TurboID-basert nærhetmerking for i Planta-identifisering av proteinproteininteraksjonsnettverk
Summary
Beskrevet her er en nærhet merking metode for identifisering av interaksjonpartnere av TIR-domenet til NLR immunreseptoren i Nicotiana benthamiana bladvev. Også gitt er en detaljert protokoll for identifisering av interaksjoner mellom andre proteiner av interesse ved hjelp av denne teknikken i Nikotiana og andre plantearter.
Abstract
Nærhetmerkingsteknikker (PL) ved hjelp av konstruertascorbat peroksidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kjent som BioID) har blitt brukt til identifisering av proteinproteininteraksjoner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoksid (H2O2) i APEX-basert PL, lengre inkubasjonstid med biotin (16–24 timer) og høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) i BioID-basert PL begrenser sine applikasjoner alvorlig i planter. Den nylig beskrevne TurboID-baserte PL-en tar for seg mange begrensninger av BioID og APEX. TurboID tillater rask nærhetmerking av proteiner på bare 10 minutter under romtemperatur (RT) forhold. Selv om nytten av TurboID har blitt demonstrert i dyremodeller, viste vi nylig at TurboID-baserte PL utfører bedre i planter sammenlignet med BioID for merking av proteiner som er proksimale til et protein av interesse. Forutsatt her er en trinnvis protokoll for identifisering av protein interaksjon partnere ved hjelp av N-terminal Toll / interleukin-1 reseptor (TIR) domene av nucleotide-bindende leucine-rik gjenta (NLR) protein familie som modell. Metoden beskriver vektorkonstruksjon, agroinfiltrasjon av proteinuttrykkskonstruksjoner, biotinbehandling, proteinekstraksjon og desalting, kvantifisering og berikelse av de biotinylated proteinene ved affinitetsrensing. Protokollen som er beskrevet her, kan lett tilpasses for å studere andre proteiner av interesse for Nicotiana og andre plantearter.
Introduction
PPI er grunnlaget for ulike cellulære prosesser. Tradisjonelle metoder for å identifisere PPIer inkluderer gjær-to-hybrid (Y2H) screening og immunoprecipitation kombinert med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider av noen ulemper. For eksempel krever Y2H screening tilgjengeligheten av Y2H-biblioteket til målanlegget eller dyrearter. Byggingen av disse bibliotekene er arbeidskrevende og dyrt. Videre utføres Y2H-tilnærmingen i heterologøs encellede eukaryotisk organismegjær, som kanskje ikke representerer cellulær status for høyere eukaryoetiske celler.
Ip-MS viser derimot lav effektivitet i å fange forbigående eller svake PPI-er, og det er også uegnet for de proteinene med lav overflod eller høy hydrofobiitet. Mange viktige proteiner involvert i anlegget signalisering veier som reseptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familien av immunreseptorer uttrykkes på lave nivåer og ofte samhandle med andre proteiner transiently. Derfor begrenser det i stor grad forståelsen av mekanismer som ligger til grunn for reguleringen av disse proteinene.
Nylig er nærhetsmerking (PL) metoder basert på konstruert askcorbat peroksidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kjent som BioID) utviklet og benyttet for studiet av PPIs2,3,4. Prinsippet om PL er at et målprotein av interesse er smeltet sammen med et enzym, som katalyserer dannelsen av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Disse gratis bio-AMP frigjøres av PL enzymer og diffustil nærheten av målet protein, slik at biotinylation av proksimale proteiner ved de primære aminer innenfor en estimert radius på 10 nm5.
Denne tilnærmingen har betydelige fordeler i forhold til de tradisjonelle Y2H- og IP-MS-tilnærmingene, for eksempel evnen til å fange forbigående eller svake PPI-er. Videre tillater PL merking av proksimale proteiner av målproteinet i sine innfødte cellulære miljøer. Ulike PL enzymer har unike ulemper når du bruker dem på forskjellige systemer. For eksempel, selv om APEX tilbyr høyere tagging kinetikk sammenlignet med BioID og er vellykket brukt i pattedyr systemer, kravet om giftig hydrogenperoksid (H2O2) i denne tilnærmingen gjør det uegnet for PL studier i planter.
BioID-baserte PL unngår derimot bruk av giftig H2O2, men merkingshastigheten er langsom (krever 18–24 timer for å fullføre biotinylation), og dermed gjøre fangsten av forbigående PPIer mindre effektiv. Videre introduserer høyere inkubasjonstemperatur (37 °C) som kreves for effektiv PL av BioID, ekstern stress for enkelte organismer, for eksempel planter4. Derfor er begrenset distribusjon av BioID-basert PL i planter (dvs. risprotoplast, arabidopsis og N. benthamiana) rapportert6,,7,8,9. Det nylig beskrevne TurboID-enzymet overvinner manglene til APEX og BioID-baserte PL. TurboID viste høy aktivitet som muliggjør oppnåelse av PL innen 10 minutter ved RT10. TurboID-basert PL har blitt brukt i pattedyrceller, fluer og ormer10. Nylig optimaliserte og utvidet vi og andre forskningsgrupper uavhengig av TurboID-baserte PL for å studere PPI-er i forskjellige plantesystemer, inkludert N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat hårete røtter11,12,13,14. Komparative analyser indikerte at TurboID yter bedre for PL i anlegg sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheten til TurboID-baserte PL i planta ved å identifisere en rekke nye interaksjoner med en NLR immunreseptor11, et protein hvis interaksjonspartnere vanligvis er vanskelige å få ved hjelp av tradisjonelle metoder.
Denne protokollen illustrerer Den TurboID-baserte PL i planta ved å beskrive identifisering av interaksjonsproteiner i N-terminal TIR-domenet til NLR-immunreseptoren i N. benthamiana-planter. Metoden kan utvides til alle proteiner av interesse i N. benthamiana. Enda viktigere, det gir en viktig referanse for å undersøke PPIer i andre plantearter som Arabidopsis,tomat og andre.
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboID biotin ligase genereres av gjær skjermbasert rettet utvikling av BioID10. Den har mange fordeler fremfor andre PL-enzymer. TurboID tillater bruk av PL til andre modellsystemer, inkludert fluer og ormer, hvis optimale veksttemperatur er rundt 25 °C10. Selv om PL-tilnærmingen har blitt mye brukt i dyresystemer, er bruken i planter begrenset. Protokollen som er beskrevet her gir en trinnvis prosedyre for å etablere Den TurboID-baserte PL i N. benthamiana, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
