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Biochemistry

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

Abstract

Chemische und biokonjugationische Techniken wurden in den letzten Jahren schnell entwickelt und ermöglichen den Aufbau von Proteinpolymeren. Ein kontrollierter Proteinpolymerisationsprozess ist jedoch immer eine Herausforderung. Hier haben wir eine enzymatische Methodik entwickelt, um polymerisiertes Protein Schritt für Schritt in einer rational gesteuerten Sequenz zu konstruieren. Bei dieser Methode ist der C-Terminus eines Proteinmonomers NGL für die Proteinkonjugation mit OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), während der N-Terminus eine skleavable TEV (Tabak-Etch-Virus) Spaltungsstelle plus ein L (ENLYFQ/GL) zum vorübergehenden N-Terminal-Schutz war. Folglich konnte OaAEP1 jeweils nur ein Proteinmonomer hinzufügen, und dann spaltete die TEV-Protease die N-Terminus zwischen Q und G, um den NH2-Gly-Leu freizulegen. Dann ist das Gerät bereit für die nächste OaAEP1 Ligation. Das entwickelte Polyprotein wird durch Die Entfaltung einzelner Proteindomäne mittels atomarer Mikroskopie-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (AFM-SMFS) untersucht. Daher bietet diese Studie eine nützliche Strategie für Die Polyprotein-Engineering und Immobilisierung.

Introduction

Im Vergleich zu synthetischen Polymeren haben natürliche Mehrdomänenproteine eine einheitliche Struktur mit einer gut kontrollierten Anzahl und Art der Subdomains1. Diese Funktion führt in der Regel zu einer verbesserten biologischen Funktion und Stabilität2,3. Viele Ansätze, wie z. B. die Zysulfidbindungskopplung und die rekombinante DNA-Technologie, wurden für den Aufbau eines solchen polymerisierten Proteins mit mehreren Domänen4,5,6,7entwickelt. Die erste Methode führt jedoch immer zu einer zufälligen und unkontrollierten Sequenz, und die zweite führt zu anderen Problemen, einschließlich der Schwierigkeit für die Überexpression toxischer und großformatigen Proteine und der Reinigung komplexer Proteine mit Kofaktor und anderen empfindlichen Enzymen.

Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, entwickeln wir eine enzymatische Methode, die Proteinmonomer für Polymer/Polyprotein schrittweise mit einer Proteinligase OaAEP1 in Kombination mit einem Protease TEV8,9konjugiert. OaAEP1 ist eine strenge und effiziente Endopeptidase. Zwei Proteine können kovalent als Asn-Gly-Leu-Sequenz (NGL) durch zwei Termini von OaAEP1 in weniger als 30 min verbunden werden, wenn der N-Terminus Gly-Leu-Rückstände(GL) und das andere, von dem der C-Terminus NGL-Rückstände10ist. Die Verwendung von OaAEP1 führt jedoch nur zur Verknüpfung von Proteinmonomer zu einem Proteinpolymer mit einer unkontrollierten Sequenz wie der Cystein-basierten Kopplungsmethode. Daher entwerfen wir den N-Terminus der Proteineinheit mit einer abnehmbaren TEV-Protease-Site plus einem Leucin-Rückstand als ENLYFQ/G-L-POI. Vor der TEV-Spaltung würde das N-Terminal nicht an der OaAEP1-Liga teilnehmen. Und dann werden die GL-Rückstände am N-terminus, die mit weiterer OaAEP1-Ligatur kompatibel sind, nach der TEV-Spaltung freigelegt. So haben wir eine sequenzielle enzymatische Biosynthesemethode von Polyprotein mit einer relativ gut kontrollierten Sequenz erreicht.

Hier kann unsere schrittweise enzymatische Synthesemethode in der Polyproteinprobenvorbereitung eingesetzt werden, einschließlich sequenzgesteuerter und unkontrollierter, und Proteinimmobilisierung auch für Einzelmolekül-Studien, insbesondere für das komplexe System wie Metalloprotein.

Darüber hinaus ermöglichen uns AFM-basierte SMFS-Experimente, die Proteinpolymerkonstruktion und -stabilität auf Einzelmolekülebene zu bestätigen. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, einschließlich AFM, optischer Pinzette und magnetischer Pinzette, ist ein allgemeines Werkzeug in der Nanotechnologie, um Biomoleküle mechanisch zu manipulieren und deren Stabilität zu messen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein-Molekül AFM wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Protein (un)folding21,22,23,24,25, die Festigkeitsmessung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische Bindung20,36,37,38,39,40,41,42,43 und Metall-Ligand-Bindung in Metallprotein44,45,46,47,48,49,50 . Hier wird einmolekulares AFM verwendet, um die synthetisierte Polyproteinsequenz auf Basis des entsprechenden Proteinentfaltungssignals zu verifizieren.

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Protocol

1. Proteinproduktion

  1. Genklon
    1. Kaufen Sie Gene, die für das Protein von Interesse (POI) kodieren: Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, das Cellulose-Bindungsmodul (CBM), dockerin-X Domain (XDoc) und Kohäsion aus Ruminococcus flavefacience, Tabak-Etch-Virus (TEV) Protease, Elastin-ähnliche Polypeptide (ELPs).
    2. Führen Sie polymerase-Kettenreaktion durch und verwenden Sie das Drei-Restriktions-Verdauungsenzymsystem BamHI-BglII-KpnI, um das Gen aus verschiedenen Proteinfragmenten zu rekombinieren.
    3. Bestätigen Sie alle Gene durch direkte DNA-Sequenzierung.
  2. Proteinexpression und -produktion
    1. Transformieren Sie E. coli BL21(DE3) mit dem pQE80L-POI oder pET28a-POI Plasmid zur Expression.
    2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie in 15 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika (z. B. 100 g/ml Ampicillin-Natriumsalz oder 50 g/ml Kanamycin). Schütteln Sie die Kulturen bei 200 Umdrehungen von Euro bei 37 °C für 16-20 h.
    3. Verdünnen Sie die Nachtkulturen in 800 ml LB-Medium (1:50 Verdünnung). Zentrifugieren Sie bei Rubredoxin die Kultur bei 1.800 x g, setzen Sie sie dann in 15 ml M9-Medium (ergänzt mit 0,4% Glukose, 0,1 mM CaCl2, 2 mM MgSO4) aus und verdünnen Sie sie dann in 800 ml M9-Medium.
    4. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C, während sie bei 200 Umdrehungen von mir schüttelt, bis die Kultur eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,6 erreicht. Speichern Sie 100 l Probe der Kultur als Vorinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.
    5. Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM und schütteln Sie die Kultur bei 37 °C für 4 h bei 200 Rprossen. Reservieren Sie eine 100-L-Probe der Kultur als Nachinduktionskontrolle für die Prüfung der Proteinexpression.
    6. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 13.000 x g für 25 min bei 4 °C und lagern Sie bei -80 °C vor der Reinigung.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
  3. Reinigung von Proteinvon Interesse
    1. Setzen Sie die Zellen in 25 ml Lysepuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4 mit DNase, RNase, PMSF) wieder auf und verwenden Sie einen Beschallungsmittel (15% Amplitude), um sie 30 min auf Eis zu lysieren.
    2. Das Zelllysat bei 19.000 x g 40 min bei 4 °C klären.
    3. 1 ml (Bettvolumen) co-NTA oder Ni-NTA Affinitätssäule packen und die Säule mit 10 Säulenvolumina (CV) Reinstwasser und dann 10 CVs Waschpuffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM Imidazol, pH 7,4) durch Schwerkraftfluss waschen.
    4. Passieren Sie das Protein-Übertät durch die Säule durch Schwerkraftfluss für dreimal.
    5. Gießen Sie den Waschpuffer auf die Säule mit 50 Lebensläufen, um Schadstoffproteine wegzubewegen.
    6. Das gebundene Protein mit 3 Lebensläufen eiskalter Elutionspuffer (20 mM Tris, 400 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,4) zu verleuchten. Bei Rubredoxin-Proteinen ist eine weitere Anionenaustauschreinigung mittels Anionenaustauschsäule bei pH 8,5 bei 4 °C erforderlich.
    7. Analysieren Sie das Beispiel nach SDS-PAGE.

2. Funktionalisierung der Deck- und Auslegeroberfläche

  1. Funktionalisierte Deckslip-Oberflächenvorbereitung
    1. 20 g Kaliumchromat in 40 ml Reinstwasser auflösen. 360 ml konzentrierte Schwefelsäure mit Glasstab langsam umrühren und die Chromsäure zuzubereiten, 360 ml konzentrierte Schwefelsäure langsam zugeben.
      VORSICHT: Die hier verwendete Chemikalie und die endgültige Chromsäure ist stark korrosiv und sauer. Arbeiten Sie mit der richtigen Schutzausrüstung. Die Lösung gibt Wärme ab, wenn konzentrierte Schwefelsäure hinzugefügt wird, was bedeutet, dass das Hinzufügen und die richtige Pause zum Abkühlen langsam ist.
    2. Reinigen und aktivieren Sie einen Glasdeckel bei 80 °C für 30 min durch Chromsäurebehandlung. Tauchen Sie die Abdeckungen vollständig in 1% (v/v) APTES Toluenlösung für 1 h bei Raumtemperatur ein und schützen Sie sie vor Licht.
    3. Den Deckelrutsch mit Toluin und absolutem Ethylalkohol waschen und den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom trocknen.
    4. Den Deckelrutsch bei 80 °C 15 min inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen.
    5. Fügen Sie 200 l Sulfo-SMCC (1 mg/ml) in Dimethylsulfoxid (DMSO)-Lösung zwischen zwei immobilisierten Abdeckungen und Inkubation für 1 h vor Licht geschützt.
    6. Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit DMSO und dann mit absolutem Ethylalkohol, um Restsulfo-SMCC zu entfernen.
    7. Trocknen Sie den Deckelunterstrich unter einem Stickstoffstrom.
    8. Pipetten Sie 60 l von 200 'M GL-ELP50nm-C Proteinlösung auf einen funktionalisierten Deckelschlupf und inkubieren für ca. 3 h.
    9. Waschen Sie den Deckelrutsch mit reinstem Wasser, um den unreagierten GL-ELP50nm-C zu entfernen.
      HINWEIS: Funktionalisierte Abdeckungen sind für etwa zwei Wochen unter Lagerung bei 4 °C in der Lage.
  2. Funktionalisierte Freischwinger-Oberflächenvorbereitung
    1. Reinigen Sie die Ausleger bei 80 °C für 10 min durch Chromsäurebehandlung.
    2. Funktionalisieren Sie den Ausleger durch Amino-Silanisierung mit 1% (v/v) APTES Tolululuonlösung und backen Sie den Ausleger dann 15 min bei 80 °C, bevor er zu Sulfo-SMCC konjugiert wird.
    3. Verknüpfen Sie den C-ELP50nm-NGL mit der Oberfläche mit der Maleimidgruppe von Sulfo-SMCC für 1,5 h.
    4. Waschen Sie den unreagierten C-ELP50nm-NGL auf dem Deckelrutsch durch Reinstwasser weg.
    5. Tauchen Sie einen funktionalisierten Ausleger in 200 L mit 50 M GL-CBM-XDoc-Proteinlösung ein, die 200 nM OaAEP1 bei 25 °C für 20-30 min enthält. Dann verwenden Sie AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagiertes Protein wegzuwaschen.
      HINWEIS: Die Oberflächenchemie der Ausleger und der Deckslip sind ähnlich.

3. Schrittweise Polyproteinzubereitung mit kontrollierten Sequenzen

  1. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL mit dem GL-ELP50nm, der von OaAEP1 30 min auf der Deckbedeckungsfläche immobilisiert ist.
  2. Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer (100 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4), um unreagierte Proteine wegzuwaschen.
  3. Fügen Sie 100 l TEV-Protease (0,5 mM EDTA, 75 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl 10% [v/v] Glycerin, pH 8,0) hinzu, um die Proteineinheit an der TEV-Erkennungsstelle für 1 h bei 25 °C zu spalten.
  4. Verwenden Sie 15-20 ml AFM-Puffer, um Restproteine wegzuwaschen.
  5. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit Coh-tev-L-POI-NGL 30 min mit dem GL-Ub-NGL-Glass von OaAEP1.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 3,3 bis 3,5 N-1 mal, um das Proteinkonstrukt GL-(Ub)n-NGL auf der Glasoberfläche zu bauen. Lassen Sie die letzte TEV-Spaltungsreaktion aus, um Kohesin auf dem Proteinpolymer als Coh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glass zu reservieren.

4. AFM Experimentmessung und Datenanalyse

  1. AFM-Messungen
    1. 1 ml AFM-Puffer mit 10 mM CaCl2 und 5 mM Ascorbinsäure in die Kammer geben.
    2. Wählen Sie die D-Spitze der funktionalisierten AFM-Sonde für das Experiment aus. Verwenden Sie den Equipartitionssatz, um den Ausleger im AFM-Puffer vor jedem Experiment mit einem genauen Federkonstantenwert (k) zu kalibrieren.
    3. Befestigen Sie die Auslegerspitze an der Probenoberfläche, um das Paar Cohesin/Dockerin zu bilden.
    4. Ziehen Sie den Ausleger mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 nmvon der Oberfläche ein. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit die Kraftverlängerungskurve mit einer Abtastrate von 4000 Hz auf.
  2. Datenanalyse
    1. Verwenden Sie JPK-Datenverarbeitung select force-extension traces.
    2. Verwenden Sie Software, um die Ablaufverfolgungen zu analysieren. Passen Sie die Kurven mit dem Wurm-like-Chain (WLC) Modell der Polymerelastizität an und erhalten Sie Entfaltungskraft und Konturlängeninkremente für einzelne Protein-Entfaltungsspitzen.
    3. Passen Sie die Histogramme der sich entfaltenden Kräfte mit dem Gaußschen Modell an, um die wahrscheinlichsten Werte der Entfaltungskraft (u>) und des Konturlängeninkrements (<-Lc>) zu erhalten.

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Representative Results

Die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht werden, haben keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, da die Entfaltungskraft (u>) und das Konturlängeninkrement (<-Lc>) mit der vorherigen Studie vergleichbar ist (Abbildung 1). Das Reinigungsergebnis des Rubredoxin-Proteins ist in Abbildung 2dargestellt. Um das Protein nach der TEV-Spaltung zu beweisen, ist es kompatibel mit der folgenden OaAEP1-Ligation, um Proteinpolymere mit einer Regelsequenz zu konstruieren und die Konstruktion ist hocheffizient, Abbildung 3 liefert ein SDS-PAGE-Bild als Referenz. Die Schritte der funktionalisierten Ausleger- und Deckslippräparation sind in Abbildung 4beschrieben. Die schrittweise enzymatische Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein auf dem Deckblatt sind in Abbildung 5dargestellt. Verwenden Sie dieses Protokoll, ein Proteinpolymer mit der kontrollierten Sequenz kann gebaut werden und eignet sich für AFM-basierte SMFS-Experimente.

Figure 1
Abbildung 1: AFM-basierte SMFS-Messungen von Polyprotein aus OaAEP1. (A) Typische sägezahnartige Kraftverlängerungskurven von Ub (Kurve 1 in blau) wurden mit einem erwarteten Lc von 23 nm angezeigt. (B) Das Streudiagramm stellt die Beziehung zwischen der Ub-Entfaltungskraft (202 x 44 pN, Durchschnitt s.d., n = 198) und dem Lc (23 x 2 nm, Durchschnittliche s.d.) dar. Diese Zahl wurde von Ref.8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die UV-Vis-Absorptionsspektren von GL-GB1-Fe(III)-Rd-NGL und GL-GB1-(Zn)-Rd-NGL. Die Fe(III)-Form Rd (linkes Spektrum, braun gefärbt, PDB-Code:1BRF) präsentierte typische UV-Vis-Absorptionsspitzen bei 495 nm und 579 nm, während die Zn-Form nicht (rechtes Spektrum, in Wein gefärbt, PDB-Code: 1IRN). Diese Zahl wurde von Ref.8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: SDS-PAGE Gel-Ergebnisse der schrittweisen Verdauung und Ligation mit TEV-Protease und OaAEP1, um den Ub Dimer zu bauen. Lanes 1–4 zeigte Coh-tev-L-Ub, die Ergebnisproteinmischung aus TEV-Spaltung, reinemgfP-TEV-Protease und gereinigtem Produkt (GL-Ub). Lanes 5–7 zeigte die geklammerte GL-Ub und Coh-tev-L-Ub-NGL Ligation Mischung mit (Lane 5) oder ohne (Lane 6) OaAEP1 und reinen OaAEP1. Diese Zahl wurde von Ref.8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Prozessdiagramm, das jeden Schritt zum Funktionalisieren von Glasabdeckungen und Auslegern beschreibt. Nach der Reinigung und Aktivierung durch Chromsäure teilen sich Coverslip und Ausleger einen ähnlichen Funktionalisierungsprozess, mit Ausnahme des letzten Schritts, in dem GL-ELP50nm-C-Paare mit Deckelschlupf paaren, während C-ELP50nm-NGL mit Ausleger paart. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Prozessdiagramm, das jeden Schritt für die Polyproteinimmobilisierung auf der Oberfläche beschreibt. Oben links zeigt das schrittweise Aufbau von Polyprotein mit kontrollierten Sequenzen auf dem Coverslip. Das obere rechte Diagramm zeigt die Vorbereitung des funktionalisierten Auslegers, der bei den AFM-Messungen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Typische Entfaltungsspuren der Proteinpolymere mit einer rational gesteuerten Sequenz durch AFM-basierte SMFS. (A) Typische sägezahnartige Kraftverlängerungskurven von Ub präsentierten wie erwartet 23 nm .Lc. (B) Typische Kraftverlängerungskurven von Rd präsentierten wie erwartet 13 nm -Lc von 13 nm. (C) Typische Kraftverlängerungskurven von (Ub-Rd)n Proteinmischung, in der die blaue Spitze die sich entfaltenden Ereignisse von Ub bedeutet, während das Rot Rd bedeutet. Diese Zahl wurde von Ref.8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Ergänzende Abbildung 1: SDS-PAGE Gelergebnisse der Proteinligationseffizienz im unterschiedlichen Verhältnis zwischen zwei Reaktanten. Der Ligationswirkungsgrad betrug 20 %, wenn das Verhältnis 1 zu 1 ist, und erreichte 75 % im Verhältnis von 10 zu 1. Diese Zahl wurde von Ref.8 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir haben ein Protokoll zur enzymatischen Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein beschrieben und das Polyproteindesign durch AFM-basierte SMFS verifiziert. Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für den Aufbau des Protein-Polymers in einer entworfenen Sequenz, die frühere Methoden für Polyprotein-Engineering und Immobilisierung4,6,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61ergänzt.

Im Vergleich zur klassischen rekombinanten DNA-Methodik für die Polyproteinkonstruktion7,62basiert unsere Methode auf der Ligation zwischen kleinen Proteinmonomeren. So ermöglicht es die Expression von großformatigen oder toxischen Proteinmolekülen für die Polyproteinkonstruktion. Zusätzlich ermöglicht es die Reinigung des Proteinmonomers vor der Konjugation.

Im Vergleich zur weit verbreiteten Bi-Cystein-Methode zur Form der intermolekularen Disulfidbindung zur Proteinpolymerisation4ergibt unsere enzymatische Methode, die sowohl OaAEP1 als auch TEV-Protease verwendet, zu einem Polyprotein mit einer relativ kontrollierten Sequenz und definierter Verbindungsgeometrie. Und es verwendet kein Cystein, das ein wesentlicher funktioneller Rückstand für viele Proteine ist.

Unsere Methode ähnelt meist der sortasebasierten Proteinkonjugation59. Das Einzigartige an unserer Methode ist, dass die OaAEP1-basierte Proteinligation viel effizienter ist, so dass der Bau von Protein-Pentamer mit einem vernünftigen Ertrag10,53ermöglicht. Es benötigt auch weniger Rückstände für Ligation und führt zu einem kürzeren Drei-Rückstände NGL-Linker. Infolgedessen zeigt es keinen "Linker-Effekt", da der neu gebildete NGL-Linker die Stabilität des einzelnen Proteinmonomers nicht beeinträchtigt oder eine unnatürliche Protein-Protein-Wechselwirkung induziert. Dennoch glauben wir, dass alle Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Zum Beispiel fügt die klassische rekombinante DNA-Methode keine Rückstände zwischen Proteinmonomer hinzu und erfordert nicht die Verwendung eines Enzyms für die Ligation. Und die Bi-Cystein-Methode ist einfach und einfach für die Proteinpolymerisation. Daher können sie alle unter unterschiedlichen experimentellen Anforderungen nützlich sein.

Für unsere schrittweise Konstruktion von Polyprotein ist es entscheidend, das unreagierte Protein vollständig zu entfernen. Nehmen Sie genügend Volumen des AFM-Puffers und genügend Zeit, um die reaktionsmittelige Oberfläche sorgfältig zu reinigen. Andernfalls wirkt sich das Restprotein oder die Protease auf weitere Synthesereaktionen aus.

Die Effizienz der OaAEP1-Ligation ist eine entscheidende Grenze unserer Methode, da die TEV-Spaltungseffizienz fast vollständig ist (96%). Es ist wichtig, das Verhältnis zwischen den beiden Reaktanten GL-Protein und Protein-NGL zu erhöhen, um die Ligationseffizienz zu verbessern. Unsere Studie zeigt, dass bei einer Verzehnfachung des Protein-NGL-Proteins die Effizienz von 20 % (das Verhältnis 1 bis 1) auf 75 % steigt(Zusatzabbildung 1). Es ist wichtig, den Reaktanten zu konsumieren, der auf die Oberfläche immobilisiert wurde, da der freie Reaktant durch Waschen mit Puffer wegbewegt werden kann. Darüber hinaus ist auch die Frage, ob der N- oder C-Terminus der Lösung ausgesetzt ist, ein entscheidender Faktor für die Ligation. Es ist ein optionaler Ansatz, um das Terminal verfügbar zu machen, indem ein Linker hinzugefügt wird, der die erkannte Site zum jeweiligen Terminal enthält.

Letztendlich ist unser Protokoll eine enzymatische Möglichkeit, Proteine in einer entworfenen Reihenfolge zu konjugieren. Es bietet auch einen alternativen Ansatz, um Proteinproben in Einzelmolekül-Studien zu koppeln und immobilisieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. BK20160639) und Shuangchuang-Programm der Provinz Jiangsu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
iron (III) chloride hexahydrate Energy chemical 99%
Zinc chloride Alfa Aesar 100.00%
calcium chloride hydrate Alfa Aesar 99.9965% crystalline aggregate
L-Ascorbic Acid Sigma Life Science Bio Xtra, ≥99.0%, crystalline
(3-Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich ≥99%
sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate Thermo Scientific 90%
Glycerol Macklin 99%
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) Alfa Aesar
Genes Genscript
Equipment
Nanowizard 4 AFM JPK Germany
MLCT cantilever Bruker Corp
Mono Q 5/50 GL GE Healthcare
AKTA FPLC system GE Healthcare
Glass coverslip Sail Brand
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
Avanti JXN-30 Centrifuge Beckman Coulter
Gel Image System Tanon

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References

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OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie
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Deng, Y., Zheng, B., Liu, Y., Shi, S., Nie, J., Wu, T., Zheng, P. OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (156), e60774, doi:10.3791/60774 (2020).

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