Pflanzenmorphogene können verwendet werden, um die genetische Transformation widerspenstiger Genotypen zu verbessern. Beschrieben wird hier ein Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation (QuickCorn) Protokoll für drei wichtige öffentliche Mais-Inzuchtlinien.
Gezeigt wird hier ein detailliertes Protokoll für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von Mais-Inzuchtlinien mit morphogenen Genen Baby boom (Bbm) und Wuschel2 (Wus2). Bbm wird durch den Maisphospholipid-Transferase-Gen (Pltp) Promotor reguliert, und Wus2 ist unter der Kontrolle eines Mais-Auxin-induzierbaren (Axig1) Promotors. Ein Agrobacterium-Stamm, der diese morphogenen Gene auf Transfer-DNA (T-DNA) und Extrakopien von Agrobacterium-Virulen (vir) trägt, wird verwendet, um maisunreife Embryo-Explanten zu infizieren. Somatische Embryonen bilden sich auf den Scutella infizierter Embryonen und können durch Herbizidresistenz ausgewählt und in Pflanzen gekeimt werden. Ein wärmeaktiviertes Cre/LoxP-Rekombinationssystem, das in das DNA-Konstrukt integriert ist, ermöglicht die Entfernung morphogener Gene aus dem Maisgenom in einem frühen Stadium des Transformationsprozesses. Transformationsfrequenzen von ca. 14%, 4% und 4% (Anzahl unabhängiger transgener Ereignisse pro 100 infizierte Embryonen) können für W22, B73 und Mo17 mit diesem Protokoll erreicht werden.
Die Transformation ist ein grundlegendes Instrument zur Bewertung der Fremdgenexpression in Mais und zur Herstellung genetisch veränderter Maislinien sowohl für Forschungs- als auch für kommerzielle Zwecke. Der Zugang zu einer Transformation mit hohem Durchsatz kann den erhöhten Bedarf an molekularen und zellulären Biologiestudien für Mais erleichtern1. Die Fähigkeit, Pflanzenarten genetisch zu transformieren, ist sowohl für öffentliche als auch für private Laboratorien von entscheidender Bedeutung. Dies ermöglicht sowohl ein grundlegendes Verständnis der Genregulationsmechanismen als auch eine verbesserung der Kulturen auf globaler Ebene, um eine ständig wachsende Bevölkerung zu unterstützen.
Die Entdeckung, dass unreife Embryonen aus Mais zur Herstellung von regenerierbarem Callus verwendet werden könnten, entstand 19752. Seit dieser Enthüllung erforderten die meisten skalierbaren Maistransformationsprotokolle die Bildung und Selektion von Callus vor der Regeneration3. Während des Prozesses der genetischen Transformation werden Agrobacterium-infizierteoder biolistisch-bombardierte unreife Embryonen auf Medien für embryogene Callus-Induktion kultiviert. Induzierte Calli werden dann auf selektiven Medien kultiviert (z.B. mit einem Herbizid), so dass nur transformierte Callusstücke überleben können. Diese herbizidresistenten, vermeintlichen transgenen Calli werden aufgeschüttet und zu Pflanzen regeneriert. Während diese Methode wirksam ist, ist der Prozess lang und arbeitsintensiv, und es kann bis zu 3 Monate dauern, um4abzuschließen. Noch wichtiger ist, dass herkömmliche Maistransformationsprotokolle eine viel größere Begrenzung besitzen, d.h. nur eine begrenzte Anzahl von Maisgenotypen kann5,6transformiert werden.
Lowe et al.7,8 berichtete zuvor über eine “QuickCorn”-Transformationsmethode, die nicht nur die Dauer des Transformationsprozesses stark reduzierte, sondern auch die Liste der transformierbaren Genotypen erweiterte. Die QuickCorn-Methode verwendet Mais-Orthologs (Zm-Bbm und Zm-Wus2) der Arabidopsis-Transkriptionsfaktoren BABY BOOM (BBM)9 und WUSCHEL (WUS)10. Wenn sie in das Transformationsvektorsystem integriert sind, arbeiten diese Gene synergistisch, um das embryogene Wachstum zu stimulieren7.
Das in dieser Arbeit beschriebene QuickCorn-Protokoll basierte auf dem Protokoll in Jones et al11, das eine weitere Verbesserung der von Lowe et al7berichtetenMethodedarstellte, 8. In der vorliegenden Studie wird ein Agrobacterium-Stamm LBA4404(Thy-) verwendet, der ein binäres Vektorkonstrukt PHP81430 (Abbildung 1) und zubehörplasmaPHdes PHP7153912 beherbergt. Die T-DNA von PHP81430 enthält die folgenden molekularen Komponenten. (1) Das transformationsselektive Markergen Hra-Expressionskassette. Das Mais-Hra- (Zm-Hra)-Gen ist ein modifiziertes Acetolactase-Synthase-Synthase-Gen (ALS), das tolerant gegenüber ALS-hemmenden Herbiziden wie Sulfonylharnstoff und Imidazolinonen13,14ist. Das Zm-Hra-Gen wird durch den Sorghum ALS-Promotor8 und den Kartoffelproteinase-Inhibitor II(PinII) Terminator15reguliert. Die T-DNA enthält auch (2) eine Expressionskassette, die das transformationsbildbare Markergen ZsGreenbesitzt. Dieses grüne fluoreszierende Proteingen ZsGreen aus Zoanthus sp. riffkoralle16 wird durch einen Sorghum-Ubiquitin-Promotor/Intron- und Reis-Ubiquitin-Terminator reguliert.
Zusätzlich enthält die T-DNA (3) das morphogene Gen Bbm Expressionskassette. Bbm ist ein Transkriptionsfaktor im Zusammenhang mit der Embryoentwicklung9,17. Bbm wird durch das Maisphospholipid Transferase Protein (Pltp) Promoter8 und Reis T28 Terminator18reguliert. Zm-Pltp ist ein Gen mit starker Expression im Embryo-Scutellar-Epithel, Seidenhaaren und Blattnebenzellen (flankierend in den Wachzellen), geringer Expression in Fortpflanzungsorganen und ohne Expression in den Wurzeln8. Es enthält auch (4) das morphogene Gen Wus2 Expressionskassette. Wus2 ist ein weiterer Transkriptionsfaktor, der mit der Aufrechterhaltung des apikalen Meristes19verbunden ist. Zm-Wus2 steht unter der Kontrolle eines Mais-Auxin-induzierbaren Promotors (Zm-Axig1)20 und Mais In2-1 Terminator21. Schließlich enthält die T-DNA (5) das Cre– LoxP-Rekombinationssystem. Das Cre-Rekombinatoase-Gen22 steht unter der Kontrolle des Mais-Wärmeschockproteins 17.7 (Hsp17.7)23 Promoter und KartoffelpinII Terminator. Zwei loxP-Standorte (in der gleichen Ausrichtung)24 flankieren vier Genexpressionskassetten einschließlich ZsGreen, cre, Bbm und Wus2.
Da das Vorhandensein der morphogenen Gene für die Pflanzenreife und die nachfolgende Nachkommennichten nicht erwünscht ist, wurde das wärmeinduzierte Cre-LoxP-Rekombinationssystem in die T-DNA integriert, um morphogene Gene aus dem Maisgenom zu entfernen, um eine normale Callusregeneration und Pflanzenentwicklung zu ermöglichen. Bei der Wärmebehandlung entfernt die Expression des CRE-Proteins alle Transgene mit Ausnahme des Hra-Selektionsgens. Erfolgreiche Transformanten sollten herbizidresistent, aber ZsGreen-negativsein. Um die Transformationshäufigkeit weiter zu verbessern, enthält der Agrobacterium-Stamm auch ein zusätzliches Zubehörplasmid (PHP71539), das zusätzliche Kopien der Agrobacterium-Virulen (vir) Gene12enthält.
Die QuickCorn-Methode unterscheidet sich von herkömmlichen Maistransformationsprotokollen, da sie während der Transformation keinen Callus-Induktionsschritt beinhaltet. In der ersten Woche nach der Infektion mit Agrobacteriumentwickeln sich auf dem Scutellar-Epithel der infizierten unreifen Embryonen somatische Embryonen. Die Embryonen werden dann auf ein Medium mit Hormonen übertragen, die die Embryoreifung und Triebbildung fördern. Die schnelle Übertragung der somatischen Embryonen auf das Reifungs-/Triebbildungsmedium überspringt das traditionelle Callusstadium, das bisher für die Maisumwandlung verwendet wurde, und ermöglicht die direkte Erzeugung von T0-Pflanzen8. Im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten Maistransformationsmethoden6ist die QuickCorn-Methode schneller, effizienter und weniger genotypabhängig. Mit dieser Methode sind verwurzelte Pflanzen in der Regel bereit, in nur 5-7 Wochen auf den Boden zu übertragen, anstatt die drei oder mehr Monate, die von traditionellen Protokollen erforderlich sind. Der Zweck dieses Artikels besteht darin, eine ausführliche Beschreibung und Demonstration der Methode bereitzustellen, um eine einfachere Replikation in einer Laborumgebung zu ermöglichen, die typischerweise in den meisten akademischen Einrichtungen zu finden ist.
Traditionelle Protokolle für die Maistransformation folgen dem Paradigma der Isolierung unreifer zygotischer Embryonen zur Herstellung von transgenem Kalusgewebe, das zu fruchtbaren Pflanzen regeneriert wird4,6. Während dies wirksam ist, können Callus-basierte Protokolle zeitaufwändig sein, und es dauert oft bis zu 3 Monate, bis der Gewebekulturprozess Pflanzen produziert. Was die hier vorgestellte Methode signifikant macht, ist, dass sie callusfrei, effizient, schnell ist und die Regeneration von T0-Pflanzen in etwa der Hälfte des Zeitrahmens ermöglicht. Es scheint auch weniger genotypabhängig zu sein und kann somit für die meisten öffentlich verfügbaren Inzuchten wirksam sein8,11.
Während alle Schritte effektiv befolgt werden sollten, ist eine korrekte Vorbereitung der Wachstumsmedien unerlässlich. Wachstumsmedienkomponenten müssen in den richtigen Stadien hinzugefügt werden, sowohl vor als auch nach dem Autoklaven, um sicherzustellen, dass das Pflanzenmaterial die richtige Konzentration von Chemikalien erhält. Dadurch wird sichergestellt, dass empfindliche Verbindungen wie Antibiotika nicht abbauen. Es ist auch wichtig, dass Pflanzenmaterial in jeder Phase auf das richtige Wachstumsmedium gelegt wird, wie im Protokoll angegeben. Das Nicht-Aufstellen von Material auf das richtige Wachstumsmedium kann zum materiellen Tod führen. Darüber hinaus sollte vermieden werden, zu viele Embryonen oder die Entwicklung von Geweben auf Platten zu platzieren. Während das Platzieren von doppelt so vielen Gewebestücken die Kosten für Chemikalien und Petrischalen (und sogar inkubatorRaum) sparen kann, kann das Wachstum von Gewebe in überfüllten Platten ernsthaft gehemmt werden. Bei der Durchführung der Infektion sollte sichergestellt werden, dass die optische Dichte der Agrobacterium Suspension angemessen ist. Wenn die bakterielle Suspensionsdichte zu niedrig ist, kann eine richtige Infektion nicht auftreten.
Die Qualität der Ausgangsmaterialien ist entscheidend für den Erfolg von Transformationsprotokollen. Ohren, die für die Embryosektion verwendet werden, müssen gesund sein, was bedeutet, dass die Pflanze, die sie produziert, gesund ist. Sie müssen auch über ein angemessenes Saatgutset verfügen und schädlings- und krankheitsfrei sein. Auch sollte altes Agrobacterium nicht verwendet werden. Die “Mutter”-Platte sollte nicht mehr als 2 Wochen alt sein. Danach sollte eine neue “Mutter”-Platte gestreift werden, um neue Experimente zu beginnen.
Obwohl sich gezeigt hat, dass diese Methode weniger genotypabhängig ist, kann nicht davon ausgegangen werden, dass alle Linien gleichermaßen erfolgreich sein werden. Es kann immer noch Unterschiede zwischen den Linien sowie Unterschiede im Erfolg basierend auf dem verwendeten Konstrukt geben. Ohr-zu-Ohr-Variabilität ist auch bei der Arbeit mit unreifen Embryonen unvermeidbar, daher sollten Experimente idealerweise mehrere Ohren verwenden, um dies zu berücksichtigen. In dieser Arbeit schnitt die inzuchtw22 am besten ab, mit einer Transformationshäufigkeit von über 14 %, gefolgt von B73 und Mo17 (jeweils 4 %). Lowe et al.8 berichteten mit dem QuickCorn-Protokoll für die B73- und Mo17-Transformation. In dieser Arbeit reichten die Transformationsfrequenzen von 9%-50% für B73 und 15%-35% für Mo17.
Eine Möglichkeit für die niedrigeren Transformationsfrequenzen für B73 und Mo17, die in dieser Arbeit beobachtet wurden, kann auf saisonale Ohrqualitätsschwankungen zurückgeführt werden. Ein weiterer Unterschied zwischen dieser Arbeit und der von Lowe et al.8 ist, dass hier verschiedene Vektorkonstrukte verwendet wurden. In Lowes Arbeit wurden morphogene Gene nicht aus den transformierten Pflanzen entfernt, sondern in den späteren Stadien entwicklungsfördernd. In dieser Arbeit wurden die morphogenen Gene 8 Tage nach der Infektion entfernt. Es ist möglich, dass B73 und Mo17 eine längere Präsenz von Bbm/Wus2 für die Entwicklung somatischer Embryonen benötigen.
Mit dieser Methode besteht die Möglichkeit, nicht-transgene Entweichungspflanzen, multimere Einfügungen und nicht verbrauchende Transgene zu erhalten. Diese Pflanzen haben keinen deutlich anderen Phänotyp, daher ist die Detektion durch PCR erforderlich, um festzustellen, ob eine Pflanze transgen ist. Um dies zu erreichen, können PCR-Primer innerhalb der verbraucheten Region und Primer, die die verbrauchsteuernde Region flankieren, verwendet werden. Mehrere unabhängige Transformationen können auch Pflanzen aus demselben unreifen Embryo produzieren, was die Bestimmung einer völlig unabhängigen transformativen Rückgewinnungsrate erschwert. Unser Standard war es, eine Transformationsrate auf der Grundlage der Probenahme einer Pflanze aus jedem unreifen Embryo, der Pflanzen produzierte, zu berechnen und diese durch die Anzahl der infizierten Embryonen zu dividieren. Diese Methode unterschätzt mit ziemlicher Sicherheit die tatsächliche Anzahl unabhängiger Ereignisse, die als Pflanzen zurückgewonnen werden. Die Diskriminierung unabhängiger Ereignisse desselben Embryos erfordert die Sequenzierung von Grenzregionen um Transgene, und dies wird für die meisten Anwendungen unerschwinglich teuer und zeitaufwändig sein; Es kann jedoch Fälle geben, in denen diese Daten nützlich sind.
Diese Methode der Gewebekulturtransformation hat sich als sehr effektiv erwiesen, aber Es können immer noch Probleme auftreten. Wenn Pflanzenmaterial nicht reagiert, ist es möglich, dass es ein Problem mit der jeweiligen Inzuchtlinie gibt, was darauf hindeutet, dass Variablen wie die Zusammensetzung der Wachstumsmedien und der Zeitpunkt der Subkultivierung Anpassungen erfordern. Eine weitere Variable ist das richtige Vektordesign und die genaue Vektorkonstruktion, wenn der ursprüngliche Vektor geändert wird. Es kann auch Probleme mit imazapyr Empfindlichkeit sein, da einige Linien empfindlicher als andere sind, und die Konzentration von Imazapyr muss möglicherweise angepasst werden, um erfolgreich transformierte Pflanzen zu erreichen.
In den letzten 30 Jahren haben sich die Maisgewebekultur und die Transformationsprotokolle verändert und sind vorangekommen; und es wird angenommen, dass dieses verkürzte Protokoll diese Progression weiter vorantreiben wird. Diese Methode ist für akademische Umgebungen wirksam, da sie weniger zeitaufwändig ist als herkömmliche Methoden. Darüber hinaus verlangt sie keine hochqualifizierten Bediener, was eine breitere Verbreitung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht. In Zukunft kann diese Methode mit neuen Technologien wie genome engineering kombiniert werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Corteva Gewächshausteam für die Bereitstellung von Mais unreifen Ohren, dem Corteva Media Prep Lab für die Bereitstellung von Medien, Ning Wang aus Corteva für die Unterstützung beim Agrobacterium-Konstrukt und Keunsub Lee von der Iowa State University für Unterstützung. Dieses Projekt wurde teilweise unterstützt durch das National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 und 1917138 an K.W., durch Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) an J.Z., durch das USDA NIFA Hatch Projekt #IOW04341, durch State of Iowa Fonds und durch Crop Bioengineering Center der Iowa State University.
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |