TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks
Summary
Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.
Abstract
Näherungskennzeichnungstechniken (PL) mit hilfe von Ascorbatperoxidase (APEX) oder Escherichia coli biotin ligase BirA (bekannt als BioID) wurden erfolgreich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) in Säugetierzellen eingesetzt. Der Bedarf an toxischem Wasserstoffperoxid (H2O2) in APEX-basierter PL, längere Inkubationszeit mit Biotin (16–24 h) und eine höhere Inkubationstemperatur (37 °C) in BioID-basierter PL schränken ihre Anwendungen in Pflanzen jedoch stark ein. Das kürzlich beschriebene TurboID-basierte PL behebt viele Einschränkungen von BioID und APEX. TurboID ermöglicht eine schnelle Näherungskennzeichnung von Proteinen in nur 10 min unter Raumtemperatur (RT). Obwohl der Nutzen von TurboID in Tiermodellen nachgewiesen wurde, haben wir kürzlich gezeigt, dass TurboID-basiertes PL in Pflanzen besser abschneidet als BioID bei der Kennzeichnung von Proteinen, die proximal für ein Protein von Interesse sind. Hier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Protein-Interaktionspartnern unter Verwendung der N-terminalen Toll/Interleukin-1-Rezeptor-Domäne (TIR) der Nukleotid-bindenden Leucin-rich repeat (NLR)-Proteinfamilie als Modell vorgesehen. Die Methode beschreibt die Vektorkonstruktion, die Agroinfiltration von Proteinexpressionskonstrukten, Biotinbehandlung, Proteinextraktion und -entsalzung, Quantifizierung und Anreicherung der biotinylierten Proteine durch Affinitätsreinigung. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in Nicotiana und anderen Pflanzenarten zu untersuchen.
Introduction
PPI sind die Grundlage verschiedener zellulärer Prozesse. Zu den traditionellen Methoden zur Identifizierung von PPI gehören Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) und Immunpräzipitation in Verbindung mit Massenspektrometrie (IP-MS)1. Beide haben jedoch einige Nachteile. Beispielsweise erfordert das Y2H-Screening die Verfügbarkeit einer Y2H-Bibliothek der Zielpflanze oder Tierart. Der Bau dieser Bibliotheken ist arbeitsintensiv und teuer. Darüber hinaus wird der Y2H-Ansatz in der heterologen einzelligen eukaryotischen Organismushefe durchgeführt, die möglicherweise nicht den zellulären Status höherer eukaryotischer Zellen darstellt.
Im Gegensatz dazu zeigt IP-MS eine geringe Effizienz bei der Erfassung vorübergehender oder schwacher PPI, und es ist auch ungeeignet für Proteine mit geringer Häufigkeit oder hoher Hydrophobie. Viele wichtige Proteine, die an den Signalwegen der Pflanze beteiligt sind, wie z. B. Rezeptor-ähnliche Kiinasen (RLKs) oder die NLR-Familie von Immunrezeptoren, werden auf niedrigem Niveau exprimiert und interagieren oft vorübergehend mit anderen Proteinen. Daher schränkt es das Verständnis der Mechanismen, die der Regulierung dieser Proteine zugrunde liegen, stark ein.
Kürzlich wurden näher markierte (PL) Methoden auf Basis von Ascorbatperoxidase (APEX) und einer mutierten Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekannt als BioID) für die Untersuchung von PPI2,3,4entwickelt und genutzt. Das Prinzip von PL ist, dass ein Zielprotein von Interesse mit einem Enzym verschmolzen wird, das die Bildung von labilem Biotinyl-AMP (Bio-AMP) katalysiert. Diese kostenlosen Bio-AMP werden von PL-Enzymen freigesetzt und diffundieren in die Nähe des Zielproteins, wodurch die Biotinylierung von proximalen Proteinen an den primären Aminen in einem geschätzten Radius von 10 nm5ermöglicht wird.
Dieser Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Y2H- und IP-MS-Ansätzen, wie z. B. der Fähigkeit, transiente oder schwache PPI zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht PL die Kennzeichnung von proximalen Proteinen des Zielproteins in ihrer nativen zellulären Umgebung. Verschiedene PL-Enzyme haben einzigartige Nachteile, wenn sie auf verschiedene Systeme angewendet werden. Obwohl APEX beispielsweise eine höhere Tagging-Kinetik im Vergleich zu BioID bietet und erfolgreich in Säugetiersystemen angewendet wird, macht die Anforderung an giftiges Wasserstoffperoxid (H2O2) in diesem Ansatz es für PL-Studien an Pflanzen ungeeignet.
Im Gegensatz dazu vermeidet BioID-basierte S-basierte S-basierte S-basierte Verwendung der toxischenH2O2, aber die Rate der Etikettierung ist langsam (erfordert 18–24 h, um die Biotinylierung abzuschließen), wodurch die Erfassung vorübergehender PPI weniger effizient ist. Darüber hinaus führt die höhere Inkubationstemperatur (37 °C), die für eine effiziente PL durch BioID erforderlich ist, zu äußerer Belastung für einige Organismen, wie Pflanzen4. Daher wurde berichtet, dassderbegrenzte Einsatz von BioID-basierter PL in Pflanzen (d. h. Reisprotoplasten, Arabidopsis und N. benthamiana) 6,7,8,9gemeldet wurde. Das kürzlich beschriebene TurboID-Enzym bewältigt die Mängel von APEX und BioID-basierter PL. TurboID zeigte eine hohe Aktivität, die die Ausführung von PL innerhalb von 10 min bei RT10ermöglicht. TurboID-basierte sePL wurde erfolgreich in Säugetierzellen, Fliegen und Würmern10eingesetzt. Kürzlich haben wir und andere Forschungsgruppen den Einsatz von TurboID-basiertem PL für die Untersuchung von PPI in verschiedenen Pflanzensystemen, einschließlich N. benthamiana und Arabidopsis Pflanzen und Tomatenhaarwurzeln11,12,13,14, optimiert und erweitert. Vergleichende Analysen ergaben, dass TurboID bei PL in Anlagen besser abschneidet als BioID11,14. Es hat auch die Robustheit der TurboID-basierten PL in Planta gezeigt, indem eine Reihe von neuartigen Wechselwirkungen mit einem NLR-Immunrezeptor11identifiziert wurde, einem Protein, dessen Interaktionspartner in der Regel mit traditionellen Methoden schwer zu erhalten sind.
Dieses Protokoll veranschaulicht die TurboID-basierte PL in planta, indem es die Identifizierung von Interaktionsproteinen der N-terminalen TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in N. benthamiana-Pflanzen beschreibt. Die Methode kann auf alle Proteine von Interesse in N. benthamianaerweitert werden. Noch wichtiger ist, es bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von PPI in anderen Pflanzenarten wie Arabidopsis,Tomaten, und andere.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die TurboID Biotinligase wird durch Hefedisplay-basierte directed Evolution des BioID10erzeugt. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen PL-Enzymen. TurboID ermöglicht die Anwendung von PL auf andere Modellsysteme, einschließlich Fliegen und Würmern, deren optimale Wachstumstemperatur bei ca. 25 °C10liegt. Obwohl der PL-Ansatz in Tiersystemen weit verbreitet ist, ist seine Anwendung in Pflanzen begrenzt. Das hier beschriebene Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 bis Y.Z.), der National Natural Science Foundation of China (31872637 to Y.Z.) und der Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 bis Y.Z.) und der NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 und NIH-GM132582-01 bis S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
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