משמשים לכל מבנה. עבור כל עלה, 1.5 – 2.0 מ ל של agrobacteria הושעה מחדש הוא מספיק. - לאחר 36 h לאחר הסתננות (hpi), לחדור 200 μm ביוטין (ב 10 מ"מ mgcl2 פתרון) לתוך העלים חדרו מראש עם מבנים turboid.
- שמרו על המפעל לתוספת של 3 – 12 שעות לפני איסוף רקמת העלה כמתואר בסעיף 4.
הערה: הסיבה לבחירת 36 hpi עבור הסתננות ביוטין היא ביטוי החלבון היעד פסגות בתקופה זו על פי מחקרים קודמים11. מומלץ לקבוע את הזמן הנדרש לביטוי אופטימלי של חלבון היעד של הריבית. זמן הדגירה הפוסט-biotin הסתננות תלוי בעיצוב ניסיוני וחלבון היעד תחת לימוד. בדרך כלל, 3 – 12 h של טיפול ביוטין מאפשר תיוג של רוב החלבונים האבותיים לחלבון היעד על ידי turboid fusions.
4. אוסף דוגמאות עלים
הערה: לעיבוד הבאים של דגימות עלה, ללבוש כפפות סטרילי כדי למנוע זיהום קרטין של דגימות. כל הריאגנטים צריך גם להיות נטול קרטין ככל האפשר.
- חותכים את העלים חדרו בבסיס של הפטוטרת, להסיר את הווריד העלה, ואז להקפיא את רקמת העלה בחנקן נוזלי.
- לטחון את רקמת העלה באמצעות מכתש ומלט ולאחסן את אבקת העלים בתוך 15 מ"ל או 50 mL בצינורות הבז ב-80 ° c לשימוש הבאים.
הערה: קחו שלוש עד ארבע פיסות עלים לכל אחד משלושת המשכפלת הביולוגיים מצמחים שונים. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. לפני השלבים הבאים, מומלץ להעריך את ביטוי החלבון ואת biotinylation של חלבון היעד על ידי ניתוחי כתמי חיסוני. בלוטים מערביים טיפוסיים מוצגים באיור 2.
5. הפקת חלבון מוחלט של עלה
- העברת כ 0.35 גרם של אבקת עלים לצינור 2 מ ל. הכן שתי שפופרות לכל אחת מהדוגמאות.
התראה: לחבוש כפפות בעת נגיעה כל אובייקט מקורר על ידי חנקן נוזלי. - הוסף 700 μL של מאגר הליזה ריפה (50 mM טריס-HCl [pH = 7.5], 500 מ"מ היום, 1 מ"מ EDTA, 1% NP40 [v/v], 0.1% SDS [w/v], 0.5% נתרן ביטול המרה [w/v], 1 מ"מ DTT, 1 מחשב לוח של קוקטייל פרוטאז מעכבי) כדי 0.35 g של אבקת עלים.
- מערבולת הצינורות עבור 10 דקות.
- תשאיר את הדגימות על. הקרח במשך 30 דקות
- מערבבים את התוכן כל 4 – 5 דקות על ידי הפיכת הצינורות הפוכים מספר פעמים.
6. הסרת ביוטין חינם על ידי התפלה
הערה: סעיף זה לוקח כ 50 דקות.
- באמצעות השפה ההתפלה.
- הסר את החותם בתחתית העמודה התפלה והשם את העמודה בשפופרת 50 mL.
- הסר את פתרון האחסון על-ידי צנטריפוגה ב-1000 x g ו-4 ° צ' עבור 2 דקות וודא שהמכסה מתיר.
- שים את העמודה התפלה בצינור 50 mL. משקל העמודה 3x עם 5 מ ל של מאגר הליזה ריפה, בכל פעם תפרידו ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 2 דקות ו מחיקת flowthrough.
- העבר את עמודת ההתפלה לתוך צינור 50 mL חדש ואחסן זמנית ב-4 ° צ' לשימוש הבא.
- לסובב את הצינורות משלב 5.4 בשעה 16,500 x g ו 4 ° צ' עבור 10 דקות ולהעביר את supernatant משתי הצינורות לתוך צינור חדש 2 mL.
- הוסף 1,500 μL של תמצית חלבון לחלק העליון של שרף של עמודת התפלה מעורפלת (משלב 6.1.4). כאשר תמצית חלבון נכנס שרף, להוסיף עוד 100 μL של מאגר הליזה ריפה.
הערה: למרות ש-1,400 μL של מאגר הליזה ריפה שימש להפקת חלבון מן העלים, אמצעי האחסון הכולל לאחר הפקת החלבון והתפלה הוגדלה תמיד במידה מסוימת יחסית לאמצעי האחסון המקורי. לכן, שילוב של דגימות מכל קבוצה כמתואר בשלבים 5.1 ו 5.4 יכול לגרום לפחות 1,500 μL של תמצית חלבון לכל מדגם. - צנטריפוגה ב 1000 x g ו 4 ° צ' עבור 2 דקות ולהשאיר את הדגימות התפלה על הקרח זמנית.
7. קוונפיקציה של תמציות חלבון התפלה באמצעות שיטת ברדפורד
- הכינו 50 μL של כל פתרון BSA מעבר צבע: 0 מ"ג/mL, 0.2 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.8 mg/mL ו-1 מ"ג/mL.
- לדלל את תמצית חלבון התפלה ידי ערבוב 5 μL לדוגמה עם 45 μL של ddH2O.
- הכינו 1x ברדפורד עוצרת ידי דילול ברדפורד 5x העוצר (100 מ ג של Coomassie כחול מבריק G250, 47 mL של מתנול, 100 mL של 85% חומצה זרחתית, 53 mL של ddH2O).
- הוסף 50 μL של כל פתרון BSA מעבר צבע ו 50 μL של תמצית חלבון מדולל ל 2.5 mL של ברדפורד 1x העוצר.
- דגירה ב RT עבור 10 דקות.
- הוסף 200 μL של הפתרון של כל מדגם לאחת היטב של צלחת אליסה (שלוש משכפל טכני לכל מדגם).
- למדוד את OD595 באמצעות קורא מיקרופלייט.
- ציירו את העקומה הסטנדרטית בהתאם לערך של פתרון BSA במעבר הצבע וחשב את הריכוז של דגימות החלבון המהתפלה. בדרך כלל, ריכוז החלבון הכולל שהושג מ 0.7 גרם של העלים נע בין 3 – 6 מ"ג/mL.
- הכינו 6 – 8 מ ג של תמצית חלבון התפלה לטיהור האהדה הבאים.
8. העשרת חלבונים ביולוגיים
- קח 200 μL של חרוזים מגנטיים streptavidn-C1 מעלה לתוך שפופרת 2 מ ל.
- השפה streptavidn-C1-מעלה מעלה מעלה חרוזים מגנטיים עם 1 מ ל של מאגר הליזה ריפה עבור 1 דקות ב RT.
- לאחר כל כביסה, השתמשו במתלה המגנטי כדי להסיר את החרוזים במשך 3 דקות והסירו בעדינות את הפתרון באמצעות ליטוף.
- חזור על שלבים 8.2 ו-8.3.
- העבר את תמצית החלבון התפלה לחרוזים מגנטיים streptavidn-C1 מצובטים.
- מודקת את הצינורית ב-4 ° צ' בשביל 12 מעלות (או לילה) על מסובבי לאהדה-לטהר את החלבונים הביוטיתיים.
- לכוד את החרוזים על מתלה מגנטי עבור 4 דקות ב RT עד החרוזים לאסוף בצד אחד של הצינור, ואז להסיר בעדינות את supernatant על ידי פיפטה.
- הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף I (2% SDS במים) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על שלב 8.3.
- הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף II (50 מ"מ HEPES: pH = 7.5, 500 mM הנאל, 1 מ"מ EDTA, 0.1% deoxycholic חומצה [w/v], 1% טריטון X-100) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על שלב 8.3.
- הוסף 1.7 mL של מאגר לשטוף III (10 מ"מ טריס-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 מ"מ EDTA, 0.1% deoxycholic חומצה [w/v], 1% NP40 [v/v]) לצינור ולשמור אותו על המסובבי ב RT עבור 8 דקות. חזור על השלב 8.3.
- הוסף 1.7 mL של 50 mM טריס-HCl (pH = 7.5) כדי להסיר את אבקת הניקוי, ואז לחזור על שלב 8.3.
- להעביר את החרוזים לצינור חדש 1.5 mL, ולחזור על שלבים 8.11 ו 8.3.
- לשטוף את החרוזים 6x עבור 5 דקות כל אחד עם 50 mM אמוניום ביקרבונט מאגר ב RT.
- הוסף 1 mL של 50 mM אמוניום ביקרבונט מאגר החרוזים מגנטי מערבבים היטב.
- הסר 100 μL של חרוזים לניתוח כתמי החיסוני כדי לאשר את העשרת החלבונים הביוטילביים. באיור 3מוצגת אבן חשופה מערבית טיפוסית.
- הקפא את שאר דגימות החלבון ואחסן ב-80 ° c או שלח אותם מיד עבור ניתוח LC-MS/MS על קרח יבש.
הערה: תוצאות MS טיפוסיות מוצגות בפרסום קודם (Zhang ואח '. 2019; איור 2, נתונים משלימים 1 ונתונים משלימים 2)11. ערכות הנתונים כולה זמינות ב-MassIVE (שנמצאה ב< http://massive.ucsd.edu >) באמצעות המזהה: MSV000083018 ו-MSV000083019.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתוני המייצג, הממחישים את התוצאות הצפויות בהתבסס על הפרוטוקול המתואר, מותאמים מ-Zhang ואח '11. איור 1 מסכם את ההליכים לביצוע מסמך מבוסס turboid ב- N. benthamiana. איור 2 מראה את ביטוי החלבון ואת הביוטלציה בתוך החדר. איור 3 מראה כי החלבונים הביוטיביים בעלי החדר החדרו מועשרים ביעילות לניתוח הספקטרומטר ההמוני העוקב. יש לציין, כי לאחר העשרת החלבונים הביוטילביים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidn-C1, השתמשו בחלבונים שונים עם גדלים מגוונים, וניתוח כתמי האבן המערבי של החלבונים המועשרת הראה להקות מרוח (איור 3). תצפיות דומות נעשו במספר מחקרים שפורסמו לאחרונה6,7,13,14.
איור 1: מבט כולל על שיטת הPL המבוססת על TurboID ב- N. benthamiana. Agrobacterium מחסה את המבנים turboid-פיוז'ן החדרו לתוך N. benthamiana עלים. 36 h לאחר הסתננות, 200 μm ביוטין הוא חדר לאותו עלים ליזום ביוקטילציה של חלבונים אנדוגניים כי הם האבוניים לחלבון מטרה התמזגו turboid. הצמחים חדרו לאחר מכן מודלים ב RT עבור 3 – 12 h, ואחריו קציר עלה ושיוף בחנקן נוזלי. אבקת עלה הוא מעובד במאגר ליקוי הליזה ריפה, ומשתמשים בטור התפלה כדי להסיר את הביוטין החופשי בתמצית החלבון. החלבונים הביוטיביים היו אז מטוהרים באהדה עם חרוזים מstreptavidin ומזוהים על ידי ספקטרומטר מסה. דמות זו מותאמת מתוך איור משלים 3 מ-ג'אנג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כתמי החיסוני ניתוח של תמציות חלבון שהתקבלו בשלב 4.2. (א) ניתוח כתמי מערבי של חלבונים המחולצים מעלי החדר עם נוגדן נגד התגית HA. (ב) ניתוח מכתם מערבי של חלבונים ביולוגיים בעלי הstreptavidin-hrp. נתון זה מותאם מתוך איור משלים 6B של ג'אנג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח כתמי מערבי של חרוזים שהושג בשלב 8.15 כדי לאשר את העשרת החלבונים הביוטילביים. לכל מבנה יש שלושה משכפל בלתי תלוי (1, 2, ו -3). Streptavidin-HRP שימש לניתוח חלבונים biotinylated בדגימות שונות. נתון זה מותאם מאיור משלים 7 מ-ג'אנג ואח '11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר הביוטין של ה-turboid ליגאז נוצר על-ידי האבולוציה המבוססת על תצוגה מבוססת על-ידי שמרים של ה-bioid10. יש לו יתרונות רבים על פני אנזימים PL אחרים. TurboID מאפשר יישום של PL למערכות מודל אחרות, כולל זבובים ותולעים, שטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם היא כ -25 ° c10. למרות הגישה PL כבר בשימוש נרחב במערכות בעלי חיים, היישום שלה בצמחים הוא מוגבל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק הליך צעד-אחר-צעד להקמת המידע המבוסס על TurboID ב- N. benthamiana, צמח מודל שנעשה בו שימוש נרחב במחקרים של הגורם לפתוגן-צמחים. פרוטוקול זה מתאר הכנה לדגימת עלים, הסרת biotin חופשי, כימות החלבונים המחולצים, והעשרת החלבונים הביוטימיים.
למרות ביוטין חינם במערכות תרבות תא בעלי חיים ניתן להסיר במידה רבה על ידי שטיפת תאים עם PBS מאגר4, ביוטין חינם ברקמת עלה לא ניתן לנקות על ידי כביסה פשוטה. מחקר שנערך לאחרונה הצביע על כך שהביוטין החופשי עלולה להשפיע באופן חמור על העשרת החלבונים הביוטילביים11. בפרוטוקול זה, עמודה התפלה מנוצל בהצלחה להסיר ביוטין חופשי בתמציות חלבונים, המאפשר קשירה יעילה של חלבונים biotinylated לחרוזים streptavidin.
כמו-כן, פרוטוקול זה משמש כאסמכתא חשובה לניהול PL במערכות המפעל האחרות. לאחרונה, שלושה דוחות השתמשו turboid מבוסס PL ב arabidopsis12,13,14 ו עגבנייה שעירים שורש12, מלבד N. benthamiana תיאר כאן. בדומה למערכות תרבות תא בעלי חיים, הסרת הביוטין החופשי הושגה על ידי שטיפת הפרוטוקיים לפני חילוץ החלבון6. עם זאת, כמויות נמוכות יותר של מולקולות ביוטין חופשיות שלא שולבו עם החלבון התקיימו בפנים התא, אשר השפיעו על היעילות של העשרת החלבונים הבאים של החלבון הביוטיליס. לכן, תהליך התפלה מומלץ להסרה מלאה של biotin חופשי, ובכך להגדיל את יעילות ההחלמה של חלבונים biotinylated.
שני סוגים של עמודות, PD-10 ו-zeba, שימשו עבור הסרת ביוטין חינם11,12,13,14. זה עשוי להיות עניין של העתיד להשוות את היעילות של שתי העמודות הללו בהסרת ביוטין חינם בתמציות חלבון עלה. יתר על כן, פרוטוקול זה מעסיק שיטת מזרק הקנונית-תיווך מתווכת כדי לבטא את החלבון היעד של העניין ב -N. benthamiana עלים. לאחר מכן, המצע ביוטין מחדרה מחדש לתוך העלים לתיוג חלבונים העומדים בפני חלבון היעד. פעולות דומות השתמשו גם בשני מחקרים שדווחו לאחרונה12,13. כשיטה חלופית, הסתננות ואקום מתווכת של ביוטין הוא ישים עבור N. benthamiana ו arabidopsis14. בנוסף, בצמחים שאינם מתאימים האגרוחדירה, תרביות תאים יכול להיות הופך לביטוי חלבון היעד, ואחריו טיפול ביוטין והסמיכות תיוג היחס12. מחקרים אלה שנעשו לאחרונה יש להצמיד את החוסן של מבוססי TurboID PL במחקר PPIs והניחו את הבסיס עבור יישומים עתידיים של מבוססי TurboID PL במיני צמחים שונים.
בפרוטוקול זה, Agrobacteriumהיטב-מתווך ביטוי ארעי ב N. benthamiana הוא מועסק כדי לזהות ppis של חלבון היעד של הריבית. ביטוי ארעי עלול לגרום לביטוי יתר של חלבונים ההיתוך. לכן, חלופה אופטימלית יותר היא להנדס את הפיוז TurboID תחת השליטה של יזם יליד ולבטא אותו על ידי הסתננות או דור של קווים טרנסגניים יציבים. עם התפתחות של טכנולוגיית עריכת הגנום, אפשר גם להקיש-במקטע TurboID ישירות לתוך הרוח גנומית של גנים של עניין.
גורם חשוב נוסף להיחשב הוא להבטיח כי היתוך TurboID לא לשנות את הפונקציה של חלבון היעד של הריבית. במחקר הקודם, הפונקציה של קולטן NLR מותך כדי TurboID אושרה על ידי בדיקת יכולתה לזרז את ההגנה בתיווך מוות תאים בנוכחות של וירוס פסיפס טבק p50 אפקטור11. TurboID הוא גדול יחסית (כלומר, 35 kDa) מאשר GFP, ואת היתוך שלה לחלבון היעד יכול להשפיע על הפונקציה של חלבון היעד. במקרים כאלה, ניתן להשתמש ב-miniTurboID בתיבה10 קטנה יותר.
חשוב גם לקבוע איזו הסופית של חלבון היעד מתאים לפיוזינג עם TurboID. גישה כללית למבחנים פונקציונליים כאלה היא קביעה אם היתוך TurboID ישלים את קו הצמח מוטציה של הגן היעד. לחילופין, ניתוח האינטראקציה של מיזוג TurboID עם שותף הידוע בעבר של חלבון היעד יכול לשמש. ברוב המקרים, עבור חלבונים cytoplasmic, N-טרמינל או C-מסוף תיוג של TurboID יכול לייצר מערכות נתונים דומים בניתוח המסה העוקבת. עם זאת, עבור חלבונים מותאמים לממברנה, חשוב לקבוע את הטופולוגיה לפני בנייה וקטורית. אחרת, היתוך של TurboID במעלה או במורד של רצף הקידוד של גנים של עניין יפיק תוצאות שונות לחלוטין. לכן, חשוב לקבוע את הצדדים הפונים (למשל, cytoplasmic-או לומן הפונה) של הטרמינוס N או C-הטרמינוס של ממברנה מקומי חלבונים. זה מבטיח כי הצפוי האבויה הצפויים של חלבון היעד ניתן להשיג.
למרות PL יש מספר יתרונות על גישות IP-MS מסורתיות לגילוי PPIs ארעי או חלש, יש לו מגבלות פנימיות משלו. ראשית, הזיהוי של האינטראקציה של המועמדים החלבונים אינו מרמז באופן מיידי על אינטראקציה ישירה או עקיפה עם החלבון פיתיון, אבל זה רק משקף את הקירבה הקרובה2. לכן, בלתי תלוי vivo בחני (כלומר, co-, מולקולרית מולקולרי הקומפלמנטציה [bimolecular], או באופן מתורבת gt-משוך למטה שיטת) ניתן לבצע כדי לוודא נוספת ppis.
שנית, שליליות שווא או תוצאות חיוביות שגויות עלולות לנבוע משיקולי PL עקב סיבות שונות. לדוגמה, שליליות שווא יכול להתרחש כאשר החלבון חסר amines ראשיים נגישים. בנוסף, מחקרים אחרונים של BIN2 הבינשחקנים בצמחים הראו חפיפה חלקית בין נתונים משני ניסויים13, המציין את קיומו של תוצאות שליליות שווא בשל כיסוי MS לקוי. כמה שחקנים מסוימים של חלבון היעד יכול להיות גם ביולוגי חלש על ידי בקרת turboid-התמזגו, והתוצאה היא העשרה מקפלים מתחת לסף החיתוך ובסופו של דבר אובדן של כמה שחקנים אמיתיים מבין13,14. לכן, יש להגדיר משכפל ביולוגי מספיק עם פקדים וערכי חיתוך מתאימים כדי למזער את מספר התשלילים של שווא11,14.
יתר על כן, תקופת טיפול ביוטין ארוך יכול להגדיל את הביולציה של חלבונים לא ספציפיים, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות שווא10. לכן, חשוב למטב ב vivo תיוג זמן windows כדי להפחית את הביוטילציה הלא ספציפי, וגם לא משפיע על ייצור חלבונים biotinylated לניתוח11,12,13,14. בנוסף, הוצאה קשה ותנאי שטיפה מחמירים מומלץ להפחית את התוצאות החיוביות השקקות שנגזרות מכריכה לא ספציפית של חלבונים לחרוזים17. מלבד האזהרות שתוארו לעיל, העיצוב של שליטה שלילית נכונה הוא חיוני כדי להבחין בין שחקנים אמיתיים משחקנים שקריים שווא ולהימנע מחוסר השחקנים האמיתיים11,12,13,14.
TurboID הראה משופר מאוד תיוג קינטיקה לעומת זה של BioID10,11. עם זאת, פעולה זו יכולה גם להוביל לרקע גבוה יותר במהלך ניתוח PL. לכן, יש לכלול פקדים מתאימים כדי להעלים את אותות הרקע. השתמשנו ב-TurboID של הסיטרין בפרוטוקול זה11, ושליטה דומה הייתה מנוצל במחקרים קודמים18. עבור חלבונים היעד המתבטאים לממברנה ארגונית מסוימת, TurboID מיזוג עם פפטיד אות המטרה את הממברנה ארגונית זהה עושה שליטה טובה יותר TurboID החדרת עם אחד כי הוא ביטוי בציטופלסמה14.
יתר על כן, אם מידע על התחום המרכזי או חומצות אמינו בחלבון היעד הקובעים את האינטראקציות עם שותפים אחרים ידועים, החדרת ה-TurboID עם חלבון היעד עם מוטציה בתחום המפתח או חומצות אמינו צריך להיות שליטה הטובה ביותר ולהפחית באופן מקסימאלי את אותות הרקע שנוצרו על ידי חלבון היעד. בנוסף, אנזימי TurboID דורשים טמפרטורות ספציפיות, כמו גם תנאי pH נאותים. עבור רוב האורגלים בתא כגון ER, הגרעין, והמיטומטר, turboid בהצלחה התווית את החלבונים האבובית 10. עם זאת, מספר אורגלים מיוחדים (כלומר, חללים בתאי הצמח, אשר ה-pH שלו נמוך מאוד19) יכול להיות לא מתאים ללמוד ppis באמצעות גישה PL. יתר על כן, שינויים ברמות ה-pH או חמצון הפחתת מצבים של הסביבה subcellular במהלך תגובת הלחץ עשוי להשפיע על יעילות תיוג של TurboID.
לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן לספק את הבסיס לחקירת PPIs באמצעות TurboID ב -N. benthamiana, מערכת צמח המודל אשר נעשה שימוש נרחב בהיבטים רבים של ביולוגיה צמח20. עם מחקרים מבוססי turboid שתוארו לאחרונה במפעלים arabidopsis ושורשי עגבניות שעירות12,13,14, הוא צפוי כי שיטה זו תהפוך להיות ישימה מינים צמחיים אחרים. הוא צפוי כי TurboID מבוסס PL ישחק תפקיד חשוב בלמידה PPIs במחקר ביולוגיה של הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים הלאומית המדע הטרנסגניים תוכנית טכנולוגיה (2019ZX08010-003 ל Y.Z.), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31872637 לY.Z.), ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (2019ZX08010 ל Y.Z.), ו-NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, ו
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
