גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.
הפגינו כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית של תירס שורות מורפולגניות באמצעות גנים מורגניים התינוק בום (bbm) ו Wuschel2 (Wus2). Bbm מוסדר על ידי תירס פוספוליפיד מיזם גנטי (pltp), ו Wus2 הוא תחת השליטה של תירס מinducible (Axig1) מיזם. זן Agrobacterium נושאת אלה גנים מורפולגניים על העברת דנ א (T-DNA) ועותקים נוספים של התקפה ואלימה של agrobacterium (vir) גנים משמשים כדי להדביק תירס העובר בלתי בוגר explants. העוברים הסומטיים מטפסים על הסמשתלה של העוברים הנגועים וניתן לבחור על ידי התנגדות לעשבים ומונבטים לצמחים. המופעל חום מערכת שילוב של loxP מובנה במבנה ה-DNA מאפשר הסרה של גנים מורפולגניים מן הגנום תירס בשלב מוקדם של תהליך השינוי. תדרים שינוי של כ 14%, 4%, ו 4% (מספרים של אירועים הטרנסגניים עצמאית לכל 100 עוברים נגועים) ניתן להשיג עבור W22, B73, ו Mo17, בהתאמה, באמצעות פרוטוקול זה.
טרנספורמציה היא כלי בסיסי להערכת ביטוי גנים זרים תירס וייצור קווי תירס מהונדסים גנטית למטרות מחקר ומסחרי. גישה לשינוי תפוקה גבוהה יכולה להקל על הצורך המוגבר בלימודי הביולוגיה המולקולרית והתאית1. היכולת לשנות את מינים היבול בצורה גנטית היא חיונית למעבדות ציבוריות ופרטיות. זה מאפשר הן הבנה יסודית של מנגנוני רגולציה הגנים, כמו גם שיפור היבול בקנה מידה גלובלי כדי לתמוך באוכלוסיה ההולכת וגוברת.
התגלית כי עוברים בלתי בוגרים מתירס יכול לשמש לייצור של יבלות שלנו מקורו ב 19752. מאז ההתגלות הזאת, מדרגיים ביותר של תירס פרוטוקולים המרה יש צורך היווצרות ובחירה לפני התחדשות3. במהלך תהליך של שינוי גנטי, agrobacteriumאו ביוליסטיק-העוברים הופצץ בלתי בוגרים הם מתורבתים על מדיה עבור embryogenic יבלות האינדוקציה. Çallı המושרה אז הם מתורבתים על מדיה סלקטיבית (למשל, המכיל קוטל הצמחים), כך שרק חתיכות çallı שהפכו מסוגלים לשרוד. הקריאה האנטי-מגנטית העמידים בפני עשבים מולתרים ונוצרות מחדש לצמחים. בעוד שיטה זו יעילה, התהליך ארוך ועתיר עבודה, והוא יכול להימשך שלושה חודשים עד להשלמת4. וחשוב מכך, הפרוטוקולים של שינוי הצורה של תירס קונבנציונאלי הם בעלי מגבלה גדולה הרבה יותר, כלומר, רק מספר מצומצם של הגנוטיפים של תירס יכול להיהפך5,6.
לואו ואח ‘7,8 דיווחו בעבר על שיטת שינוי “quickcorn”, שלא רק הקטינה באופן משמעותי את משך תהליך הטרנספורמציה אלא גם הרחיבה את רשימת הגנוטיפים הטרנספורבית. השיטה של מהירות התירס משתמשת ברישומי תירס (זם-bbm ו -Wus2) של מרכיבי התעתיק של התינוק בום (BBM)9 ורכרוכי (wus)10. כאשר משולבים במערכת וקטור שינוי, גנים אלה לעבוד בסינרגיה כדי לעורר embryogenic צמיחה7.
פרוטוקול quickcorn המתואר בעבודה זו התבסס על הפרוטוקול ב-Jones ואח ‘11, שהיה שיפור נוסף של השיטה שדווחה על-ידי לאו et7,8. במחקר הנוכחי, מאמץ Agrobacterium LBA4404 (שלך-) מחסה מבנה וקטורי בינארי PHP81430 (איור 1) ו-פלבין האביזר PHP7153912 משמשים לטרנספורמציה. T-DNA של PHP81430 מכיל את הרכיבים המולקולריים הבאים. (1) השינוי הסלקטיבי של הקלטת ביטוי של גן הרה . ה“תירס hra ” הוא גן שונה לacetolactase סטנדרטים (als), שהוא מאוד סובלני לקוטלי עשבים שאינם מעכבים כגון סולופולוביאס וסרנוזולונס13,14. הגן של הארה ב מוסדר על ידי היזם דורה ALS8 ו תפוחי אדמה מעכבי פרוטטינואז ii (pinii) שליחות קטלנית15. T-DNA גם מכיל (2) קלטת ביטוי בעל שינוי הצורה מאפשר לסמן גן Zsgreen. זה ירוק חלבון הפלואורסצנטי גן Zsgreen מתוך זוציץ sp. השונית אלמוג16 מוסדר על ידי היזם המקדם של דורה/intron ואורז אוביקוויב שליחות קטלנית.
בנוסף, ה-DNA מכיל (3) את הקלטת ביטוי הגן המורפולגני Bbm . Bbm הוא גורם שעתוק הקשורים להתפתחותהעובר 9,17. Bbm מוסדר על ידי תירס מפוספוליפיד חלבון (pltp) יזם8 ואורז T28 שליחות קטלנית18. זם-Pltp הוא גן עם ביטוי חזק באפיתל העובר, שערות משי, ותאי הבת של העלה (מאגף את תאי המשמר), ביטוי נמוך באברי הרבייה, ואין ביטוי בשורשים8. הוא מכיל גם (4) את הקלטת Wus2 ביטוי הגן מורפולגניים. Wus2 הוא עוד גורם שעתוק הקשורים לתחזוקת מריאגזע האפיפיורי19. זם-Wus2 הוא תחת שליטה של תירס הinducible יזם (זם-Axig1)20 ו תירס In2-1 שליחות קטלנית21. בסופו של דבר, ה-DNA מכיל (5) מערכת שילוברקומבינציה של היצורים. Recombinase היצור הג22 הוא תחת שליטה של תירס הלם חום חלבון 17.7 (hsp 28.5)23 מקדם תפוחי אדמה ומחסל הסיכה2. שני אתרי Loxp (באותו כיוון)24 אגף ארבע קלטות של ביטוי גנים כולל zsgreen, היצורים, bbm ו Wus2.
בגלל הנוכחות של הגנים מורפולגניים אינו רצוי עבור בגרות הצמח הבאים צאצאים, הנגרמת חום המושרה -loxp מערכת רקומבינציה ילוב נבנה לתוך ה-DNA כדי להסיר גנים מורפולגניים מן הגנום תירס כדי לאפשר התחדשות באופן רגיל יבלות ופיתוח הצמח. בעת טיפול בחום, הביטוי של חלבון היצור מסיר את כל הטרנסגנים למעט הגן על בחירת ה- Hra . Transformants מוצלחת צריך להיות עמיד לצמחים אבל Zsgreen-שלילי. כדי לשפר עוד יותר את תדירות ההמרה, זן Agrobacterium גם נמלים אביזר נוסף פלמיד (PHP71539) כי יש עותקים נוספים של Agrobacterium התקפה אלימה (vir) גנים12.
שיטת QuickCorn שונה מפרוטוקולים קונבנציונליים של שינוי תירס, שכן היא אינה כרוכה בצעד האינדוקציה קריאה במהלך שינוי. במהלך השבוע הראשון לאחר זיהום עם Agrobacterium, העוברים הסומטיים להתפתח על האפיתל scutellar של העוברים בוגרים נגועים. העוברים מועברים לאחר מכן למדיום עם הורמונים המעודדים התבגרות והיווצרות העובר. במהירות העברת העוברים הסומטיים על התבגרות/לירות היווצרות בינונית מדלג על שלב יבלות המסורתי ששימש בעבר לשינוי תירס והיתרי דור ישיר של צמחים T08. לעומת שיטות השינוי של תירס שפורסמובעבר, שיטת התירס המהירה מהירה יותר, יעילה יותר ופחות גנוטיפ. באמצעות שיטה זו, צמחים מושרשת הם בדרך כלל מוכנים להעביר לקרקע רק 5-7 שבועות, ולא שלושה או יותר חודשים הנדרשים על ידי פרוטוקולים מסורתיים. מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מעמיק והדגמה של השיטה, המאפשרת שכפול קל יותר בהגדרת מעבדה הנמצאת בדרך כלל ברוב המוסדות האקדמיים.
פרוטוקולים מסורתיים עבור התמרת תירס בצע את הפרדיגמה של בידוד עוברי זיפטיים בלתי-מפותחים כדי לייצר רקמת הטרנסג הטרנסגניים, אשר נוצר מחדש לתוך צמחים פוריים4,6. אמנם זה יעיל, callus-מבוססי פרוטוקולים יכולים לגזול זמן רב, וזה לוקח עד 3 חודשים לתהליך התרבות רקמה לייצר צמחים. מה שהופך את השיטה המוצגת כאן משמעותי היא כי הוא callus-חינם, יעיל, מהיר, ומאפשר התחדשות של צמחים T0 בערך במחצית מפרק הזמן. זה נראה גם פחות מסוג גנוטיפ, ולכן הוא יכול להיות יעיל עבור הזמינים ביותר מפגרים8,11.
בעוד כל הצעדים יש לעקוב באופן יעיל, נכון הכנה מדיית גדילה היא הכרחית. רכיבי מדיה צמיחה צריך להתווסף בשלבים הנכונים, מראש ולאחר האוטוקלב, כדי להבטיח כי חומר הצמח מקבל את הריכוז הנכון של כימיקלים. זה יבטיח תרכובות רגישות כמו אנטיביוטיקה לא להישבר. חשוב גם שחומר הצמח מוצב על המדיום הגדילה הנכון בכל שלב, כפי שמצוין בפרוטוקול. לא הצבת חומר על מדיום הגדילה הנכון עלולה לגרום למוות חומרי. בנוסף, יש להימנע מהצבת עוברים רבים מדי או מפתחים רקמות על לוחות. בעוד הצבת פי שניים מכלי הרקמה הרבים עשויים לחסוך את העלות של כימיקלים ומנות פטרי (ואפילו מרחב החממה), הצמיחה של רקמות לוחות צפוף יכול להיות מעכבות ברצינות. בעת ביצוע הזיהום, יש להבטיח כי הצפיפות האופטית של ההשעיה Agrobacterium מתאים. אם צפיפות ההשעיה החיידקית נמוכה מדי, ייתכן שהדבקה נכונה לא תתרחש.
איכות החומרים המתחילים חיונית להצלחה בפרוטוקולי השינוי. אוזניים המשמשות לניתוח העובר חייב להיות בריא, כלומר הצמח שמייצר אותם הוא בריא. הם גם חייבים להחזיק בערכת זרעים נאותה ולהיות מזיקים ונטול מחלות. כמו כן, אין להשתמש באגרובאכטריום הזקן. לוחית האימהות צריכה להיות. לא יותר משבועיים לאחר נקודה זו, לוחית “אמא” חדשה צריכה להיות מקוטעת כדי להתחיל בניסויים חדשים.
בעוד ששיטה זו הוצגה בפני פחות מסוג גנוטיפ, אין אפשרות להניח כי כל השורות יהיו מוצלחות באותה מידה. עדיין יכול להיות וריאציה בין הקווים, כמו גם הבדלים בהצלחה בהתבסס על המבנה בשימוש. ההבדלים בין האוזן לאוזן הוא גם בלתי נמנע כאשר עובדים עם עוברים בוגרים, כך שניסויים אידיאליים צריכים להשתמש במספר אוזניים כדי להסביר זאת. בעבודה זו, W22 ביצע את הטוב ביותר, עם מעל ~ 14% תדירות ההמרה, ואחריו B73 ו Mo17 (~ 4% כל אחד). לאו ואח ‘8 דיווח על שימוש בפרוטוקול quickcorn לשינוי B73 ו-Mo17. בעבודה זו, תדרי השינוי נעו מ -9%-50% עבור B73 ו-15%-35% עבור Mo17.
אפשרות אחת תדרי שינוי נמוך עבור B73 ו Mo17 נצפו בעבודה זו ניתן לייחס תנודות באיכות האוזן עונתית. הבדל נוסף בין עבודה זו לבין זה של לאו ואח ‘8 הוא שנעשה שימוש במבנה וקטורי שונה כאן. בעבודתו של לאו, הגנים המוסגניים לא הוסרו מהצומח ההפוך, אלא הושתקו מבחינה מנטלית בשלבים המאוחרים. בעבודה זו, הגנים המורפולגניים הוסרו 8 ימים לאחר ההדבקה. ייתכן שB73 ו-Mo17 יזדקקו לנוכחות ארוכה יותר של Bbm/Wus2 לפיתוח עוברים סומטיים.
שימוש בשיטה זו, יש אפשרות של קבלת צמחי בריחה לא הטרנסגניים, הוספות multimeric, ו טרנסגנים מונגיטים. צמחים אלה לא יהיה פנוטיפים שונים באופן ניכר, כך זיהוי ה-PCR נדרש כדי לקבוע אם הצמח הוא טרנסגניים. כדי לעשות זאת, ניתן ליישם את האזור הפנימי של ה-PCR בתוך האזור המגורש והתחל בכיוון השטח המגורש. שינויי צורה עצמאיים מרובים יכולים גם לייצר צמחים מן העובר אותו בלתי בוגר, מה שהופך את הנחישות של שיעור התאוששות עצמאית טרנספורמאנט הכולל קשה. התקן שלנו כבר לחשב שיעור שינוי המבוסס על דגימת צמח אחד מכל עובר בלתי הולם כי הפיק צמחים וחלוקת זה על ידי מספר העוברים נגוע. שיטה זו כמעט ללא ספק מעריכה את המספר הממשי של אירועים עצמאיים ששוחזרו כמו פלנטטים. האפליה בין אירועים עצמאיים מאותו העובר דורשת רצף של אזורי גבול סביב הטרנסגנים, וזה יהיה יקר באופן גמיש וארוך זמן עבור רוב היישומים; עם זאת, ייתכנו מקרים בהם נתונים אלה שימושיים.
שיטה זו של שינוי התרבות רקמה הוכיחה להיות יעילה מאוד, אבל בעיות עדיין יכול להתרחש. אם חומר הצמח אינו מגיב, ייתכן שיש בעיה עם הקו הטבעי המסוים, הרומז כי משתנים כגון הרכב מדיה צמיחה ותזמון של subculturing דורשים התאמות. משתנה נוסף הוא עיצוב וקטורי נאות ובנייה וקטורית מדויקת, אם הווקטור המקורי שונה. יכול להיות גם בעיות עם רגישות imazapyr, כמו כמה קווים רגישים יותר מאחרים, ואת הריכוז של imazapyr יכול להיות צריך להיות מותאם כדי להשיג צמחים שהפכו בהצלחה.
במהלך 30 השנים האחרונות, התרבות של רקמת תירס ופרוטוקולי טרנספורמציה השתנו והתקדמה; והוא האמין כי פרוטוקול מקוצר זה יהיה להמשך התקדמות זו. שיטה זו יעילה להגדרות אקדמיות משום שהיא פחות גוזלת זמן מאשר שיטות מסורתיות. בנוסף, היא אינה דורשת מפעילים מיומנים ביותר, מה שהופך אותה לקלה יותר להפצה נרחבת בהשוואה לשיטות מסורתיות. בעתיד, שיטה זו יכולה להיות משולבת עם טכנולוגיות חדשות כגון הנדסת גנום.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לצוות החממה של קורטבע לאספקת תירס בלתי מפותח, מעבדת ההכנה של המדיה של קורטבע למתן סיוע ביצירת מדיה, נינג וואנג מקורטבע לעזרה עם בניית Agrobacterium , ו-Keunsub לי מאוניברסיטת איווה סטייט לקבלת סיוע. פרויקט זה היה נתמך באופן חלקי על ידי הלאומית המדע הגנום צמח מחקר תוכנית גרנט 1725122 ו 1917138 K.W., על ידי צמח חזוי Phenomics המחקר traineeship תוכנית (לאומי המדע הקרן גרנט DGE-1545453) כדי J.Z., על ידי משרד החקלאות nifa לבקוע הפרויקט #IOW04341, על ידי מדינת איווה קרנות, ועל ידי מרכז ביוהנד
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |