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Biochemistry

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Abstract

Las técnicas químicas y de bioconjugación se han desarrollado rápidamente en los últimos años y permiten la construcción de polímeros proteicos. Sin embargo, un proceso controlado de polimerización de proteínas siempre es un desafío. Aquí, hemos desarrollado una metodología enzimática para la construcción de proteínapolis polimerizadas paso a paso en una secuencia racionalmente controlada. En este método, el C-terminus de un monómero proteico es NGL para la conjugación de proteínas utilizando OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mientras que el N-terminus era un teV escleable (virus de grabado de tabaco) sitio más una L (ENLYFQ/GL) para la protección temporal N-terminal. En consecuencia, OaAEP1 fue capaz de añadir sólo un monómero proteico a la vez, y luego la proteasa TEV cortó el N-terminus entre Q y G para exponer el NH2-Gly-Leu. Entonces la unidad está lista para la próxima ligadura OaAEP1. La poliproteína de ingeniería se examina mediante el desarrollo de un dominio de proteína individual utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SMFS). Por lo tanto, este estudio proporciona una estrategia útil para la ingeniería de poliproteínas y la inmovilización.

Introduction

En comparación con los polímeros sintéticos, las proteínas naturales multidominio tienen una estructura uniforme con un número bien controlado y tipo de subdominios1. Esta característica generalmente conduce a una mejor función biológica y estabilidad2,3. Se han desarrollado muchos enfoques, como el acoplamiento de enlace de disulfuro a base de cisteína y la tecnología de ADN recombinante, para la construcción de una proteína polimerizada de este tipo con múltiples dominios4,5,6,7. Sin embargo, el método primero siempre resulta en una secuencia aleatoria e incontrolada, y el segundo conduce a otros problemas, incluyendo la dificultad para la sobreexpresión de proteínas tóxicas y de gran tamaño y la purificación de proteínas complejas con cofactor y otras enzimas delicadas.

Para hacer frente a este reto, desarrollamos un método enzimático que conjuga el monómero proteico para polímero/poliproteína de manera escalonada utilizando una ligasa proteica OaAEP1 combinada con una proteasa TEV8,9. OaAEP1 es una endopeptidasa estricta y eficiente. Dos proteínas pueden vincularse covalentemente como secuencia Asn-Gly-Leu (NGL) a través de dos termini por OaAEP1 en menos de 30 min si el N-terminus es residuos de Gly-Leu (GL) y el otro de los cuales el C-terminus es residuos de NGL10. Sin embargo, el uso de OaAEP1 sólo para vincular monómero de proteína conduce a un polímero proteico con una secuencia incontrolada como el método de acoplamiento basado en cisteína. Por lo tanto, diseñamos el N-terminus de la unidad de proteína con un sitio de proteasa TEV extraíble más un residuo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes de la escisión TEV, el N-terminal no participaría en la ligadura OaAEP1. Y luego los residuos de GL en N-terminus, que son compatibles con la ligadura OaAEP1 adicional, se expone después de la escisión TEV. Así, hemos logrado un método secuencial de biosíntesis enzimática de poliproteína con una secuencia relativamente bien controlada.

Aquí, nuestro método de síntesis enzimática escalonada se puede utilizar en la preparación de muestras de poliproteínas, incluyendo controlado por secuencia e incontrolado, e inmovilización de proteínas para estudios de una sola molécula, especialmente para el sistema complejo como metaloproteína.

Además, los experimentos SMFS basados en AFM nos permiten confirmar la construcción y estabilidad de polímeros proteicos a nivel de una sola molécula. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula, incluyendo AFM, pinza óptica y pinza magnética, es una herramienta general en nanotecnología para manipular la biomolécula mecánicamente y medir su estabilidad11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. El AFM monomolécula ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la proteína (un)folding21,22,23,24,25, la medición de la fuerza de la interacción receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, enlace químico inorgánico20,36,37,38,39,40,41,42,43 y el enlace metal-ligand en metalloproteína44,45,46,47,48,49,50 . Aquí, El AFM de una sola molécula se utiliza para verificar la secuencia de poliproteína sintetizada basada en la señal de despliegue de proteínas correspondiente.

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Protocol

1. Producción de proteínas

  1. Clon genético
    1. Comprar genes que codifican para la proteína de interés (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, el módulo de unión a la celulosa (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) y cohesión de Ruminococcus flavefaciencia, virus de la fjma ción tabaco (TEV) proteasa, polipéptidos similares a la elastina (ELP).
    2. Realizar la reacción en cadena de la polimerasa y utilizar el sistema enzimático de digestión de tres restricciones BamHI-BglII-KpnI para recombinar el gen de diferentes fragmentos de proteína.
    3. Confirme todos los genes mediante la secuenciación directa del ADN.
  2. Expresión y producción de proteínas
    1. Transforme E. coli BL21(DE3) con el plásmido pQE80L-POI o pET28a-POI para expresión.
    2. Escoja una sola colonia en 15 ml de medio de LB con los antibióticos respectivos (p. ej., sal sódica de ampicilina de 100 g/ml o 50 g/ml, kanamicina). Seguir agitando los cultivos a 200 rpm a 37oC durante 16-20 h.
    3. Diluir los cultivos nocturnos en 800 ml de medio LB (dilución 1:50). Para la rubredoxina, centrifugar el cultivo a 1.800 x g, a continuación, resuspender en 15 mL de medio M9 (complementado con 0,4% glucosa, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4), y luego diluirlo en 800 ml de medio M9.
    4. Incubar el cultivo a 37oC mientras se agita a 200 rpm, hasta que el cultivo alcanza una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,6. Ahorre una muestra de 100 l del cultivo como control previo a la inducción para probar la expresión de proteínas.
    5. Inducir la expresión proteica añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM y agitar el cultivo a 37 oC durante 4 h a 200 rpm. Reserve una muestra de 100 l del cultivo como control posterior a la inducción para probar la expresión de proteínas.
    6. Centrifugar el cultivo a 13.000 x g durante 25 min a 4oC y almacenara a -80oC antes de la purificación.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  3. Purificación de proteínas de interés
    1. Resuspenda las células en 25 ml de tampón de lisis (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 que contiene DNase, RNase, PMSF) y utilice un sonicador (15% de amplitud) para aislarlo durante 30 minutos en hielo.
    2. Aclare el lisado celular a 19.000 x g durante 40 min a 4 oC.
    3. Empaquete 1 ml (volumen de cama) de la columna de afinidad Co-NTA o Ni-NTA y lave la columna con 10 volúmenes de columna (CV) de agua ultrapura y luego 10 CV de tampón de lavado (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM imidazol, pH 7.4) por flujo de gravedad.
    4. Pasar el sobrenadante proteico a través de la columna por flujo de gravedad por tres veces.
    5. Vierta el tampón de lavado en la columna con 50 CV para alejar las proteínas contaminantes.
    6. Elule la proteína enlazada con 3 CV de tampón de elución helada (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM de imidazol, pH 7.4). Cuando se trata de proteínas de rubredoxina, es necesario una mayor purificación del intercambio de aniones utilizando la columna de intercambio de aniones a pH 8,5 a 4 oC.
    7. Analice la muestra por SDS-PAGE.

2. Funcionalización de la superficie de la cubierta y del voladizo

  1. Preparación funcional de la superficie de cubreobjetos
    1. Disolver 20 g de cromado de potasio en 40 ml de agua ultrapura. Añadir lentamente 360 ml de ácido sulfúrico concentrado a la solución de cromato de potasio con varilla de vidrio agitar suavemente y preparar el ácido cromático.
      ADVERTENCIA: El producto químico utilizado aquí y el ácido cromático final es fuertemente corrosivo y ácido. Trabaje con el equipo de protección adecuado. La solución libera calor cuando se añade ácido sulfúrico concentrado, lo que significa una adición lenta y una pausa adecuada para enfriar.
    2. Limpie y active un cubrecristales a 80oC durante 30 min mediante tratamiento con ácido cromático. Sumerja completamente los cubreobjetos en una solución de tolueno APTES al 1% (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente mientras los protege de la luz.
    3. Lave el cubreobjetos con tolueno y alcohol etílico absoluto y seque el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno.
    4. Incubar el cubreobjetos a 80 oC durante 15 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.
    5. Añadir 200 l de sulfo-SMCC (1 mg/ml) en solución de dimetilsulfóxido (DMSO) entre dos cubreobjetos inmovilizados e incubar durante 1 h protegido de la luz.
    6. Lavar primero el cubreobjetos con DMSO y luego con alcohol etílico absoluto para eliminar el sulfo-SMCC residual.
    7. Seque el cubreobjetos bajo una corriente de nitrógeno.
    8. Pipet 60 l de 200 m GL-ELP50nm-C solución de proteína en una cubierta funcionalizada e incubar durante aproximadamente 3 h.
    9. Lave el cubreobjetos con agua ultrapura para eliminar el GL-ELP50nm-C no reaccionado.
      NOTA: Los cubreobjetos funcionalizados son capaces durante unas dos semanas bajo almacenamiento a 4 oC.
  2. Preparación funcional de la superficie en voladizo
    1. Limpie los voladizos a 80 oC durante 10 min mediante el tratamiento con ácido cromático.
    2. Funcionalice el voladizo por aminosilanización con 1% (v/v) solución de tolueno APTES y luego hornee el voladizo a 80 oC durante 15 minutos antes de conjugar con sulfo-SMCC.
    3. Vincular el C-ELP50nm-NGL a la superficie con el grupo de maleimida de sulfo-SMCC durante 1,5 h.
    4. Lavar el C-ELP50nm -NGLno reaccionado en la cubierta con agua ultrapura.
    5. Sumergir un voladizo funcionalizado en 200 ml de una solución proteica GL-CBM-XDoc de 50 m que contenga 200 nM de OaAEP1 a 25 oC durante 20-30 min. A continuación, utilice el tampón AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar la proteína no reaccionada.
      NOTA: La química superficial de los voladizos y el cubreobjetos son similares.

3. Preparación escalonada de poliproteínas con secuencias controladas

  1. Vincule la unidad de ligadura Coh-tev-L-POI-NGL al GL-ELP50nm inmovilizado en la superficie de encubrimiento por OaAEP1 durante 30 min.
  2. Utilice 15-20 ml de tampón AFM (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4) para lavar cualquier proteína no reaccionada.
  3. Añadir 100 ml de proteasa TEV (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] glicerol, pH 8.0) para cortar la unidad proteica en el sitio de reconocimiento teV durante 1 h a 25 oC.
  4. Utilice 15-20 ml de tampón AFM para lavar las proteínas residuales.
  5. Vincule la unidad de ligadura Coh-tev-L-POI-NGL al GL-Ub-NGL-Glass de OaAEP1 durante 30 min.
  6. Repita los pasos 3.3 a 3.5 N-1 veces para construir proteína sconstruir GL-(Ub)n-NGL en la superficie de vidrio. Omita la última reacción de escote TEV para reservar la cohesina en el polímero de proteína como Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass.

4. Medición y análisis de datos de AFM Experiment

  1. Mediciones de AFM
    1. Añadir 1 mL de buffer AFM a la cámara con 10 mM de CaCl2 y 5 mM de ácido ascórbico.
    2. Elija la punta D de la sonda AFM funcionalizada para el experimento. Utilice el teorema de equipartición para calibrar el voladizo en el búfer AFM con un valor de constante de resorte preciso (k) antes de cada experimento.
    3. Fije la punta del voladizo a la superficie de muestra para formar el par Cohesin/Dockerin.
    4. Retirar el voladizo a una velocidad constante de 400 nms 1 de la superficie. Mientras tanto, registre la curva de extensión de fuerza a una frecuencia de muestreo de 4000 Hz.
  2. Análisis de datos
    1. Utilice los seguimientos de extensión de fuerza de selección de procesamiento de datos JPK.
    2. Utilice el software para analizar las trazas. Ajuste las curvas con el modelo de cadena similar a un gusano (WLC) de elasticidad de polímero y obtenga un incremento de fuerza de despliegue y longitud de contorno para el pico de desdoblamiento de proteínas individuales.
    3. Ajuste los histogramas de las fuerzas de desdoblamiento con el modelo gaussiano para obtener los valores más probables de fuerza de desdoblamiento (u>) y incremento de longitud de curva de nivel (c>).

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Representative Results

Los residuos NGL introducidos entre proteínas adyacentes por la ligadura OaAEP1 no afectarán a la estabilidad del monómero de proteína en el polímero, ya que la fuerza de despliegue (u>) y el incremento de la longitud del contorno (c>) es comparable con el estudio anterior(Figura 1). El resultado purificador de la proteína rubredoxina se muestra en la Figura 2. Para probar la proteína después de la escisión TEV es compatible con la siguiente ligadura OaAEP1 para construir polímero proteico con una secuencia de control y la construcción es de alta eficiencia, la Figura 3 proporciona una imagen SDS-PAGE como referencia. Los pasos del voladizo funcionalizado y la preparación del cubreobjetos se describen en la Figura 4. La biosíntesis enzimática escalonada y la inmovilización de la poliproteína en el cubreobjetos se muestran en la Figura 5. Utilice este protocolo, un polímero de proteína con la secuencia controlada se puede construir y adecuado para experimentos SMFS basados en AFM.

Figure 1
Figura 1: Mediciones SMFS basadas en AFM de poliproteína construidas por OaAEP1. (A) Se mostraron curvas típicas de extensión de fuerza similares a dientes de sierra de Ub (curva 1 en azul) con la esperada "Lc de 23 nm". (B) La gráfica de dispersión presenta la relación entre la fuerza de despliegue de Ub (202 a 44 pN, media de s.d., n a 198) y la lc (23 x 2 nm, media a s.d.). Esta cifra se ha modificado desde Ref.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los espectros de absorción UV-Vis de GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL y GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. El Fe(III)-form Rd (Espectro izquierdo, coloreado en marrón, código PDB:1BRF) presentó picos típicos de absorción UV-Vis a 495 nm y 579 nm, mientras que la forma Zn no (Espectro derecho, coloreado en vino, código PDB: 1IRN). Esta cifra se ha modificado desde Ref.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: SDS-PAGE gel resultados de digestión escalonada y ligadura utilizando TEV proteasa y OaAEP1 para construir el dimer Ub. Los carriles 1–4 mostraron Coh-tev-L-Ub, la mezcla de proteínas resultante de escisión TEV, proteasa pura sfGFP-TEV y producto purificado (GL-Ub). Los carriles 5–7 mostraban la mezcla de ligadura de gl-Ub y Coh-tev-L-Ub-NGL con (Carril 5) o sin (Carril 6) OaAEP1 y OaAEP1 puro. Esta cifra se ha modificado desde Ref.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Gráfico de proceso que describe cada paso para funcionalizar los cubreobjetos de vidrio y el voladizo. Después de la limpieza y activación por ácido cromático, el envoltoded y el voladizo comparten un proceso de funcionalización similar, excepto el último paso en el que GL-ELP50nm-C parejas con cubreobjetos mientras Que C-ELP50nm-NGL parejas con voladizo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Gráfico de proceso que describe cada paso para la inmovilización de poliproteínas en la superficie. El diagrama de flujo de proceso superior izquierdo muestra la construcción escalonada de poliproteína con secuencias controladas en el cubreobjetos. El diagrama superior derecho muestra la preparación del voladizo funcionalizado utilizado en las mediciones de AFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Seguimientos de despliegue típicos de los polímeros proteicos con una secuencia controlada racionalmente por SMFS basado en AFM. (A) Las típicas curvas de fuerza-extensión similares a dientes de sierra de Ub presentaronel c de 23 nm según lo previsto. (B) Las curvas típicas de la fuerza-extensión de Rd presentadas áLc de 13 nm como se esperaba. (C) Curvas típicas de fuerza-extensión de (Ub-Rd)n mezcla de proteínas en la que el pico azul significa los eventos de desarrollo de Ub mientras que el rojo significa Rd. Esta cifra se ha modificado desde Ref.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura suplementaria 1: SDS-PAGE gel resultados de la eficiencia de la ligadura de proteínas bajo una relación diferente entre dos reactivos. La eficiencia de la ligadura fue del 20% cuando la relación es de 1 a 1 y alcanzó el 75% en la proporción de 10 a 1. Esta cifra se ha modificado desde Ref.8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos descrito un protocolo para la biosíntesis enzimática y la inmovilización de poliproteínas y verificado el diseño de poliproteínas por AFM-basado SMFS. Esta metodología proporciona un enfoque novedoso para construir el polímero de proteína en una secuencia diseñada, que complementa los métodos anteriores para la ingeniería poliproteica y la inmovilización4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61.

En comparación con la metodología clásica de ADN recombinante para la construcción depoliproteínas7,62, nuestro método se basa en la ligadura entre pequeños monómeros proteicos. Por lo tanto, permite la expresión de moléculas de proteína de gran tamaño o tóxicas para la construcción de poliproteínas. Además, permite la purificación del monómero proteico antes de la conjugación.

En comparación con el método de bicisteína ampliamente utilizado que forma unión de disulfuro intermolecular para la polimerización deproteínas 4, nuestro método enzimático utilizando OaAEP1 y texoteasa da como resultado una poliproteína con una secuencia relativamente controlada y geometría de conexión definida. Y no utiliza cisteína, que es un residuo funcional esencial para muchas proteínas.

Nuestro método es en su mayoría similar a la conjugación proteica a base de tipolas59. La característica única de nuestro método es que la ligadura de proteínas a base de OaAEP1 es mucho más eficiente, por lo que permite la construcción de pentamer proteico con un rendimiento razonable10,53. También necesita menos residuos para la ligadura y da como resultado un vinculador NGL de tres residuos más corto. Como resultado, no muestra ningún "efecto vinculador" ya que el vinculador NGL recién formado no afecta a la estabilidad del monómero de proteína individual ni induce ninguna interacción antinatural proteína-proteína. Sin embargo, creemos que todos los métodos tienen sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, el método clásico de ADN recombinante no añade ningún residuo entre el monómero proteico y no requiere el uso de ninguna enzima para la ligadura. Y el método de bicisteína es simple y fácil para la polimerización de proteínas. Por lo tanto, todos ellos pueden ser útiles bajo diferentes requisitos experimentales.

Para nuestra construcción escalonada de poliproteína, es crucial eliminar completamente la proteína no reaccionada. Tome suficiente volumen de búfer AFM y tiempo suficiente para limpiar la superficie reaccionada con cuidado. De lo contrario, la proteína residual o proteasa afectará a otras reacciones de síntesis.

La eficiencia de la ligadura OaAEP1 es un límite crítico para nuestro método, ya que la eficiencia del escote TEV está casi completa (96%). Es fundamental aumentar la relación entre los dos reactivos, GL-proteína, y proteína-NGL, para mejorar la eficiencia de la ligadura. Nuestro estudio muestra que cuando la proteína-NGL es diez veces a la proteína GL, la eficiencia aumenta del 20% (la relación es de 1 a 1) al 75%(Figura Suplementaria 1). Es fundamental consumir el reactivo, que fue inmovilizado en la superficie, ya que el reactivo libre se puede alejar lavando con tampón. Además, si la terminal N o C está expuesta a la solución es también un factor crucial para la ligadura. Es un enfoque opcional para exponer el terminal mediante la adición de un vinculador que contiene el sitio reconocido al terminal respectivo.

Al final, nuestro protocolo es una forma enzimática de conjugar proteínas en una secuencia diseñada. También proporciona un enfoque alternativo a las muestras de proteínas de pareja e inmovilización en estudios de una sola molécula.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) y el Programa Shuangchuang de la provincia de Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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References

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Bioquímica Número 156 espectroscopia de fuerza de una sola molécula bioconjugación inmovilización de proteínas espectroscopia de fuerza atómica OaAEP1 ingeniería de proteínas
Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula
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