Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.
Hier gedemonstreerd is een gedetailleerd protocol voor Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie van maïs inteelt lijnen met behulp van morfogene genen Baby boom (Bbm) en Wuschel2 (Wus2). Bbm wordt gereguleerd door de promotor van het maïsfolipide-overdrachtsgen(Pltp)en Wus2 staat onder controle van een promotor van maïsauxine-inducible(Axig1). Een Agrobacterium stam die deze morfogene genen op overdracht DNA (T-DNA) en extra kopieën van Agrobacterium virulentie(vi)genen worden gebruikt om maïs onrijpe embryo explants infecteren. Somatische embryo’s vormen zich op de scutella van geïnfecteerde embryo’s en kunnen worden geselecteerd door herbicideresistentie en ontkiemd in planten. Een warmte-geactiveerd cre/loxP recombinatiesysteem ingebouwd in de DNA-constructie maakt het mogelijk om morfogene genen uit het maïsgenoom te verwijderen in een vroeg stadium van het transformatieproces. Transformatiefrequenties van respectievelijk ongeveer 14%, 4% en 4% (aantallen onafhankelijke transgene voorvallen per 100 geïnfecteerde embryo’s) kunnen worden bereikt voor W22, B73 en Mo17, met behulp van dit protocol.
Transformatie is een fundamenteel instrument voor de evaluatie van vreemde genexpressie in maïs en het produceren van genetisch gemodificeerde maïslijnen voor zowel onderzoeks- als commerciële doeleinden. Toegang tot een hoge doorvoertransformatie kan de toegenomen behoefte aan moleculaire en cellulaire biologiestudies van maïs vergemakkelijken1. Het vermogen om gewassoorten genetisch te transformeren is van vitaal belang voor zowel openbare als particuliere laboratoria. Dit maakt zowel een fundamenteel begrip van genregulatiemechanismen als gewasverbetering op wereldschaal mogelijk om een steeds groeiende bevolking te ondersteunen.
De ontdekking dat onrijpe embryo’s van maïs kunnen worden gebruikt voor de productie van regeneratief eelt , is ontstaan in 19752. Sinds deze openbaring hebben de meeste schaalbare maïstransformatieprotocollen callusvorming en selectie vereist voorafgaand aan regeneratie3. Tijdens het proces van genetische transformatie worden agrobacterium-geïnfecteerdeof biolistisch gebombardeerde onrijpe embryo’s gekweekt op media voor embryogene eeltinductie. Geïnduceerde calli worden vervolgens gekweekt op selectieve media (bijvoorbeeld, met een herbicide), zodat alleen getransformeerde callus stukken in staat zijn om te overleven. Deze herbicide-resistente vermeende transgene calli worden opgeladen en geregenereerd in planten. Hoewel deze methode effectief is, is het proces lang en arbeidsintensief, en het kan meer dan 3 maanden duren om4te voltooien. Wat nog belangrijker is, conventionele maïstransformatieprotocollen hebben een veel grotere beperking, dat wil zeggen dat slechts een beperkt aantal maïsgenotypen kan worden getransformeerd5,6.
Lowe et al.7,8 rapporteerde eerder een “QuickCorn” transformatiemethode die niet alleen de duur van het transformatieproces sterk verminderde, maar ook de lijst van transformeerbare genotypen uitbreidde. De QuickCorn methode maakt gebruik van maïs orthologs (Zm-Bbm en Zm-Wus2) van de Arabidopsis transcriptie factoren BABY BOOM (BBM)9 en WUSCHEL (WUS)10. Wanneer opgenomen in het transformatievectorsysteem, werken deze genen synergetisch om embryogene groei te stimuleren7.
Het QuickCorn-protocol dat in dit werk werd beschreven, was gebaseerd op het protocol in Jones etal. 11, wat een verdere verbetering was van de door Lowe etal. 7gerapporteerde methode ,8. In deze studie, een Agrobacterium stam LBA4404 (Thy-) herbergen een binaire vector constructie PHP81430 (Figuur 1) en accessoire plasmid PHP7153912 worden gebruikt voor transformatie. Het T-DNA van PHP81430 bevat de volgende moleculaire componenten. (1) De transformatie selectieve marker gen Hra expressie cassette. Het maïs-Hra -gen(Zm-Hra)is een gewijzigd acetolactase synthase (ALS)-gen dat tolerant is voor ALS-remmende herbiciden zoals sulfonylureas en imidazolinones13,14. Het Zm-Hra gen wordt gereguleerd door de sorghum ALS promotor8 en aardappel proteinase inhibitor II(pinII) terminator15. Het T-DNA bevat ook (2) een expressiecassette met het transformatiescreenbare markergen ZsGreen. Dit groene fluorescerende eiwit gen ZsGreen van Zoanthus sp. rif koraal16 wordt gereguleerd door een sorghum ubiquitine promotor / intron en rijst ubiquitine terminator.
Daarnaast bevat het T-DNA (3) het morfogene gen Bbm expressiecassette. Bbm is een transcriptiefactor in verband met embryoontwikkeling9,17. Bbm wordt gereguleerd door de maïs fosfolipide transferase eiwit(Pltp) promotor8 en rijst T28 terminator18. Zm-Pltp is een gen met sterke expressie in het embryo scutellar epitheel, zijdeharen en bladdochtercellen (flankerende de wachtcellen), lage expressie in voortplantingsorganen en geen expressie in wortels8. Het bevat ook (4) het morfogene gen Wus2 expressie cassette. Wus2 is een andere transcriptiefactor in verband met het onderhoud van de apicale meristem19. Zm-Wus2 staat onder toezicht van een maïsauxin-inducible promoter (Zm-Axig1)20 en maïs In2-1 terminator21. Ten slotte bevat het T-DNA (5) het cre–loxP recombination systeem. De cre recombinase gen22 is onder de controle van maïs hitte schok eiwit 17.7 (Hsp17.7)23 promotor en aardappel pinII terminator. Twee loxP-sites (in dezelfde oriëntatie)24 flankvier genexpressiecassettes waaronder ZsGreen, cre, Bbm en Wus2.
Omdat de aanwezigheid van de morfogene genen niet gewenst is voor de rijpheid van de plant en het daaropvolgende nageslacht, werd het warmte-geïnduceerde cre-loxP-recombinatiesysteem ingebouwd in het T-DNA om morfogene genen uit het maïsgenoom te verwijderen om normale callusregeneratie en plantenontwikkeling mogelijk te maken. Bij warmtebehandeling verwijdert de expressie van CRE-eiwit alle transgenen, behalve het Hra-selectiegen. Succesvolle transformatoren moeten herbicide-resistent, maar ZsGreen-negatief. Om de transformatiefrequentie verder te verbeteren, herbergt de Agrobacterium-stam ook een extra accessoire plasmid (PHP71539) dat extra kopieën heeft van Agrobacterium virulentie(vi)genen12.
De QuickCorn-methode verschilt van conventionele maïstransformatieprotocollen, omdat het geen callusinductiestap tijdens de transformatie inhoudt. Tijdens de eerste week na infectie met Agrobacteriumontwikkelen somatische embryo’s zich op het scutellar epitheel van de geïnfecteerde onrijpe embryo’s. De embryo’s worden vervolgens overgebracht naar een medium met hormonen die embryorijping en schietvorming aanmoedigen. Het snel overbrengen van de somatische embryo’s op rijpings-/scheutvormingsmedium slaat het traditionele eeltstadium over dat eerder werd gebruikt voor maïstransformatie en maakt directe generatie van T0-planten mogelijk8. In vergelijking met eerder gepubliceerde maïstransformatiemethoden6is de QuickCorn-methode sneller, efficiënter en minder genotype-afhankelijk. Met behulp van deze methode, gewortelde planten zijn meestal klaar om over te dragen aan de bodem in slechts 5-7 weken, in plaats van de drie of meer maanden vereist door de traditionele protocollen. Het doel van dit artikel is om een diepgaande beschrijving en demonstratie van de methode te bieden, waardoor gemakkelijker replicatie in een laboratorium omgeving meestal gevonden in de meeste academische instellingen.
Traditionele protocollen voor maïstransformatie volgen het paradigma van het isoleren van onrijpe zygotische embryo’s om transgeen eeltweefsel te produceren, dat wordt geregenereerd tot vruchtbare planten4,6. Hoewel dit effectief is, kunnen callus-gebaseerde protocollen tijdrovend zijn, en het duurt vaak tot 3 maanden voor het weefselkweekproces om planten te produceren. Wat maakt de hier gepresenteerde methode belangrijk is dat het callus-vrij, efficiënt, snel, en zorgt voor de regeneratie van T0 planten in ongeveer de helft van het tijdsbestek. Het lijkt ook minder genotype-afhankelijk en kan dus effectief zijn voor de meeste openbaar beschikbare inteelten 8,11.
Hoewel alle stappen effectief moeten worden gevolgd, is een correcte voorbereiding van de groeimedia noodzakelijk. Groeimediacomponenten moeten in de juiste stadia worden toegevoegd, zowel voor- als na het autoclaven, om ervoor te zorgen dat het plantmateriaal de juiste concentratie van chemicaliën ontvangt. Dit zal ervoor zorgen dat gevoelige verbindingen zoals antibiotica niet afbreken. Het is ook belangrijk dat plantaardig materiaal in elke fase op het juiste groeimedium wordt geplaatst, zoals aangegeven in het protocol. Het niet plaatsen van materiaal op het juiste groeimedium kan leiden tot materiële dood. Bovendien moet het plaatsen van te veel embryo’s of het ontwikkelen van weefsels op platen worden vermeden. Terwijl het plaatsen van twee keer zoveel weefsel stukken kan de kosten van chemicaliën en petrischaaltjes (en zelfs incubator ruimte) te besparen, kan de groei van weefsel in overvolle platen ernstig worden geremd. Tijdens het uitvoeren van de infectie moet ervoor worden gezorgd dat de optische dichtheid van de Agrobacterium-suspensie geschikt is. Als de bacteriële suspensiedichtheid te laag is, kan een goede infectie niet optreden.
De kwaliteit van uitgangsmaterialen is essentieel voor succes in transformatieprotocollen. Oren die worden gebruikt voor embryodissectie moeten gezond zijn, wat betekent dat de plant die ze produceert gezond is. Ze moeten ook beschikken over een voldoende zaadset en ongedierte- en ziektevrij zijn. Ook mag oude Agrobacterium niet worden gebruikt. De “moeder” plaat mag niet meer dan 2 weken oud zijn. Na dit punt, een nieuwe “moeder” plaat moet worden gestreept om nieuwe experimenten te beginnen.
Hoewel is aangetoond dat deze methode minder genotype-afhankelijk is, kan niet worden aangenomen dat alle regels even succesvol zullen zijn. Er kan nog steeds variatie tussen de lijnen en verschillen in succes op basis van de constructie wordt gebruikt. Oor-tot-oor variabiliteit is ook onvermijdelijk bij het werken met onrijpe embryo’s, dus idealiter experimenten moeten meerdere oren gebruiken om dit te verantwoorden. In dit werk presteerde inteelt W22 het beste, met een transformatiefrequentie van meer dan ~ 14%, gevolgd door B73 en Mo17 (~ 4% per stuk). Lowe et al.8 gemeld met behulp van de QuickCorn protocol voor B73 en Mo17 transformatie. In dit werk varieerden de transformatiefrequenties van 9%-50% voor B73 en 15%-35% voor Mo17.
Een mogelijkheid voor de lagere transformatiefrequenties voor B73 en Mo17 waargenomen in dit werk kan worden toegeschreven aan seizoensgebonden oor kwaliteit fluctuatie. Een ander verschil tussen dit werk en dat van Lowe et al.8 is dat hier verschillende vectorconstructies werden gebruikt. In Lowe’s werk werden morfogene genen niet verwijderd uit de getransformeerde planten, maar in de latere stadia ontwikkelingshet zwijgen opgelegd. In dit werk werden de morfogene genen 8 dagen na de infectie verwijderd. Het is mogelijk dat B73 en Mo17 een langere aanwezigheid van Bbm/Wus2 nodig hebben voor de ontwikkeling van somatische embryo’s.
Met behulp van deze methode is er een mogelijkheid om niet-transgene ontsnappingsinstallaties, multimeric invoegingen en niet-weggesneden transgenen te verkrijgen. Deze planten zullen geen merkbaar verschillend fenotype hebben, dus detectie door PCR is nodig om te bepalen of een plant transgeen is. Om dit te bereiken, PCR primers binnen de accijnsregio en primers flankeren de accijnsregio kan worden gebruikt. Meerdere onafhankelijke transformaties kunnen ook planten produceren uit hetzelfde onrijpe embryo, waardoor de bepaling van de totale onafhankelijke transformatieve herstelsnelheid moeilijk is. Onze standaard is het berekenen van een transformatiesnelheid op basis van het bemonsteren van een plant uit elk onvolwassen embryo dat planten produceerde en dit deelde door het aantal geïnfecteerde embryo’s. Deze methode onderschat vrijwel zeker het werkelijke aantal onafhankelijke gebeurtenissen teruggewonnen als plantenbakken. Discriminatie tussen onafhankelijke gebeurtenissen uit hetzelfde embryo vereist het rangschikken van grensregio’s rond transgenen, en dit zal voor de meeste toepassingen onbetaalbaar en tijdrovend zijn; er kunnen echter gevallen zijn waarin deze gegevens nuttig zijn.
Deze methode van weefselkweektransformatie heeft bewezen zeer effectief te zijn, maar er kunnen nog steeds problemen optreden. Als plantaardig materiaal niet reageert, is het mogelijk dat er een probleem is met de specifieke inteeltlijn, wat suggereert dat variabelen zoals de samenstelling van de groeimedia en het tijdstip van subculturing aanpassingen vereisen. Een andere variabele is een goed vectorontwerp en nauwkeurige vectorconstructie, als de oorspronkelijke vector wordt gewijzigd. Er kunnen ook problemen zijn met imazapyr-gevoeligheid, omdat sommige lijnen gevoeliger zijn dan andere, en de concentratie van imazapyr moet mogelijk worden aangepast om succesvol getransformeerde planten te bereiken.
In de afgelopen 30 jaar zijn de maïsweefselkweek en transformatieprotocollen veranderd en gevorderd; en er wordt aangenomen dat dit verkorte protocol deze vooruitgang zal bevorderen. Deze methode is effectief voor academische instellingen omdat het minder tijdrovend is dan traditionele methoden. Bovendien vraagt het niet om hoog opgeleide exploitanten, waardoor zij vatbaarder is voor een wijdverbreide distributie in vergelijking met traditionele methoden. In de toekomst kan deze methode worden gecombineerd met nieuwe technologieën zoals genoomengineering.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de Corteva kas team voor het verstrekken van maïs onvolwassen oren, de Corteva media prep lab voor het verstrekken van hulp bij het maken van media, Ning Wang uit Corteva voor hulp met de Agrobacterium constructie, en Keunsub Lee van Iowa State University voor hulp. Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door National Science Foundation Plant Genome Research Program Grant 1725122 en 1917138 aan K.W., door Predictive Plant Phenomics Research Traineeship Program (National Science Foundation Grant DGE-1545453) aan J.Z., door het USDA NIFA Hatch-project #IOW04341, door staat sein iowa fondsen, en door Crop Bioengineering Center van Iowa State University.
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |