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Biochemistry

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per coniugare il monomero proteico mediante enzimi formando polimeri proteici con una sequenza controllata e immobilizzandolo sulla superficie per studi di spettroscopia di forza singola molecola.

Abstract

Le tecniche chimiche e di bioconiugazione sono state sviluppate rapidamente negli ultimi anni e consentono la costruzione di polimeri proteici. Tuttavia, un processo di polimerizzazione delle proteine controllato è sempre una sfida. Qui, abbiamo sviluppato una metodologia ezimatica per la costruzione di proteine polimerizzate passo dopo passo in una sequenza controllata razionalmente. In questo metodo, il capolinea C di un monomero proteico è NGL per la coniugazione proteica che utilizza OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mentre l'N-terminus era un TEV scissione scissione scissione scissione scissionio più un L (ENLYFQ/GL) per la protezione temporanea dei N-terminali. Di conseguenza, OaAEP1 è stato in grado di aggiungere un solo monomero proteico alla volta, e poi la proteasi TEV ha sfoltito il N-terminus tra Q e G per esporre l'NH2-Gly-Leu. Quindi l'unità è pronta per la prossima legatura OaAEP1. La poliproteina ingegnerizzata viene esaminata dispiegando un singolo dominio proteico utilizzando la spettroscopia a forza singola a forza atomica a base di microscopia (AFM-SMFS). Pertanto, questo studio fornisce una strategia utile per l'ingegneria poliproteica e l'immobilizzazione.

Introduction

Rispetto ai polimeri sintetici, le proteine naturali multidominio hanno una struttura uniforme con un numero ben controllato e un tipo di sottodomini1. Questa caratteristica di solito porta a migliorare la funzione biologica e la stabilità2,3. Molti approcci, come l'accoppiamento del legame disulfide a base di cisteina e la tecnologia del DNA ricombinante, sono stati sviluppati per la costruzione di una proteina polimerizzata con più domini4,5,6,7. Tuttavia, il primo metodo si traduce sempre in una sequenza casuale e incontrollata, e il secondo porta ad altri problemi, tra cui la difficoltà per la sovraespressione di proteine tossiche e di grandi dimensioni e la purificazione di proteine complesse con cofattore e altri enzimi delicati.

Per affrontare questa sfida, sviluppiamo un metodo ezimatico che coniuga il monomero proteico insieme per polimero/poliproteina in modo graduale utilizzando una proteina ligase OaAEP1 combinata con un TEV di proteasi8,9. OaAEP1 è un endopeptidase rigoroso ed efficiente. Due proteine possono essere collegate covalentmente come sequenza Asn-Gly-Leu (NGL) attraverso due termini da OaAEP1 in meno di 30 min se lo N-terminus è residui di Gly-Leu (GL) e l'altro di cui il C-terminus è residui NGL10. Tuttavia, l'uso di OaAEP1 solo per collegare il monomero proteico porta a un polimero proteico con una sequenza incontrollata come il metodo di accoppiamento a base di cisteina. Pertanto, progettiamo il capo N dell'unità proteica con un sito di proteasi TEV rimovibile più un residuo di leucina come ENLYFQ/G-L-POI. Prima della scissione TEV, il terminale N non avrebbe partecipato alla legatura OaAEP1. E poi i residui di GL a N-terminus, che sono compatibili con l'ulteriore legatura OaAEP1, viene esposto dopo la scissione TEV. Così, abbiamo raggiunto un metodo di biosintesi ezimatica sequenziale della poliproteina con una sequenza relativamente ben controllata.

Qui, il nostro metodo di sintesi ezimatica graduale può essere utilizzato nella preparazione del campione di poliproteina, compresa la produzione di campioni di poliproteina, inclusa la sequenza controllata e incontrollata, e l'immobilizzazione delle proteine anche per studi a singola molecola, in particolare per il sistema complesso come metalloproteina.

Inoltre, gli esperimenti SMFS basati su AFM ci permettono di confermare la costruzione e la stabilità del polimero proteico a livello di singola molecola. La spettroscopia di forza a singola molecola, tra cui AFM, pinzetta ottica e pinzetta magnetica, è uno strumento generale nella nanotecnologia per manipolare la biomolecola meccanicamente e misurare la loro stabilità11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM a singola molecola è stato ampiamente utilizzato nello studio delle proteine (un)folding21,22,23,24,25, la misura della forza di interazione recettore-ligando26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, legame chimico inorganico20,36,37,38,39,40,41,42,43 e legame metallo-ligando in metalloproteine44,45,46,47,48,49,50 . In questo caso, l'AFM a singola molecola viene utilizzato per verificare la sequenza di poliproteine sintetizzate in base al corrispondente segnale di spiegatura delle proteine.

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Protocol

1. Produzione di proteine

  1. Clone genico
    1. Acquistare geni codificando per la proteina di interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, il modulo di cellulosa-legante (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) e coesione da Ruminococcus flavefacience, tabacco etch virus (TEV) protease, polietidi elastin-like (ELP).
    2. Eseguire la reazione a catena della polimerasi e utilizzare il sistema enzimatico di digestione a tre restrizioni BamHI-BglII-KpnI per ricombinare il gene da diversi frammenti proteici.
    3. Confermare tutti i geni mediante il sequenziamento diretto del DNA.
  2. Espressione e produzione di proteine
    1. Trasformare E. coli BL21(DE3) con il pQE80L-POI o il pET28a-POI plasmid per l'espressione.
    2. Scegli una singola colonia in 15 mL di lB medio con i rispettivi antibiotici (ad es. 100 g/mL sale di sodio ampicillina o 50 g/mL, kanamycin). Continuare a scuotere le colture a 200 giri/min a 37 gradi centigradi per 16-20 h.
    3. Diluire le colture durante la notte in 800 mL di LB medio (1:50 diluizione). Per la rubredossina, centrificare la coltura a 1.800 x g, quindi risospendere in 15 mL di M9 medio (completato con 0.4% glucosio, 0.1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), quindi diluirlo in 800 mL di M9 medio.
    4. Incubare la coltura a 37 s mentre si agita a 200 giri/min, fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD600)di 0,6. Salvate 100 campioni di coltura come controllo pre-induzione per testare l'espressione delle proteine.
    5. Indurre l'espressione proteica aggiungendo IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM e scuotere la coltura a 37 s per 4 h a 200 rpm. Riservare un campione di 100 l l della coltura come controllo post-induzione per testare l'espressione delle proteine.
    6. Centrifugare la coltura a 13.000 x g per 25 min a 4 gradi centigradi e conservare a -80 gradi centigradi prima della purificazione.
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
  3. Purificazione delle proteine di interesse
    1. Risospendere le celle in 25 mL di buffer di lisi (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 contenente DNase, RNase, PMSF) e utilizzare un sonicatore (15% di ampiezza) per laligazione per 30 min sul ghiaccio.
    2. Chiarire la cella lisata a 19.000 x g per 40 min a 4 gradi centigradi.
    3. Confezione 1 mL (volume letto) della colonna di affinità Co-NTA o Ni-NTA e lavare la colonna con 10 volumi di colonna (CV) di acqua ultrapura e poi 10 CV di buffer di lavaggio (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazole, pH 7.4) dal flusso di gravità.
    4. Passare il supernatante proteico attraverso la colonna dal flusso di gravità per tre volte.
    5. Versare il buffer di lavaggio sulla colonna con 50 CV per allontanarsi dalle proteine contaminanti.
    6. Eluire la proteina legata con 3 CV di tampone di eluizione ghiacciata (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 7.4). Quando si tratta di proteine rubredossina, è necessaria un'ulteriore purificazione di scambio di anionutilizzando utilizzando la colonna di scambio di anion a pH 8,5 a 4 gradi centigradi.
    7. Analizzare il campione per SDS-PAGE.

2. Funzionalizzazione di coverslip e superficie a sbalzo

  1. Preparazione della superficie dello scivolo di copertura funzionalizzato
    1. Sciogliere 20 g di cromo di potassio in 40 mL di acqua ultrapura. Aggiungere lentamente 360 mL di acido solforico concentrato alla soluzione cromo di potassio con asta di vetro mescolare delicatamente e preparare l'acido cromatico.
      AVVISO: La sostanza chimica utilizzata qui e l'acido cromatico finale è fortemente corrosivo e acido. Lavorare con attrezzature protettive adeguate. La soluzione rilascia calore quando aggiungere acido solforico concentrato, il che significa un'aggiunta lenta e una pausa adeguata per il raffreddamento.
    2. Pulire e attivare una vetrina di vetro a 80 gradi centigradi per 30 minuti mediante trattamento dell'acido cromatico. Immergere completamente i copricopre in una soluzione toluene APTES dell'1% (v/v) per 1 h a temperatura ambiente, proteggendoli dalla luce.
    3. Lavare il coperchio con toluene e alcool etilico assoluto e asciugare il coperchio con un flusso di azoto.
    4. Incubare il coperchio a 80 gradi centigradi per 15 min e poi raffreddare a temperatura ambiente.
    5. Aggiungete 200 l di sulfo-SMCC (1 mg/mL) in acido dimetilo (DMSO) tra due copritrici immobilizzate e incubate per 1 h protetta dalla luce.
    6. Lavare prima la coverslip con DMSO e poi con alcool etilico assoluto per rimuovere il residuo sulfo-SMCC.
    7. Asciugare il coperchio sotto un flusso di azoto.
    8. Pipet 60 -L di 200 M SOLUZIONE di proteine GL-ELP50nm-C su un coverslip funzionale e incubare per circa 3 h.
    9. Lavare il coperchio con acqua ultrapura per rimuovere il GL-ELP50nm-C non reagito.
      NOTA: i coperchi funzionati sono in grado per circa due settimane di stoccaggio a 4 gradi centigradi.
  2. Preparazione della superficie a sbalzo funzionalizzata
    1. Pulire gli sbalzini a 80 gradi centigradi per 10 min mediante trattamento dell'acido cromatico.
    2. Funzionalizza lo sbalzo con l'amminitazione con la soluzione toluene APTES dell'1% (v/v) e cuoce lo sbalzo a 80 gradi centigradi per 15 min prima di coniugare al sulfo-SMCC.
    3. Collegare il C-ELP50nm-NGL alla superficie con il gruppo di maleimide di sulfo-SMCC per 1,5 h.
    4. Lavare via il C-ELP50nm-NGL non reagito sulla coverslip dall'acqua ultrapura.
    5. Immergi un sbalzo funzionalizzato in una soluzione proteica gl-CBM-XDoc da 50 M contenente 200 nM OaAEP1 a 25 gradi centigradi per 20-30 min. Quindi utilizzare buffer AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) per lavare via le proteine non retati.
      NOTA: La chimica di superficie dei cantilever e del coverslip sono simili.

3. Preparazione graduale della poliproteina con sequenze controllate

  1. Collegare l'unità di legatura Coh-tev-L-POI-NGL al GL-ELP50nm immobilizzato sulla superficie del coperchio da OaAEP1 per 30 min.
  2. Utilizzare 15-20 mL di buffer AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) per lavare via eventuali proteine non reagite.
  3. Aggiungete 100 l di proteasi TEV (0,5 mEdTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerolo, pH 8.0) per fendere l'unità proteica presso il sito di riconoscimento TEV per 1 h a 2 5 gradi centigradi.
  4. Utilizzare 15-20 mL di tampone AFM per lavare via le proteine residue.
  5. Collegare l'unità di ligazione Coh-tev-L-POI-NGL al GL-Ub-NGL-Glass di OaAEP1 per 30 min.
  6. Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,5 N-1 per costruire la proteina GL-(Ub)n-NGL sulla superficie del vetro. Omettere l'ultima reazione di scissione TEV per riservare coesina sulla proteina-polimero come Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. AFM Misurazione dell'esperimento e analisi dei dati

  1. Misure AFM
    1. Aggiungere 1 mL di buffer AFM alla camera con 10 mM CaCl2 e 5 mM di acido ascorbico.
    2. Scegliere la punta D della sonda AFM funzionalizzata per l'esperimento. Utilizzare il teorema dell'equipartizione per calibrare il cantilever nel buffer AFM con un valore costante di molla preciso (k) prima di ogni esperimento.
    3. Fissare la punta a sbalzo sulla superficie del campione per formare la coppia Cohesin/Dockerin.
    4. Ritirare lo sbalzo a una velocità costante di 400 nm-s1 dalla superficie. Nel frattempo, registrare la curva di estensione della forza ad una frequenza di campionamento di 4000 Hz.
  2. Analisi dei dati
    1. Utilizzare l'elaborazione dati JPK per selezionare le tracce dell'estensione forzata.
    2. Utilizzare il software per analizzare le tracce. Adattare le curve con il modello a catena a verme (WLC) di elasticità polimerica e ottenere la forza di spiegatura e l'incremento della lunghezza del contorno per il picco di dispiegamento delle singole proteine.
    3. Montare gli istogrammi delle forze di spiegatura con il modello gaussiano per ottenere i valori più probabili della forza di spiegatura (u>) e dell'incremento della lunghezza del contorno ().

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Representative Results

I residui NGL introdotti tra le proteine adiacenti dalla legatura OaAEP1 non influiscono sulla stabilità del momomero proteico nel polimero poiché la forza di dispiegamento (u>) e l'incremento della lunghezza del contorno (c>) sono paragonabili allo studio precedente (Figura 1). Il risultato della purificazione della proteina rubredossina è mostrato nella Figura 2. Per dimostrare la proteina dopo che la scissione TEV è compatibile con la seguente legatura OaAEP1 per costruire polimeri proteici con una sequenza di controllo e la costruzione è ad alta efficienza, Figura 3 fornisce un'immagine SDS-PAGE come riferimento. I passaggi della preparazione a sbalzo funzionale e coverslip sono descritti nella Figura 4. La biosintesi ezimatica graduale e l'immobilizzazione della poliproteina sul coperchio sono mostrate nella Figura 5. Utilizzare questo protocollo, un polimero proteico con la sequenza controllata può essere costruito e adatto per esperimenti SMFS basati su AFM.

Figure 1
Figura 1: Misurazioni SMFS basate su AFM di poliproteina costruite da OaAEP1. (A) Le tipiche curve di estensione della forza a dente di sega di Ub (curva 1 in blu) sono state mostrate con l'attesi , l'lc di 23 nm. (B) Il grafico a dispersione presenta la relazione tra la forza di spiegatura di Ub (202 x 44 pN, media , s.d., n , n , 198) e l'indice (23 x 2 nm, media - s.d.). Questa cifra è stata modificata da Ref.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Gli spettri di assorbimento UV-Vis di GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL e GL-GB1-(N)-Rd-NGL. Il Fe(III)-forma Rd (spettro sinistro, colorato in marrone, codice PDB:1BRF) ha presentato i tipici picchi di assorbimento UV-Vis a 495 nm e 579 nm, mentre la forma n non (spettro destro, colorato nel vino, codice PDB: 1IRN). Questa cifra è stata modificata da Ref.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: SDS-PAGE gel risultati di digestione stepwise e ligazione utilizzando protease TEV e OaAEP1 per costruire il dimero Ub. Lanes 1–4 ha mostrato Coh-tev-L-Ub, la miscela proteica risultante di scissione TEV, pura proteasi sfGFP-TEV e prodotto purificato (GL-Ub). Lanes 5-7 ha mostrato la miscela di ligazione cleaved GL-Ub e Coh-tev-L-Ub-NGL con (Lane 5) o senza (Lane 6) OaAEP1 e puro OaAEP1. Questa cifra è stata modificata da Ref.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: grafico di processo che descrive ogni passo per la funzionalità del vetro coprele labbra e sbalzo. Dopo la pulizia e l'attivazione da acido cromatico, coverslip e cantilever condividono un processo di funzionalizzazione simile, tranne l'ultimo passo in cui GL-ELP50nm-C coppie con coverslip mentre C-ELP50nm-NGL coppie con cantilever. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Grafico di processo che descrive ogni passo per l'immobilizzazione della poliproteina sulla superficie. Il diagramma di flusso del processo in alto a sinistra mostra la costruzione graduale di poliproteina con sequenze controllate sul coverslip. Il diagramma in alto a destra mostra la preparazione del sbalzo funzionalizzato utilizzato nelle misurazioni AFM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Tracce tipiche di spiegatura dei polimeri proteici con una sequenza controllata razionalmente da SMFS basato su AFM. (A) Le tipiche curve di estensione della forza a dente di sega di Ub - presentanol'l c di 23 nm come previsto. (B) Le tipiche curve di estensione della forza di Rd presentavano il valorec di 13 nm come previsto. (C) Tipica combinazione di estensione della forza di (Ub-Rd)n miscela proteica in cui il picco blu significa gli eventi di dispiegarsi di Ub mentre il rosso significa Rd. Questa cifra è stata modificata da Ref.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Supplementare Figura 1: Risultati del gel SDS-PAGE dell'efficienza della legatura proteica in rapporto diverso tra due reagenti. L'efficienza di legatura era del 20% quando il rapporto è 1 a 1 e ha raggiunto il 75% al rapporto tra 10 e 1. Questa cifra è stata modificata da Ref.8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per la biosintesi e l'immobilizzazione eimmobilistica della poliproteina e verificato la progettazione della poliproteina da parte di SMFS basato su AFM. Questa metodologia fornisce un nuovo approccio alla costruzione del polimero proteico in una sequenza progettata, che integra i metodi precedenti per l'ingegneria poliproteina e l'immobilizzazione4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

Rispetto alla classica metodologia del DNA ricombinante per la costruzione poliproteina7,62, il nostro metodo si basa sulla legatura tra piccoli monomeri proteici. Così, permette l'espressione di molecole proteiche di grandi dimensioni o tossiche per la costruzione di poliproteine. Inoltre, permette la purificazione del monomero proteico prima della coniugazione.

Rispetto al metodo bi-cisteina ampiamente utilizzato che forma un legame disulfide intermolecolare per la polimerizzazione delle proteine4, il nostro metodo ezimatico che utilizza sia OaAEP1 che TEV proteae si traduce in una poliproteina con una sequenza relativamente controllata e una geometria di connessione definita. E non usa cisteina, che è un residuo funzionale essenziale per molte proteine.

Il nostro metodo è per lo più simile alla coniugazione proteica a base di specie59. La caratteristica unica del nostro metodo è che la legatura proteica a base di OaAEP1 è molto più efficiente, quindi permette la costruzione di pentameri proteici con una resa ragionevole10,53. Ha anche bisogno di meno residui per la legatura e si traduce in un più breve linker NGL a tre residui. Di conseguenza, non mostra alcun "effetto linker" in quanto il linker NGL appena formato non influisce sulla stabilità del singolo monomero proteico o induce alcuna interazione proteina-proteina innaturale. Tuttavia, riteniamo che tutti i metodi abbiano i loro vantaggi e svantaggi. Ad esempio, il classico metodo del DNA ricombinante non aggiunge alcun residuo tra il monomero proteico e non richiede l'uso di alcun enzima per la legatura. E il metodo bicisteina è semplice e facile per la polimerizzazione delle proteine. Pertanto, tutti possono essere utili in base a diversi requisiti sperimentali.

Per la nostra costruzione graduale della poliproteina, è fondamentale rimuovere completamente la proteina non reazioneta. Prendere abbastanza volume di buffer AFM e abbastanza tempo per pulire la superficie retato con attenzione. In caso contrario, la proteina residua o proteasi influenzerà ulteriori reazioni di sintesi.

L'efficienza della legatura OaAEP1 è un limite critico al nostro metodo in quanto l'efficienza di scissione TEV è quasi completa (96%). È fondamentale aumentare il rapporto tra i due reagenti, GL-protein, e proteina-NGL, per migliorare l'efficienza della legatura. Il nostro studio mostra che quando le proteine-NGL sono decuplicate rispetto alla proteina GL, l'efficienza aumenta dal 20% (il rapporto è da 1 a 1) al 75%(Figura supplementare 1). È fondamentale consumare il reattore, che è stato immobilizzato sulla superficie in quanto il reattore libero può essere allontanato lavando con buffer. Inoltre, se il capolinea N o C è esposto alla soluzione è anche un fattore cruciale per la legatura. Si tratta di un approccio facoltativo per esporre il terminale aggiungendo un linker contenente il sito riconosciuto al rispettivo terminale.

Alla fine, il nostro protocollo è un modo enzimatico di coniugare proteine in una sequenza progettata. Fornisce inoltre un approccio alternativo ai campioni di proteine di coppia e immobilizzazione in studi a singola molecola.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. BK20160639) e il programma Shuangchuang della provincia di Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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References

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Biochimica Numero 156 spettroscopia di forza a singola molecola bioconiugazione immobilizzazione delle proteine spettroscopia della forza atomica OaAEP1 ingegneria delle proteine
Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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