Summary
Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.
Abstract
Proximity labeling (PL) technieken met behulp van engineered ascorbate peroxidase (APEX) of Escherichia coli biotine ligase BirA (bekend als BioID) zijn met succes gebruikt voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPR's) in zoogdiercellen. De eisen aan toxische waterstofperoxide (H2O2)in PL op basis van APEX, langere incubatietijd met biotine (16-24 uur) en een hogere incubatietemperatuur (37 °C) in PL op basis van bio-ID beperken hun toepassingen in planten ernstig. De onlangs beschreven TurboID-gebaseerde PL adressen vele beperkingen van BioID en APEX. TurboID maakt snelle nabijheid etikettering van eiwitten in slechts 10 min onder kamertemperatuur (RT) voorwaarden. Hoewel het nut van TurboID is aangetoond in diermodellen, hebben we onlangs aangetoond dat TurboID-gebaseerde PL beter presteert in planten in vergelijking met BioID voor het labelen van eiwitten die proximaal zijn voor een eiwit van belang. Hier is een stapsgewijs protocol voor de identificatie van eiwitinteractiepartners met behulp van het N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domein van de nucleotide-bindende leucine-rich repeat (NLR) eiwitfamilie als model. De methode beschrijft vectorbouw, agroinfiltratie van eiwitexpressieconstructies, biotinebehandeling, eiwitextractie en ontzouten, kwantificering en verrijking van de bioateulaateiwitten door affiniteitszuivering. Het hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere eiwitten die van belang zijn voor Nicotiana en andere plantensoorten te bestuderen.
Introduction
PPR's vormen de basis van verschillende cellulaire processen. Traditionele methoden voor het identificeren van PPR's omvatten gist-twee-hybride (Y2H) screening en immunoneerslag in combinatie met massaspectrometrie (IP-MS)1. Echter, beide lijden aan een aantal nadelen. Y2H-screening vereist bijvoorbeeld de beschikbaarheid van de Y2H-bibliotheek van de doelplanten- of diersoorten. De bouw van deze bibliotheken is arbeidsintensief en duur. Bovendien wordt de Y2H-benadering uitgevoerd in de heterologe eencellige eukaryotische organismengist, die mogelijk niet de cellulaire status van hogere eukaryotische cellen vertegenwoordigt.
Ip-MS laat daarentegen een lage efficiëntie zien bij het vastleggen van voorbijgaande of zwakke PPR's, en het is ook ongeschikt voor eiwitten met een lage overvloed of hoge hydrofobie. Veel belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de plant signalering trajecten zoals receptor-achtige kinases (RLKs) of de NLR familie van immuunreceptoren worden uitgedrukt op lage niveaus en vaak interageren met andere eiwitten tijdelijk. Daarom beperkt het sterk het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van deze eiwitten.
Onlangs zijn proximity labeling (PL) methoden op basis van engineered ascorbate peroxidase (APEX) en een mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekend als BioID) ontwikkeld en gebruikt voor de studie van PPR's2,3,4. Het principe van PL is dat een doeleiwit van belang wordt gefuseerd met een enzym, dat de vorming van labiel biotinyl-AMP (bio-AMP) katalyseert. Deze vrije bio-AMP worden vrijgegeven door PL enzymen en diffuus naar de nabijheid van het doeleiwit, waardoor de biotinylation van proximale eiwitten op de primaire amines binnen een geschatte straal van 10 nm5.
Deze aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele Y2H- en IP-MS-benaderingen, zoals de mogelijkheid om voorbijgaande of zwakke PPR's vast te leggen. Bovendien maakt PL het labelen van proximale eiwitten van het doeleiwit in hun eigen cellulaire omgevingen mogelijk. Verschillende PL enzymen hebben unieke nadelen bij het toepassen van hen op verschillende systemen. Hoewel APEX bijvoorbeeld hogere tagging kinetiek biedt in vergelijking met BioID en met succes wordt toegepast in zoogdiersystemen, maakt de eis van toxische waterstofperoxide (H2O2)in deze aanpak het ongeschikt voor PL-studies in planten.
BioID-gebaseerde PL vermijdt daarentegen het gebruik van de toxische H2O2, maar de etiketteringssnelheid is traag (waarbij 18-24 uur nodig is om biotinylation te voltooien), waardoor het vangen van voorbijgaande PPR's minder efficiënt wordt. Bovendien introduceert de hogere incubatietemperatuur (37 °C) die nodig is voor een efficiënte PL van BioID externe stress voor sommige organismen, zoals planten4. Daarom is een beperkte inzet van op BioID gebaseerde PL in planten (d.w.z. rijstprotoplasten, Arabidopsis en N. benthamiana) gemeld6,7,8,9. De onlangs beschreven TurboID enzym overwint de tekortkomingen van APEX en BioID-gebaseerde PL. TurboID toonde een hoge activiteit die de verwezenlijking van PL binnen 10 min op RT10mogelijk maakt. TurboID-gebaseerde PL is met succes toegepast in zoogdiercellen, vliegen en wormen10. Onlangs hebben wij en andere onderzoeksgroepen onafhankelijk geoptimaliseerd en uitgebreid het gebruik van TurboID-gebaseerde PL voor het bestuderen van PPR's in verschillende plantaardige systemen, waaronder N. benthamiana en Arabidopsis planten en tomatenharige wortels11,12,13,14. Vergelijkende analyses wezen uit dat TurboID beter presteert voor PL in fabrieken in vergelijking met BioID11,14. Het heeft ook aangetoond dat de robuustheid van TurboID-gebaseerde PL in planta door het identificeren van een aantal nieuwe interacties met een NLR immuunreceptor11, een eiwit waarvan de interactie partners zijn meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van traditionele methoden.
Dit protocol illustreert de op TurboID gebaseerde PL in planta door de identificatie van interactie-eiwitten van het N-terminal TIR-domein van de NLR-immuunreceptor in N. benthamiana-planten te beschrijven. De methode kan worden uitgebreid tot alle eiwitten die van belang zijn in N. benthamiana. Wat nog belangrijker is, het verstrekt een belangrijke verwijzing voor het onderzoeken van PPR's in andere installatiesoorten zoals Arabidopsis,tomaat, en anderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Een overzicht van de methode wordt weergegeven in figuur 1.
1. Materiaalbereiding van planten
- Kweek N. benthamiana zaden in natte grond met een hoge dichtheid en bewaar ze in een klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol/m2s) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23-25 °C.
- Ongeveer 1 week later, zorgvuldig overbrengen van elke jonge zaailing tot 4 'x 4' potten en houd de zaailingen in dezelfde kamer.
- Onderhoud de planten in de kamer voor ongeveer 4 weken totdat ze groeien tot een blad stadium van 4-8 voor de daaropvolgende agroinfiltratie15.
2. Bouw van TurboID-fusies
- Gebruik standaard moleculaire kloontechniek om fusie van het doeleiwit te genereren met TurboID (PCR TurboID van Addgene plasmid #107177). Hier gebruikten we de N-terminal TIR domein van de NLR immuunreceptor als het doel eiwit van belang en gebouwd TIR gesmolten tot TurboID onder de controle van Bloemkool mozaïek virus 35S promotor (p35S::TIR-TurboID).
OPMERKING: De fusie van het TurboID-enzym aan het carboxyl-eindpunt of het amino-eindpunt van het doeleiwit is afhankelijk van het eiwit van belang. Meestal moeten voor een cytoplasma-eiwit beide termini aanvaardbaar zijn, zolang de TurboID-fusie de functie van het doeleiwit niet beïnvloedt. Echter, voor een membraan gelokaliseerd eiwit, de eiwittopologie moet worden gekenmerkt op voorhand voorafgaand aan de bepaling welke eindpunt is het beste voor TurboID fusie. - Bouw een door TurboID gesmolten citroen onder dezelfde promotor om te dienen als controle voor latere kwantitatieve proteomische analyse.
OPMERKING: Het is belangrijk om een TurboID-besturingselement te construeren voor het identificeren van het proteoomproximale voor het doeleiwit. De TurboID-fusieregeling moet een expressieniveau vertonen dat vergelijkbaar is met dat van het door TurboID gefuseerde doeleiwit. Dit kan empirisch worden bepaald door het aanpassen van de Agrobacterium concentratie tijdens agroinfiltratie. Daarnaast is het belangrijk dat het controle-eiwit een subcellulair lokalisatiepatroon heeft dat vergelijkbaar is met dat van het doeleiwit van belang.
3. Agroinfiltratie
- Transformatie van de plasmiden naar Agrobacterium
- Voeg 0,5 μg van de plasmiden die zijn gegenereerd uit stappen 2.1 en 2.2 tot 50 μL Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 bevoegde cellen, bereid zoals eerder beschreven16.
LET OP: Andere Agrobacterium stammen, zoals GV2260, kunnen ook worden gebruikt. - Incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Hitteschok in een waterbad bij 42 °C voor 60 s.
- Voeg 400 μL LB-medium (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract en 10 g/L NaCl; pH = 7,0) toe aan de Agrobacterium en incubeer bij 28 °C gedurende 90 min.
- Verguld de volledige inhoud in de buis op LB agar aangevuld met geschikte antibiotica om de plasmide te selecteren, evenals voor de Agrobacterium (voor GV3101: 50 mg/L gentamicin en 50 mg/L rifampicin).
- Incubeerplaten bij 28 °C gedurende 36-48 uur tot individuele kolonies zichtbaar zijn.
- Voeg 0,5 μg van de plasmiden die zijn gegenereerd uit stappen 2.1 en 2.2 tot 50 μL Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 bevoegde cellen, bereid zoals eerder beschreven16.
- Pluk en streep verschillende afzonderlijke kolonies op een verse LB agar plaat met antibiotica (zie stap 3.1.5) en groeien bij 28 °C 's nachts.
OPMERKING: Het is beter om de kolonie PCR uit te voeren om de aanwezigheid van de specifieke binaire constructie in de Agrobacteriumte bevestigen. In onze ervaring, meer dan 95% van de kolonies bevatten de geïntroduceerde binaire constructies. - Inenting 3 mL lb medium plus passende antibiotica (zie stap 3.1.4) met Agrobacterium kolonie herbergen de constructie van belang, en incuberen door te schudden 's nachts bij 28 °C tot de OD600 van de Agrobacterium cultuur bereikt 2.0.
- Centrifugeer de cellen op 3.000 x g en stoer ze opnieuw tot OD600 = 1.0 in agroinfiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES [pH = 5,6], 250 μM acetosyringon).
OPMERKING: Hoewel het optimaal is om het intartikelum 2 uur lang bij RT voorafgaand aan agroinfiltratie uit te broeden, is er in onze ervaring met de GV3101-stam geen groot verschil tussen de doeleiwitexpressie met vs. zonder incubatie. - Gebruik een 1 mL naaldloze spuit om het entmateriaal te infiltreren in de (abaxiale) opperhuid van de volledig volwassen N. benthamiana bladeren.
OPMERKING: Om een voldoende hoeveelheid bladmaterialen voor te bereiden op drie biologische replicaties: een heel blad wordt meestal geïnfiltreerd, drie bladeren worden per plant geïnfiltreerd en voor elke constructie worden drie tot vier planten gebruikt. Voor elk blad is 1,5-2,0 mL geresuspendeerde agrobacteriën voldoende. - Na 36 uur post-infiltratie (hpi), infiltreren 200 μM biotine (in 10 mM MgCl2 oplossing) in de bladeren vooraf geïnfiltreerd met TurboID constructies.
- Onderhoud de plant 3-12 uur extra voordat u het bladweefsel oogst zoals beschreven in punt 4.
OPMERKING: De reden voor het kiezen van de 36 hpi voor biotine infiltratie is dat de beoogde eiwitexpressie pieken op dit moment volgens eerdere studies11. Het wordt aangeraden om de tijd te bepalen die nodig is voor een optimale expressie van het doeleiwit van belang. De incubatietijd na biotine infiltratie is afhankelijk van het experimentele ontwerp en het doeleiwit dat in studie wordt bestudeerd. Meestal, 3-12 uur van biotine behandeling maakt het labelen van de meeste eiwitten proximale aan het doeleiwit door de TurboID fusies.
4. Bladmonsterverzameling
OPMERKING: Draag voor de latere verwerking van de bladmonsters steriele handschoenen om keratinebesmetting van de monsters te voorkomen. Alle reagentia moeten ook zo keratinevrij mogelijk zijn.
- Snijd de geïnfiltreerd bladeren aan de basis van de petiole, verwijder de bladader, dan flash-freeze het bladweefsel in vloeibare stikstof.
- Maal het bladweefsel met behulp van een stamper en mortel en bewaar het bladpoeder in 15 mL of 50 mL valkbuizen bij -80 °C voor later gebruik.
LET OP: Neem drie tot vier stukken bladeren voor elk van de drie biologische repliceert van verschillende planten. Het protocol kan hier worden onderbroken. Voorafgaand aan de volgende stappen wordt aanbevolen om eiwitexpressie en biotinylation van het doeleiwit te beoordelen aan de hand van immunoblot-analyses. Typische westerse vlekken worden weergegeven in figuur 2.
5. Extractie van bladtotaaleiwit
- Breng ongeveer 0,35 g bladpoeder over op een buis van 2 mL. Bereid twee buizen voor elk monster.
LET OP: Draag handschoenen bij het aanraken van een voorwerp gekoeld door vloeibare stikstof. - Voeg 700 μL RIPA lysisbuffer (50 mM Tris-HCl [pH = 7,5], 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 [v/v], 0,1% SDS [w/v], 0,5% natriumdeoxycholaat [w/v], 1 mM DTT, 1 tablet proteaserremcocktail) tot 0,35 g bladpoeder
- Draai de buizen 10 min.
- Laat de monsters 30 min op ijs staan.
- Meng de inhoud om de 4-5 min door de buizen meerdere keren ondersteboven te draaien.
6. Verwijdering van gratis biotine door ontzouten
LET OP: Deze sectie duurt ongeveer 50 min.
- Equilibrate de ontzouten kolom.
- Verwijder de sealer aan de onderkant van de ontzouten kolom en zet de kolom in een 50 mL buis.
- Verwijder de opslagoplossing door centrifugering bij 1000 x g en 4 °C gedurende 2 min en zorg ervoor dat de dop wordt losgemaakt.
- Doe de ontzouten kolom in een 50 mL buis. Equilibrate de kolom 3x met 5 mL ripa lysis buffer, elke keer centrifugeren op 1000 x g en 4 °C voor 2 min en het weggooien van de flowthrough.
- Breng de ontzouten kolom in een nieuwe 50 mL buis en bewaar tijdelijk bij 4 °C voor later gebruik.
- Draai de buizen van stap 5.4 bij 16.500 x g en 4 °C gedurende 10 min en breng de supernatant van de twee buizen over in een nieuwe 2 mL buis.
- Voeg 1.500 μL eiwitextract toe aan de bovenkant van de hars van de geëquilibrate desalting kolom (vanaf stap 6.1.4). Wanneer het eiwitextract in de hars komt, voegt u nog eens 100 μL RIPA lysisbuffer toe.
OPMERKING: Hoewel 1.400 μL RIPA lysisbuffer werd gebruikt voor eiwitextractie uit de bladeren, werd het totale volume na eiwitextractie en ontzouten steevast tot op zekere hoogte verhoogd ten opzichte van het oorspronkelijke volume. Daarom kan een combinatie van de monsters van elke groep zoals beschreven in stappen 5.1 en 5.4 resulteren in ten minste 1.500 μL eiwitextract per monster. - Centrifugeer bij 1000 x g en 4 °C gedurende 2 min en laat de gedezouten monsters tijdelijk op ijs staan.
7. Kwantificering van de gedezouten eiwitextracten met behulp van een Bradford-test
- Bereid 50 μL van elke gradiënt BSA-oplossing: 0 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL en 1 mg/mL.
- Verdun het gedezouten eiwitextract door een 5 μL monster te mengen met 45 μL ddH2O.
- Bereid 1x Bradford regent door het verdunnen van de 5x Bradford regent (100 mg Coomassie briljante blauwe G250, 47 mL, 100 mL van 85% fosforzuur, 53 mL van methanol2O).
- Voeg 50 μL van de bsa-oplossing per verloop en 50 μL verdund eiwitextract toe aan de 2,5 mL van 1x Bradford regent.
- Incubeer bij RT voor 10 min.
- Voeg 200 μL oplossing van elk monster toe aan één put van een ELISA-plaat (drie technische replica's per monster).
- Meet de OD595 met behulp van een microplaatlezer.
- Teken de standaardcurve op basis van de waarde van de gradiënt BSA-oplossing en bereken de concentratie van de gedezouten eiwitmonsters. Meestal varieert de totale eiwitconcentratie verkregen uit 0,7 g bladeren van 3-6 mg/mL.
- Bereid 6-8 mg ontzout eiwitextract voor op latere affiniteitszuivering.
8. Verrijking van bioatlateeiwitten
- Neem 200 μL streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen in een buis van 2 mL.
- Equilibrate de streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen met 1 mL ripa lysis buffer voor 1 min bij RT.
- Gebruik na elke wasbeurt het magnetische rek om de kralen 3 min te adsorberen en verwijder de oplossing voorzichtig door te pipetteren.
- Herhaal stap 8.2 en 8.3.
- Breng het gedezouten eiwitextract over op de geequilibrate streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen.
- Incubeer de buis bij 4 °C gedurende 12 uur (of 's nachts) op een rotator om de biotinylated eiwitten te beschermen.
- Leg de kralen op een magnetisch rek gedurende 4 minuten bij RT tot de kralen verzamelen aan de ene kant van de buis, verwijder dan voorzichtig de supernatant door pipet.
- Voeg 1,7 mL wasbuffer I (2% SDS in water) toe aan de buis en houd deze 8 minuten op de rotator bij RT. Herhaal stap 8.3.
- Voeg 1,7 mL wasbuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic acid [w/v], 1% Triton X-100) toe aan de buis en houd het 8 min op de rotator bij RT. Herhaal stap 8.3.
- Voeg 1,7 mL wasbuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholic acid [w/v], 1% NP40 [v/v]) toe aan de buis en bewaar het op de rotator bij RT gedurende 8 min. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3. Herhaal de stap 8.3.
- Voeg 1,7 mL van 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) toe om het wasmiddel te verwijderen en herhaal stap 8.3.
- Breng de kralen naar een nieuwe buis van 1,5 mL en herhaal de stappen 8.11 en 8.3.
- Was de kralen 6x voor 5 min elk met 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer bij RT.
- Voeg 1 mL van 50 mM ammoniumbicarbonaatbuffer toe aan de magnetische kralen en meng goed.
- Verwijder 100 μL kralen voor immunoblotanalyse om de verrijking van bioateuze eiwitten te bevestigen. Een typische westelijke vlek wordt getoond in Figuur 3.
- Zet de rest van de eiwitmonsters in en wordt opgeslagen bij -80 °C of stuur ze onmiddellijk voor LC-MS/MS-analyse op droogijs.
OPMERKING: Typische MS-resultaten worden weergegeven in een eerdere publicatie (Zhang et al. 2019; Figuur 2, Aanvullende gegevens 1 en aanvullende gegevens 2)11. De hele gegevenssets zijn beschikbaar op MassIVE (te vinden op
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve gegevens, die de verwachte resultaten op basis van het beschreven protocol illustreren, zijn aangepast van Zhang etal. 11. Figuur 1 vat de procedures voor het uitvoeren van TurboID-gebaseerde PL in N. benthamiana. Figuur 2 toont de eiwitexpressie en biotinylation in de geïnfiltreerd N. benthamiana bladeren. Figuur 3 toont aan dat de bioatlateeiwitten in de geïnfiltreerd bladeren efficiënt werden verrijkt voor latere massaspectrometrieanalyse. Opgemerkt moet worden dat na verrijking van de bioatlated eiwitten met behulp van streptavidn-C1-geconjugeerde magnetische kralen, verschillende eiwitten met verschillende maten werden gevangen, en westerse vlekanalyse van de verrijkte eiwitten aangetoond besmeurde banden (Figuur 3). Soortgelijke opmerkingen zijn gemaakt in verschillende recent gepubliceerde studies6,7,13,14.
Figuur 1: Overzicht van de pl-methode op basis van TurboID in N. benthamiana. Agrobacterium herbergen de TurboID-fusie constructies werden geïnfiltreerd in N. benthamiana bladeren. 36 uur post-infiltratie, 200 μM biotine wordt geïnfiltreerd aan dezelfde bladeren om biotinylation van de endogene eiwitten die proximaal zijn om de TurboID-gesmolten doeleiwit te starten. De geïnfiltreerd planten worden vervolgens geïncubeerd bij RT voor 3-12 uur, gevolgd door blad oogsten en malen in vloeibare stikstof. Bladpoeder wordt gelyseerd in de RIPA lysisbuffer en er wordt een ontzouten kolom gebruikt om de vrije biotine in het eiwitextract te verwijderen. De bioatlateeiwitten werden vervolgens affiniteitgezuiverd met streptavidine-geconjugeerde kralen en geïdentificeerd door massaspectrometrie. Dit cijfer is aangepast uit aanvullende figuur 3 van Zhang etal. 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Immunoblot-analyse van eiwitextracten verkregen in stap 4.2. (A) Westerse vlekanalyse van eiwitten uit de agrogeïnfiltreerd bladeren met antilichaam tegen HA-tag. (B) Westerse vlekanalyse van biolatelated eiwitten in de agrogeïnfiltreerd bladeren met streptavidin-HRP. Dit cijfer is aangepast uit aanvullend cijfer 6B van Zhang etal. 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Westerse vlekanalyse van kralen verkregen in stap 8.15 om de verrijking van bioatlateeiwitten te bevestigen. Voor elke constructie zijn er drie onafhankelijke replicaties (1, 2 en 3). Streptavidin-HRP werd gebruikt voor de analyse van bioatlateeiwitten in verschillende monsters. Dit cijfer is aangepast uit aanvullende figuur 7 van Zhang etal. 11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De TurboID biotine ligase wordt gegenereerd door gist display-gebaseerde gerichte evolutie van de BioID10. Het heeft vele voordelen ten opzichte van andere PL enzymen. TurboID maakt de toepassing van PL op andere modelsystemen mogelijk, waaronder vliegen en wormen, waarvan de optimale groeitemperatuur ongeveer 25 °C10ligt. Hoewel de PL-aanpak op grote schaal is gebruikt in dierlijke systemen, is de toepassing ervan in planten beperkt. Het protocol dat hier wordt beschreven biedt een stapsgewijze procedure voor de oprichting van de turboid-gebaseerde PL in N. benthamiana, een modelplant die op grote schaal is gebruikt in planten-pathogene interactie studies. Dit protocol schetst bladmonsterbereiding, verwijdering van vrije biotine, kwantificering van de geëxtraheerde eiwitten en verrijking van de biotinylated eiwitten.
Hoewel gratis biotine in dierlijke celkweeksystemen grotendeels kan worden verwijderd door de cellen met PBS-buffer4te wassen, kan de vrije biotine in bladweefsel niet worden gewist door eenvoudig te wassen. Een recente studie wees uit dat de vrije biotine ernstige gevolgen kan hebben voor de daaropvolgende verrijking van de bioatlateeiwitten11. In dit protocol wordt een ontzouten kolom gebruikt om met succes gratis biotine in de eiwitextracten te verwijderen, waardoor de efficiënte binding van biotinylated eiwitten aan de streptavidine kralen.
Bovendien dient dit protocol als een belangrijke referentie voor het uitvoeren van PL in andere installatiesystemen. Onlangs hebben drie rapporten gebruikt TurboID-gebaseerde PL in Arabidopsis12,,13,14 en tomaat harige wortel12, naast de N. benthamiana hier beschreven. Net als bij de kweeksystemen van dierlijke cellen werd de verwijdering van de vrije biotine bereikt door de protoplasten van de plant te wassen voorafgaand aan eiwitextractie6. Echter, lagere hoeveelheden vrije biotine moleculen die niet geïntegreerd waren in het eiwit bestond in het interieur van de cel, die de efficiëntie van de daaropvolgende verrijking van de bioateulaat eiwitten beïnvloed. Daarom wordt een ontzouten procedure aanbevolen voor volledige verwijdering van gratis biotine, waardoor de terugwinningsefficiëntie van biotinylated eiwitten toeneemt.
Twee soorten kolommen, PD-10 en Zeba, zijn gebruikt voor gratis biotine verwijdering11,12,13,14. Het kan in de toekomst van belang zijn om de efficiëntie van deze twee kolommen te vergelijken met het verwijderen van gratis biotine in bladeiwitextracten. Bovendien maakt dit protocol gebruik van een canonieke spuit-gemedieerde agroinfiltratie methode om tijdelijk uit te drukken het doel eiwit van belang in N. benthamiana bladeren. Vervolgens wordt het biotinesubstraat opnieuw geïnfiltreerd in de bladeren voor het labelen van eiwitten die proximaal zijn voor het doeleiwit. Soortgelijke operaties zijn ook gebruikt in andere twee onlangs gerapporteerde studies12,13. Als alternatieve methode is vacuüm gemedieerde infiltratie van biotine van toepassing voor zowel N. benthamiana als Arabidopsis14. Bovendien kunnen celculturen in planten die niet geschikt zijn voor agroinfiltratie worden getransformeerd voor doeleiwitexpressie, gevolgd door biotinebehandeling ennabijheidsetiketteringstest 12. Deze recente studies hebben de robuustheid van turboid-gebaseerde PL in het bestuderen van PPR's en hebben de basis gelegd voor toekomstige toepassingen van TurboID-gebaseerde PL in verschillende plantensoorten.
In dit protocol wordt Agrobacteriumde gevestigde Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande expressie in N. benthamiana gebruikt om PPR's van het doeleiwit van belang te identificeren. Voorbijgaande expressie kan leiden tot overexpressie van de fusie-eiwitten. Daarom is een meer optimaal alternatief is om de TurboID fusie ingenieur onder de controle van een inheemse promotor en uit te drukken door agroinfiltratie of generatie van stabiele transgene lijnen. Met de ontwikkeling van genoombewerkingstechnologie is het ook mogelijk om het TurboID-fragment rechtstreeks in de inheemse genomische loci van genen van belang te plaatsen.
Een andere belangrijke factor die in overweging moet worden genomen, is ervoor te zorgen dat de TurboID-fusie de functie van het doeleiwit van belang niet verandert. In een eerdere studie werd de functie van de NLR-immuunreceptor die tot TurboID is gefuseerd, bevestigd door het testen van zijn vermogen om de verdediging-gemedieerde celdood te induceren in aanwezigheid van tabaksmozaïekvirus p50 effector11. TurboID is relatief groter (d.w.z. 35 kDa) dan GFP, en de fusie ervan naar een doeleiwit kan de functie van een doeleiwit beïnvloeden. In dergelijke gevallen kan de kleinere miniTurboID10 worden gebruikt.
Het is ook belangrijk om te bepalen welk eindpunt van het doeleiwit geschikt is voor het smelten met TurboID. Een algemene benadering voor dergelijke functionele tests is het bepalen of de TurboID-fusie een aanvulling zal vormen op de gemuteerde plantenlijn van het doelgen. Als alternatief kan analyse van de interactie van de TurboID-fusie met een voorheen bekende interactiepartner van het doeleiwit worden gebruikt. In de meeste gevallen kan voor cytoplasmaproïnen N-terminal of C-terminal tagging van de TurboID vergelijkbare datasets produceren in de daaropvolgende massaspectrometrieanalyse. Echter, voor membraan-gelokaliseerde eiwitten, is het belangrijk om de topologie te bepalen vóór vectorconstructie. Anders zal de fusie van TurboID stroomopwaarts of stroomafwaarts van de coderingsvolgorde van genen van belang totaal verschillende resultaten opleveren. Daarom is het belangrijk om de tegenoverelkaar staande zijden (bijvoorbeeld cytoplasma- of lumen-facing) van het N-eindpunt of C-eindpunt van de membraangelokaliseerde eiwitten te bepalen. Dit zorgt ervoor dat het verwachte proximale proteoom van het doeleiwit kan worden verkregen.
Hoewel PL verschillende voordelen heeft ten opzichte van de traditionele IP-MS-benaderingen voor het opsporen van voorbijgaande of zwakke PPR's, heeft het zijn eigen intrinsieke beperkingen. Ten eerste impliceert de identificatie van een kandidaat-interactie-eiwitten niet onmiddellijk een directe of indirecte interactie met het aaseiwit, maar het weerspiegelt alleen de nabijheid2. Daarom kunnen onafhankelijke in vivo tests (d.w.z. co-immunoprecipitatie, bimoleculaire fluorescentiecomplementatie [BiFC], of in vitro GST-pull down assay) worden uitgevoerd om PPR's verder te verifiëren.
Ten tweede, valse negatieven of valse positieven kunnen voortvloeien uit PL test als gevolg van verschillende redenen. Er kunnen bijvoorbeeld valse negatieven optreden wanneer het eiwit geen toegankelijke primaire amines heeft. Bovendien toonden recente studies van BIN2-interactoren in planten een gedeeltelijke overlapping aan tussen gegevens uit twee experimenten13, waaruit het bestaan van valse negatieve resultaten als gevolg van onvoldoende dekking van de lidstaten blijkt. Sommige interactoren van het doeleiwit kunnen ook zwak worden biotinylated door de TurboID-gesmolten controle, resulterend in een vouwverrijking onder de cutoff drempel en uiteindelijk het verlies van sommige echte interactors13,14. Daarom moeten voldoende biologische replicaties met passende controles en afschakelwaarden worden ingesteld om het aantal valse negatieven te minimaliseren11,14.
Bovendien kan een lange biotinebehandelingsperiode de biotinylation van niet-specifieke eiwitten verhogen, wat resulteert in valse positieven10. Daarom is het belangrijk om in vivo labelingtijdvensters te optimaliseren om de niet-specifieke biotinylation te verminderen, terwijl het ook geen invloed heeft op de productie van bioatlate eiwitten voor analyse11,12,13,14. Bovendien wordt harde extractie en strenge wasomstandigheden aanbevolen om de valse positieven afkomstig van niet-specifieke binding van eiwitten aan de kralen17te verminderen. Naast de hierboven beschreven kanttekeningen, is het ontwerp van een goede negatieve controle van cruciaal belang om echte interactoren te onderscheiden van valse interactors en te voorkomen dat echte interactors11,12,13,14.
TurboID toonde sterk verbeterde etikettering kinetiek in vergelijking met die van BioID10,11. Dit kan echter ook leiden tot een hogere achtergrond tijdens pl-analyse. Daarom moeten passende controles worden opgenomen om de achtergrondsignalen te elimineren. We gebruikten de citrien gesmolten TurboID in dit protocol11, en een soortgelijke controle is gebruikt in eerdere studies18. Voor de doeleiwitten die lokaliseren naar een specifiek organellemembraan, maakt TurboID-fusing met een signaalpeptide dat zich richt op hetzelfde organellemembraan een betere controle dan TurboID-fusing met een die wordt uitgedrukt in het cytoplasma14.
Bovendien, als informatie over het belangrijkste domein of aminozuren in het doeleiwit dat de interacties met andere partners bepalen bekend zijn, moet het smelten van de TurboID met een doeleiwit met een mutatie in het sleuteldomein of aminozuren de beste controle zijn en de achtergrondsignalen die door het doeleiwit worden gegenereerd maximaal verminderen. Bovendien vereisen TurboID-enzymen specifieke temperaturen en goede pH-omstandigheden. Voor de meeste organellen in de cel, zoals de ER, kern en mitochondriën, turboid met succes gelabeld de proximale eiwitten10. Sommige speciale organellen (d.w.z. vacuoles in plantencellen, waarvan de pH zeer laag is19)kunnen echter niet geschikt zijn voor het bestuderen van PPR's met behulp van de PL-benadering. Bovendien kunnen veranderingen in de pH-waarden of oxidatiereductietoestanden van de subcellulaire omgeving tijdens de stressrespons de etiketteringsefficiëntie van de TurboID beïnvloeden.
Samengevat vormt het hier beschreven protocol de basis voor het onderzoeken van PPR's met turboïsten in N. benthamiana, een modelinstallatiesysteem dat op grote schaal is gebruikt in vele aspecten van plantenbiologie20. Met de onlangs beschreven TurboID-gebaseerde PL-studies in Arabidopsis planten en tomaat harige wortels12,13,14, wordt verwacht dat deze methode van toepassing zal worden op andere plantensoorten. Verwacht wordt dat het op TurboID gebaseerde PL een belangrijke rol zal spelen bij het bestuderen van PPR's in plantenbiologieonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 tot Y.Z.), de National Natural Science Foundation of China (31872637 aan Y.Z.), en de Fundamental Research Funds voor de Centrale Universiteiten (2019TC028 aan Y.Z.), en NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 en NIH-GM132582-01 naar S.P.D.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
