Plante morfonisk gener kan brukes til å forbedre genetisk transformasjon av recalcitrant genotyper. Beskrevet her er en Agrobacterium-mediertgenetisk transformasjon (QuickCorn) protokoll for tre viktige offentlige mais innavlede linjer.
Demonstrert her er en detaljert protokoll for Agrobacterium-mediertgenetisk transformasjon av mais innavlede linjer ved hjelp av morfonisk gener Baby boom (Bbm) og Wuschel2 (Wus2). Bbm er regulert av maisfosfolipid transferase genet (Pltp) promotor, og Wus2 er under kontroll av en mais auxin-inducible (Axig1) arrangør. En Agrobacterium stamme bærer disse morfonisk gener på overføring DNA (T-DNA) og ekstra kopier av Agrobacterium virulence (vir) gener brukes til å infisere mais umodne embryo explants. Somatiske embryoer dannes på scutella av infiserte embryoer og kan velges ved ugressmiddelresistens og spiret inn i planter. Et varmeaktivert cre/loxP rekombinasjonssystem bygget inn i DNA-konstruksjonen gjør det mulig å fjerne morfonisk gener fra maisgenomet under et tidlig stadium av transformasjonsprosessen. Transformasjonsfrekvenser på henholdsvis ca. 14 %, 4 %og 4 % (antall uavhengige transgene hendelser per 100 infiserte embryoer) kan oppnås for w22, B73 og Mo17 ved hjelp av denne protokollen.
Transformasjon er et grunnleggende verktøy for evaluering av fremmedgenuttrykk i mais og produksjon av genmodifiserte maislinjer for både forskning og kommersielle formål. Tilgang til høy gjennomstrømningstransformasjon kan lette det økte behovet for maismolekylære og cellulære biologistudier1. Evnen til å genetisk forvandle avlingsarter er avgjørende for både offentlige og private laboratorier. Dette gir både grunnleggende forståelse av genreguleringsmekanismer samt avlingsforbedring på global skala for å støtte en stadig voksende befolkning.
Oppdagelsen av at umodne embryoer fra mais kunne brukes til produksjon av regenerable callus oppsto i 19752. Siden denne åpenbaringen har de fleste skalerbare maistransformasjonsprotokoller krevd callusdannelse og utvelgelse før regenerering3. Under prosessen med genetisk transformasjon blir Agrobacterium-infiserteller biolistisk bombardert umodne embryoer dyrket på media for embryogene callus induksjon. Indusert calli blir deretter dyrket på selektive medier (f.eks. som inneholder et ugressmiddel) slik at bare forvandlede callus stykker er i stand til å overleve. Disse ugressmiddelresistente putative transgene calliene er bulket opp og regenerert til planter. Mens denne metoden er effektiv, er prosessen lang og arbeidskrevende, og det kan ta oppover 3 måneder å fullføre4. Enda viktigere, konvensjonelle mais transformasjon protokoller har en mye større begrensning, det vil si, bare et begrenset antall mais genotyper kan forvandles5,6.
Lowe et al.7,8 tidligere rapportert en “QuickCorn” transformasjon metode som ikke bare sterkt redusert varigheten av transformasjonsprosessen, men også utvidet listen over transformerbare genotyper. QuickCorn-metoden benytter maisortologer (Zm-Bbm og Zm-Wus2) av arabidopsistranskripsjonsfaktorene BABY BOOM (BBM)9 og WUSCHEL (WUS)10. Når de er innlemmet i transformasjonsvektorsystemet, fungerer disse genene synergisk for å stimulere embryogen vekst7.
QuickCorn-protokollen som er beskrevet i dette arbeidet var basert på protokollen i Jones et al11, som var en ytterligere forbedring av metoden rapportert av Lowe et al7,8. I den nåværende studien, en Agrobacterium stamme LBA4404 (Thy-) husing en binær vektor konstruere PHP81430(Figur 1) og tilbehør plasmid PHP7153912 brukes til transformasjon. T-DNA av PHP81430 inneholder følgende molekylære komponenter. (1) Transformasjonen selektiv markør genhra uttrykkskassett. Maishra (Zm-Hra) genet er et modifisert acetolaktase synthase (ALS) gen som er tolerant mot ALS-hemmende ugressmidler som sulfonylureaog imidazolinoner13,14. Zm-Hra-genet er regulert av sorghum ALS-promotoren8 og potetproteinasehemmeren II(pinII) terminator15. T-DNA inneholder også (2) en uttrykkskassett som har transformasjonen skjermbar markør genet ZsGreen. Dette grønne fluorescerende proteingenet ZsGreen fra Zoanthus sp. reef coral16 er regulert av en sorghum ubiquitin promotor/ intron og ris ubiquitin terminator.
I tillegg inneholder T-DNA (3) morfonisk genet Bbm uttrykkskassett. Bbm er en transkripsjonsfaktor forbundet med embryoutvikling9,17. Bbm er regulert av mais fosfolipid transferase protein (Pltp) promotør8 og ris T28 terminator18. Zm-Pltp er et gen med sterkt uttrykk i embryoet scutellar epitel, silkehår, og blad datterselskap celler (flankerer vaktcellene), lavt uttrykk i reproduktive organer, og ingen uttrykk i røtter8. Den inneholder også (4) morfonisk genet Wus2 uttrykkkassett. Wus2 er en annen transkripsjonsfaktor forbundet med vedlikehold av den apikale meristem19. Zm-Wus2 er under kontroll av en mais auxin-inducible promotor (Zm-Axig1)20 og mais In2-1 terminator21. Til slutt inneholder T-DNA (5) cre–loxP rekombinasjonssystemet. Cre recombinase genet22 er under kontroll av mais varme sjokk protein 17,7 (Hsp17.7)23 promotor og potet pinII terminator. To loxP nettsteder (i samme retning)24 flanke fire genuttrykkkassetter inkludert ZsGreen, cre, Bbm og Wus2.
Fordi tilstedeværelsen av morfonisk gener ikke er ønsket for plantemodenhet og påfølgende avkom, ble det varmeinduserte cre-loxP rekombinasjonssystemet bygget inn i T-DNA for å fjerne morfogenet fra maisgenomet for å tillate normal callus regenerering og planteutvikling. Ved varmebehandling fjerner uttrykket av CRE-protein alle transgenes bortsett fra Hra-utvalgsgenet. Vellykkede transformanter bør være ugressmiddelbestandige, men ZsGreen-negativ. For ytterligere å forbedre transformasjonsfrekvensen, har Agrobacterium-stammen også en ekstra tilbehørplasmid (PHP71539) som har ekstra kopier av Agrobacterium virulence (vir) gener12.
QuickCorn-metoden er forskjellig fra konvensjonelle maistransformasjonsprotokoller, da det ikke involverer et callus induksjonstrinn under transformasjon. I løpet av den første uken etter infeksjon med Agrobacteriumutvikler somatiske embryoer seg på scutellarepitelet til de infiserte umodne embryoene. Embryoene overføres deretter til et medium med hormoner som oppmuntrer til embryomodning og skyter formasjon. Raskt overføre de somatiske embryoer på modning / skyte formasjon medium hopper over den tradisjonelle callus scenen tidligere brukt for mais transformasjon og tillater direkte generasjon av T0 planter8. Sammenlignet med tidligere publiserte maistransformasjonsmetoder6, er QuickCorn-metoden raskere, mer effektiv og mindre genotypeavhengig. Ved hjelp av denne metoden er forankrede planter vanligvis klare til å overføre til jord på bare 5-7 uker, i stedet for de tre eller flere månedene som kreves av tradisjonelle protokoller. Formålet med denne artikkelen er å gi en grundig beskrivelse og demonstrasjon av metoden, noe som gjør det mulig for enklere replikering i en laboratorieinnstilling som vanligvis finnes i de fleste akademiske institusjoner.
Tradisjonelle protokoller for maistransformasjon følger paradigmet med isolerende umodne zygotiske embryoer for å produsere transgencallusvev, som regenereres til fruktbare planter4,6. Selv om dette er effektivt, kan callus-baserte protokoller være tidkrevende, og det tar ofte opptil 3 måneder for vevkulturprosessen å produsere planter. Det som gjør metoden presentert her betydelig er at den er callus-fri, effektiv, rask, og tillater regenerering av T0 planter i omtrent halvparten av tidsrammen. Det ser også ut til å være mindre genotypeavhengig og kan dermed være effektiv for de fleste offentlig tilgjengelige innavlete8,11.
Mens alle tiltak bør følges effektivt, er riktig vekst media forberedelse viktig. Vekstmediekomponenter må legges til på de riktige stadiene, både før- og post-autoklav, for å sikre at plantematerialet får riktig konsentrasjon av kjemikalier. Dette vil sikre at følsomme forbindelser som antibiotika ikke bryter ned. Det er også viktig at plantemateriale er plassert på riktig vekstmedium på hvert trinn, som angitt i protokollen. Ikke plassere materiale på riktig vekstmedium kan resultere i materiell død. I tillegg bør det unngås å plassere for mange embryoer eller utvikle vev på plater. Mens du plasserer dobbelt så mange vev stykker kan spare kostnadene for kjemikalier og Petri retter (og selv inkubator plass), veksten av vev i overfylte plater kan være alvorlig hemmet. Mens du utfører infeksjonen, bør det sikres at den optiske tettheten av Agrobacterium suspensjon er hensiktsmessig. Hvis bakteriell suspensjon tetthet er for lav, kan riktig infeksjon ikke forekomme.
Kvaliteten på startmaterieller er avgjørende for suksess i transformasjonsprotokoller. Ører som brukes til embryodisseksjon må være sunne, noe som betyr at planten som produserer dem er sunt. De må også ha et tilstrekkelig frøsett og være skadedyrs- og sykdomsfrie. Gamle Agrobacterium bør heller ikke brukes. “Mor” platen bør ikke være mer enn 2 uker gammel. Etter dette punktet bør en ny “mor” plate være stripete for å starte nye eksperimenter.
Selv om denne metoden har vist seg å være mindre genotypeavhengig, kan den ikke antas at alle linjer vil være like vellykkede. Det kan fortsatt være variasjon blant linjer samt forskjeller i suksess basert på konstruksjonen som brukes. Øre-til-øre-variabilitet er også uunngåelig når du arbeider med umodne embryoer, så ideelt sett bør eksperimenter bruke flere ører for å ta hensyn til dette. I dette arbeidet, inbred W22 utført best, med over ~ 14% transformasjon frekvens, etterfulgt av B73 og Mo17 (~ 4% hver). Lowe et al.8 rapporterte bruk av QuickCorn-protokollen for B73 og Mo17 transformasjon. I dette arbeidet varierte transformasjonsfrekvensene fra 9%-50% for B73 og 15%-35% for Mo17.
En mulighet for lavere transformasjonsfrekvenser for B73 og Mo17 observert i dette arbeidet kan tilskrives sesongmessige svingninger i ørekvaliteten. En annen forskjell mellom dette arbeidet og Lowe et al.8 er at ulike vektorkonstruksjoner ble brukt her. I Lowes arbeid ble morfonisk gener ikke fjernet fra de forvandlede plantene, men heller utviklingsmessig dempet i de senere stadiene. I dette arbeidet ble morfonisk gener fjernet 8 dager etter infeksjonen. Det er mulig at B73 og Mo17 kan trenge en lengre tilstedeværelse av Bbm/Wus2 for utvikling av somatiske embryoer.
Ved hjelp av denne metoden er det en mulighet for å oppnå ikke-transgene rømningsplanter, multimeriske innsettinger og upubliserte transgener. Disse plantene vil ikke ha en merkbart forskjellig fenotype, så deteksjon av PCR er nødvendig for å avgjøre om en plante er transgen. For å oppnå dette kan PCR-primere innenfor den utskårne regionen og primere flankere den utskårne regionen brukes. Flere uavhengige transformasjoner kan også produsere planter fra det samme umodne embryoet, noe som gjør fastsettelse av total uavhengig transformant utvinningsgrad vanskelig. Vår standard har vært å beregne en transformasjonshastighet basert på prøvetaking av en plante fra hvert umodne embryo som produserte planter og deler dette med antall embryoer smittet. Denne metoden undervurderer nesten helt sikkert det faktiske antallet uavhengige hendelser som er gjenopprettet som plantlets. Diskriminering mellom uavhengige hendelser fra samme embryo krever sekvensering av grenseregioner rundt transgenes, og dette vil være uoverkommelig dyrt og tidkrevende for de fleste applikasjoner; det kan imidlertid være tilfeller der disse dataene er nyttige.
Denne metoden for vev kultur transformasjon har vist seg å være svært effektiv, men problemer kan fortsatt oppstå. Hvis plantematerialet ikke reagerer, er det mulig at det er et problem med den bestemte innavlede linjen, noe som tyder på at variabler som vekstmediesammensetning og tidspunktet for subculturing krever justeringer. En annen variabel er riktig vektordesign og nøyaktig vektorkonstruksjon, hvis den opprinnelige vektoren endres. Det kan også være problemer med imazapyr følsomhet, som noen linjer er mer følsomme enn andre, og konsentrasjonen av imazapyr må kanskje justeres for å oppnå vellykket forvandlet planter.
I løpet av de siste 30 årene har maisvevskultur og transformasjonsprotokoller endret seg og utviklet seg; og det antas at denne forkortede protokollen vil fremme denne progresjonen. Denne metoden er effektiv for akademiske innstillinger fordi den er mindre tidkrevende enn tradisjonelle metoder. I tillegg krever det ikke høyt utdannede operatører, noe som gjør det mer mottagelig for utbredt distribusjon sammenlignet med tradisjonelle metoder. I fremtiden kan denne metoden kombineres med nye teknologier som genomteknikk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Corteva drivhusteamet for å gi mais umodne ører, Corteva media prep lab for å gi hjelp til å lage media, Ning Wang fra Corteva for hjelp med Agrobacterium konstruksjon, og Keunsub Lee fra Iowa State University for hjelp. Dette prosjektet ble delvis støttet av National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 og 1917138 til K.W., av Prediktiv Plante Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) til J.Z., av USDA NIFA Hatch-prosjektet #IOW04341, av State of Iowa-midler, og av Crop Bioengineering Center of Iowa State University.
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |