पौधे मॉर्फोजेनिक जीन का उपयोग अड़ियल जीनोटाइप के आनुवंशिक परिवर्तन में सुधार करने के लिए किया जा सकता है। यहां वर्णित तीन महत्वपूर्ण सार्वजनिक मक्का नस्ल लाइनों के लिए एक एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताआनुवंशिक परिवर्तन (क्विककॉर्न) प्रोटोकॉल है।
यहां प्रदर्शित एग्रोबैक्टीरियम-मॉर्मोजेनिकजीन बेबी बूम (बीबीएम)और वुशेल2 (Wus2)का उपयोग करके मक्का नस्ल लाइनों के आनुवंशिक परिवर्तन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । बीबीएम को मक्का फॉस्फोलिपिड ट्रांसफरेज जीन(पीएलटीपी)प्रमोटर द्वारा विनियमित किया जाता है, और Wus2 मक्का ऑक्सिन-इंड्यूबल(एक्सीजी1)प्रमोटर के नियंत्रण में है। स्थानांतरण डीएनए (टी-डीएनए) पर इन मॉर्फोजेनिक जीन ले जाने वाला एग्रोबैक्टीरियम तनाव और एग्रोबैक्टीरियम उग्रता(वीर)जीन की अतिरिक्त प्रतियों का उपयोग मक्का अपरिपक्व भ्रूण एक्सप्लांटको संक्रमित करने के लिए किया जाता है। संक्रमित भ्रूण के स्कूटेला पर दैहिक भ्रूण बनते हैं और शाकनाशी प्रतिरोध द्वारा चुने जा सकते हैं और पौधों में अंकुरित हो सकते हैं। डीएनए निर्माण में निर्मित एक गर्मी-सक्रिय क्रे/लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली परिवर्तन प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण के दौरान मक्का जीनोम से मॉर्फोजेनिक जीन को हटाने की अनुमति देती है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके क्रमशः W22, B73 और Mo17 के लिए लगभग 14%, 4%, और 4% (प्रति 100 संक्रमित भ्रूण प्रति स्वतंत्र ट्रांसजेनिक घटनाओं की संख्या) की परिवर्तन आवृत्तियों को प्राप्त किया जा सकता है।
परिवर्तन मक्का में विदेशी जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने और अनुसंधान और वाणिज्यिक दोनों प्रयोजनों के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित मकई लाइनों का उत्पादन करने के लिए एक बुनियादी उपकरण है । उच्च थ्रूपुट परिवर्तन तक पहुंच मक्का आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान अध्ययन1के लिए बढ़ी हुई आवश्यकता को सुविधाजनक बना सकती है । फसल प्रजातियों को आनुवंशिक रूप से बदलने की क्षमता सार्वजनिक और निजी दोनों प्रयोगशालाओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह जीन विनियमन तंत्र की मौलिक समझ के साथ-साथ वैश्विक स्तर पर फसल सुधार दोनों के लिए एक बढ़ती आबादी का समर्थन करने की अनुमति देता है ।
मक्का से अपरिपक्व भ्रूण का उपयोग पुनर्योजी कालस के उत्पादन के लिए की जाने वाली खोज का उपयोग 19752में हुआ था . इस रहस्योद्घाटन के बाद से, सबसे स्केलेबल मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल3उत्थान से पहले कॉलस गठन और चयन की आवश्यकता है । आनुवंशिक परिवर्तन की प्रक्रिया के दौरान, एग्रोबैक्टीरियम-संक्रमितया बायोलिस्टिक-बमबारी अपरिपक्व भ्रूण भ्रूणीय कॉलस प्रेरण के लिए मीडिया पर सुसंस्कृत हैं। प्रेरित कैली तो चयनात्मक मीडिया पर सुसंस्कृत कर रहे है (उदाहरण के लिए, एक शाकनाशी युक्त) ताकि केवल बदल कॉलस टुकड़े जीवित रहने में सक्षम हैं । ये शाकनाशी प्रतिरोधी ख्यात ट्रांसजेनिक कैली को थोक और पौधों में पुनर्जीवित किया जाता है। हालांकि यह विधि प्रभावी है, प्रक्रिया लंबी और श्रम-प्रधान है, और इसे पूरा करने में 3 महीने की ऊपर की ओर ले जा सकतेहैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि पारंपरिक मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल की बहुत बड़ी सीमा है, अर्थात केवल मक्का के जीनोटाइप की सीमित संख्या5,6को बदल सकती है।
लोव एट अल7,8 ने पहले एक “क्विककॉर्न” परिवर्तन विधि की सूचना दी थी जिसने न केवल परिवर्तन प्रक्रिया की अवधि को बहुत कम कर दिया बल्कि परिवर्तनीय जीनोटाइप की सूची का विस्तार भी किया। क्विककॉर्न विधि अरबीडोप्सिस ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स बेबी बूम (बीबीएम)9 और वुशेल (डब्ल्यूयूएस)10के मक्का ऑर्थोलोग्स(जेडएम-बीबीएम और जेडएम-Wus2)का उपयोग करती है। जब परिवर्तन वेक्टर प्रणाली में शामिल किया जाता है, तो ये जीन भ्रूणीय विकास को प्रोत्साहित करने के लिए सहक्रियात्मक रूप से काम करतेहैं7।
इस कार्य में वर्णित क्विककॉर्न प्रोटोकॉल जोन्स एट अल11में प्रोटोकॉल पर आधारित था , जो लोव एट अल7,8द्वारा सूचित विधि में और सुधार था । वर्तमान अध्ययन में, एक एग्रोबैक्टीरियम तनाव LBA4404 (तेरा-) एक बाइनरी वेक्टर निर्माण PHP81430(चित्रा 1)और गौण प्लाज्मिड PHP7153912 परिवर्तन के लिए उपयोग किया जाता है । PHP81430 के टी डीएनए में निम्नलिखित आणविक घटक शामिल हैं। (1) ट्रांसफॉर्मेशन चुनिंदा मार्कर जीन एचआरए एक्सप्रेशन कैसेट । मक्का एचआरए (जेडएम-एचआरए)जीन एक संशोधित एसीटोलैक्टेस सिंथासे (एएलएस) जीन है जो एएलएस-बाधा शाकनाशी जैसे सल्फोनिलुरास और इमिडाजोलिनोन13,14के प्रति सहिष्णु है। जेडएम-एचआरए जीन को ज्वार एएलएस प्रमोटर8 और आलू प्रोटीन्स अवरोधक II(पिनII) टर्मिनेटर15द्वारा विनियमित किया जाता है। टी डीएनए भी (2) परिवर्तन स्क्रीनेबल मार्कर जीन ZsGreenरखने के एक अभिव्यक्ति कैसेट शामिल हैं । जोएंथस एसपी रीफ कोरल16 से यह ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन जेडग्रीन को ज्वार सर्वव्यापी प्रमोटर/इंट्रोन और चावल सर्वव्यापक टर्मिनेटर द्वारा विनियमित किया जाता है ।
इसके अतिरिक्त, टी डीएनए में (3) मॉर्फोजेनिक जीन बीबीएम अभिव्यक्ति कैसेट शामिल है। बीबीएम भ्रूण विकास9,17से जुड़ा एक प्रतिलेखन कारक है . बीबीएम को मक्का फॉस्फोलिपिड ट्रांसफराज प्रोटीन(पीएलटीपी)प्रमोटर8 और चावल टी -28 टर्मिनेटर18द्वारा विनियमित किया जाता है । Zm-Pltp भ्रूण स्कूटीएलर एपिथेलियम, रेशम बाल, और पत्ती सहायक कोशिकाओं (गार्ड कोशिकाओं को flanking), प्रजनन अंगों में कम अभिव्यक्ति, और जड़ों8में कोई अभिव्यक्ति में मजबूत अभिव्यक्ति के साथ एक जीन है । इसमें (4) मॉर्फोजेनिक जीन Wus2 एक्सप्रेशन कैसेट भी होता है। WUS2 एक और ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर है जो एपिकल मेरिस्टेम19के रखरखाव से जुड़ा हुआ है । Zm-WUS2 एक मक्का ऑक्सिन-प्रेरक प्रमोटर(Zm-Axig1)20 और मक्का In2-1 टर्मिनेटर21के नियंत्रण में है । अंत में, टी-डीएनए में (5) क्रे–लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली शामिल है। क्रे रीकॉम्बिनेज जीन22 मक्का हीट शॉक प्रोटीन 17.7(Hsp17.7)23 प्रमोटर और आलू पिनII टर्मिनेटर के नियंत्रण में है। दो लोक्सपी साइटें (एक ही अभिविन्यास में)24 ZsGreen, cre, Bbm और Wus2सहित चार जीन अभिव्यक्ति कैसेट पार्श्व ।
क्योंकि मॉर्फोजेनिक जीन की उपस्थिति पौधों की परिपक्वता और बाद में संतान के लिए वांछित नहीं है, गर्मी से प्रेरित क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली को सामान्य कॉलस पुनर्जनन और पौधे के विकास की अनुमति देने के लिए मक्का जीनोम से मॉर्फोजेनिक जीन को हटाने के लिए टी-डीएनए में बनाया गया था। गर्मी उपचार पर, सीआरई प्रोटीन की अभिव्यक्ति एचआरए चयन जीन को छोड़कर सभी ट्रांसजीन को हटा देती है। सफल ट्रांसफॉर्मेंट शाकनाशी प्रतिरोधी लेकिन ZsGreen-नकारात्मकहोना चाहिए। परिवर्तन आवृत्ति को और बढ़ाने के लिए, एग्रोबैक्टीरियम तनाव एक अतिरिक्त सहायक प्लाज्मिड (PHP71539) को भी आश्रय देता है जिसमें एग्रोबैक्टीरियम उग्रता(वीर)जीन12की अतिरिक्त प्रतियां हैं।
क्विककॉर्न विधि पारंपरिक मक्का परिवर्तन प्रोटोकॉल से अलग है, क्योंकि इसमें परिवर्तन के दौरान कॉलस इंडक्शन कदम शामिल नहीं है। एग्रोबैक्टीरियमके साथ संक्रमण के बाद पहले सप्ताह के दौरान, संक्रमित अपरिपक्व भ्रूण के स्कूटीएलर एपिथेलियम पर दैहिक भ्रूण विकसित होते हैं। भ्रूण तो हार्मोन है कि भ्रूण परिपक्वता और गोली मार गठन को प्रोत्साहित के साथ एक माध्यम में स्थानांतरित कर रहे हैं । दैहिक भ्रूणों को परिपक्वता/शूट फॉर्मेशन मीडियम पर तेजी से स्थानांतरित करना पहले मक्का परिवर्तन के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक कॉलस चरण को रोक देता है और टी0 पौधों की प्रत्यक्ष पीढ़ी को8की अनुमति देता है । पहले प्रकाशित मक्का परिवर्तन विधियों की तुलना में6,क्विककॉर्न विधि तेज, अधिक कुशल और कम जीनोटाइप-निर्भर है। इस विधि का उपयोग करके, जड़ें पौधे आमतौर पर पारंपरिक प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक तीन या अधिक महीनों के बजाय सिर्फ 5-7 सप्ताह में मिट्टी में स्थानांतरित करने के लिए तैयार होते हैं। इस लेख का उद्देश्य एक में गहराई से वर्णन और विधि का प्रदर्शन प्रदान करने के लिए है, एक प्रयोगशाला में आसान प्रतिकृति के लिए अनुमति आम तौर पर सबसे अकादमिक संस्थानों में पाया ।
मक्का परिवर्तन के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक कॉलस ऊतक का उत्पादन करने के लिए अपरिपक्व जाइगोटिक भ्रूण को अलग करने के प्रतिमान का पालन करते हैं, जो उपजाऊ पौधों में पुनर्जीवित होता है4,6। हालांकि यह प्रभावी है, कॉलस आधारित प्रोटोकॉल समय लेने वाला हो सकता है, और अक्सर ऊतक संस्कृति प्रक्रिया के लिए पौधों का उत्पादन करने में 3 महीने तक का समय लगता है। क्या यहां प्रस्तुत विधि महत्वपूर्ण बनाता है कि यह callus मुक्त, कुशल, जल्दी है, और लगभग आधी समय सीमा में T0 पौधों के उत्थान के लिए अनुमति देता है । यह भी कम जीनोटाइप पर निर्भर प्रतीत होता है और इस प्रकार सबसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध inbreds8,11के लिए प्रभावी हो सकता है ।
हालांकि सभी कदमों का प्रभावी ढंग से पालन किया जाना चाहिए, सही विकास मीडिया की तैयारी जरूरी है । विकास मीडिया घटकों को सही चरणों में जोड़ने की जरूरत है, दोनों पूर्व और बाद ऑटोक्लेव, यह सुनिश्चित करने के लिए कि संयंत्र सामग्री रसायनों की उचित एकाग्रता प्राप्त करता है । इससे यह सुनिश्चित होगा कि एंटीबायोटिक ्स जैसे संवेदनशील यौगिक टूट न ें। यह भी महत्वपूर्ण है कि पौधे की सामग्री को प्रत्येक चरण में सही विकास माध्यम पर रखा जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल में संकेत दिया गया है। उचित विकास माध्यम पर सामग्री नहीं रखने से भौतिक मृत्यु हो सकती है। इसके अलावा, बहुत सारे भ्रूण रखने या प्लेटों पर ऊतकों को विकसित करने से बचा जाना चाहिए। जबकि दो बार के रूप में कई ऊतक टुकड़े रखने रसायनों और पेट्री व्यंजन (और यहां तक कि इनक्यूबेटर अंतरिक्ष) की लागत को बचा सकता है, भीड़ प्लेटों में ऊतक के विकास को गंभीरता से बाधित किया जा सकता है । संक्रमण को अंजाम देते समय यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि एग्रोबैक्टीरियम निलंबन का ऑप्टिकल घनत्व उपयुक्त हो। यदि बैक्टीरियल निलंबन घनत्व बहुत कम है, तो उचित संक्रमण नहीं हो सकता है।
परिवर्तन प्रोटोकॉल में सफलता के लिए सामग्री शुरू करने की गुणवत्ता आवश्यक है। भ्रूण विच्छेदन के लिए उपयोग किए जाने वाले कान स्वस्थ होने चाहिए, जिसका अर्थ है कि उन्हें पैदा करने वाला पौधा स्वस्थ है। उनके पास पर्याप्त बीज सेट होना चाहिए और कीट-और रोग मुक्त होना चाहिए। साथ ही पुराने एग्रोबैक्टीरियम का भी इस्तेमाल नहीं करना चाहिए। “मां” थाली 2 सप्ताह से अधिक पुरानी नहीं होनी चाहिए। इस बिंदु के बाद, एक नई “मां” थाली नए प्रयोगों को शुरू करने के लिए लकीर होनी चाहिए ।
हालांकि इस विधि को जीनोटाइप पर निर्भर कम दिखाया गया है, लेकिन यह नहीं माना जा सकता कि सभी लाइनें समान रूप से सफल होंगी। अभी भी लाइनों के बीच भिन्नता के साथ-साथ उपयोग किए जा रहे निर्माण के आधार पर सफलता में अंतर हो सकता है। अपरिपक्व भ्रूण के साथ काम करते समय कान से कान परिवर्तनशीलता भी अपरिहार्य है, इसलिए आदर्श प्रयोगों को इसके लिए कई कानों का उपयोग करना चाहिए। इस काम में, inbred W22 ने ~ 14% से अधिक परिवर्तन आवृत्ति के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया, इसके बाद B73 और Mo17 (~ 4% प्रत्येक) । लोव एट अल8 B73 और Mo17 परिवर्तन के लिए QuickCorn प्रोटोकॉल का उपयोग कर की सूचना दी । इस काम में, परिवर्तन आवृत्तियों B73 के लिए 9%-50% से लेकर और Mo17 के लिए 15%-35% ।
इस काम में मनाए गए B73 और Mo17 के लिए कम परिवर्तन आवृत्तियों के लिए एक संभावना मौसमी कान की गुणवत्ता में उतार-चढ़ाव के लिए जिम्मेदार हो सकती है। इस काम और लोव एट अल के बीच एक और अंतरयह है कि यहां विभिन्न वेक्टर निर्माण का उपयोग किया गया था। लोव के काम में, रूपांतरित पौधों से मॉर्फोजेनिक जीन नहीं हटाए गए बल्कि बाद के चरणों में विकासपूर्वक खामोश हो गए । इस काम में संक्रमण के 8 दिन बाद मॉर्फोजेनिक जीन को हटा दिया गया। यह संभव है कि B73 और Mo17 दैहिक भ्रूण के विकास के लिए Bbm/Wus2 की एक लंबी उपस्थिति की आवश्यकता हो सकती है ।
इस विधि का उपयोग करके, गैर-ट्रांसजेनिक एस्केप प्लांट, मल्टीमेरिक सम्मिलन और अनएक्साइज्ड ट्रांसजीन प्राप्त करने की संभावना है। इन पौधों में एक काफ़ी अलग फेनोटाइप नहीं होगा, इसलिए पीसीआर द्वारा पता लगाने के लिए यह निर्धारित करना आवश्यक है कि कोई संयंत्र ट्रांसजेनिक है या नहीं। इसे पूरा करने के लिए, उत्पादित क्षेत्र के भीतर पीसीआर प्राइमर और उत्पादित क्षेत्र को फ्लैंक करने वाले प्राइमर को नियोजित किया जा सकता है। कई स्वतंत्र परिवर्तनों को भी एक ही अपरिपक्व भ्रूण से पौधों का उत्पादन कर सकते हैं, कुल स्वतंत्र परिवर्तनीय वसूली दर का निर्धारण मुश्किल बना रही है । हमारा मानक प्रत्येक अपरिपक्व भ्रूण से एक पौधे के नमूने के आधार पर एक परिवर्तन दर की गणना करने के लिए किया गया है जो पौधों का उत्पादन करता है और संक्रमित भ्रूण की संख्या से इसे विभाजित करता है। यह विधि लगभग निश्चित रूप से पौधों के रूप में बरामद स्वतंत्र घटनाओं की वास्तविक संख्या को कम आंकती है। एक ही भ्रूण से स्वतंत्र घटनाओं के बीच भेदभाव ट्रांसजीन के आसपास सीमावर्ती क्षेत्रों अनुक्रमण की आवश्यकता है, और यह निषेधात्मक महंगा है और सबसे अनुप्रयोगों के लिए समय लेने वाला होगा; हालांकि, ऐसे मामले हो सकते हैं जिनमें ये डेटा उपयोगी होते हैं।
ऊतक संस्कृति परिवर्तन की यह विधि बहुत प्रभावी साबित हुई है, लेकिन समस्याएं अभी भी हो सकती हैं। यदि पौधे की सामग्री का जवाब नहीं दे रहा है, तो यह संभव है कि विशेष रूप से नस्ल रेखा के साथ एक मुद्दा हो, सुझाव है कि विकास मीडिया संरचना और सबकुलाइजिंग के समय जैसे चरों को समायोजन की आवश्यकता होती है। यदि मूल वेक्टर को बदल दिया जाता है, तो एक अन्य चर उचित वेक्टर डिजाइन और सटीक वेक्टर निर्माण है। imazapyr संवेदनशीलता के साथ मुद्दे भी हो सकते हैं, क्योंकि कुछ लाइनें दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, और सफलतापूर्वक रूपांतरित पौधों को प्राप्त करने के लिए imazapyr की एकाग्रता को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
पिछले 30 वर्षों में, मक्का ऊतक संस्कृति और परिवर्तन प्रोटोकॉल बदल गया है और प्रगति की है; और यह माना जाता है कि इस छोटा प्रोटोकॉल आगे इस प्रगति होगा। यह विधि अकादमिक सेटिंग्स के लिए प्रभावी है क्योंकि यह पारंपरिक तरीकों की तुलना में कम समय लेने वाली है। इसके अलावा, यह उच्च प्रशिक्षित ऑपरेटरों की मांग नहीं करता है, जिससे पारंपरिक तरीकों की तुलना में व्यापक वितरण के लिए इसे अधिक उत्तरदायी बना दिया जाता है। भविष्य में, इस विधि को जीनोम इंजीनियरिंग जैसी नई प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम मक्का अपरिपक्व कान प्रदान करने के लिए Corteva ग्रीनहाउस टीम का शुक्रिया अदा करते हैं, मीडिया बनाने में सहायता प्रदान करने के लिए Corteva मीडिया तैयारी प्रयोगशाला, एग्रोबैक्टीरियम निर्माण के साथ मदद के लिए Corteva से निंग वांग, और सहायता के लिए आयोवा राज्य विश्वविद्यालय से Keunsub ली । इस परियोजना को आंशिक रूप से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन संयंत्र जीनोम अनुसंधान कार्यक्रम अनुदान 1725122 और 1917138 द्वारा केडब्ल्यू को, भविष्य कहनेवाला संयंत्र फेनोमिक्स रिसर्च ट्रेनीशिप प्रोग्राम (नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट डीजेई-1545453) द्वारा जेजेड को, यूएसडीए एनआईएफए हैच परियोजना द्वारा #IOW04341, आयोवा फंड के राज्य द्वारा, और आयोवा राज्य विश्वविद्यालय के क्रॉप बायोइंजीनियरिंग सेंटर द्वारा समर्थित किया गया था।
2,4-D | Millipore Sigma | D7299 | |
6-Benzylaminopurine (BAP) | Millipore Sigma | B3408 | |
Acetosyringone | Millipore Sigma | D134406 | |
Agar | Millipore Sigma | A7921 | |
Aluminum foil | To cover the flask | ||
Ammonium Sulfate | Millipore Sigma | A4418 | |
Analytical balance | To weigh small quantities of chemicals | ||
Autocalve | Primus (Omaha, NE) | PSS5-K | To autoclave media and tools |
Bacterial culture loop (10 µl) | Fisher scientific | 22-363-597 | Collects Agrobacterium from plate to transfer to liquid |
Bactoagar | BD bioscience | 214030 | |
Beakers (1 L, 2 L, 4 L) | To mix the chemicals for media | ||
Benomyl | Millipore Sigma | #45339 | |
Bleach (8.25% Sodium Hypochlorite) | Clorox | For seed sterilization | |
Boric Acid | Millipore Sigma | B6768 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | |
Carbenicillin | Millipore Sigma | C3416 | |
Casein Hydrolysate | Phytotech | C184 | |
Cefotaxime | Phytotech | C380 | |
Conical tube (50 mL) | Fisher scientific | 06-443-19 | Contain liquid medium and Agro suspension |
Cuvette (Semi-micro) | Fisher scientific | 14955127 | To hold liquid for measuring OD |
Dicamba | Phytotech | D159 | |
Digital hygrometer | Checking temperature and humidity for heat treatment | ||
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Millipore Sigma | 324503 | |
Eppendorf tube (2.0 mL) | ThermoFischer Scientific | AM12475 | |
Eriksson's Vitamins | Phytotech | E330 | 1000x in liquid |
Ethanol (70%) | Sterilizing tools and surfaces | ||
Ferrous Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | F8263 | |
Fertilizer, Osmocote Plus 15-9-12 | ICL Specialty Fertilizers (Dublin, OH) | A903206 | Fertilizer |
Flask (2 L) | Pyrex | 10-090E | To autoclave media and tools |
Flats (Standard 1020, open w/holes, 11"W x 21.37"L x 2.44"D) | Hummert International (Earth City, Mo) | 11300000 | Tray to hold soil and pot insert, fits Humidome |
Forceps (fine-tipped and large) | Fine for handling embryos; larger for large plant materials and use as ear holders | ||
Gentamicin | Gold Biotechnologies | G-400 | |
Glass bottle (1 L) | Pyrex | 06-414-1D | To autoclave medium |
Graduated cylinder | To adjust volume of media | ||
Imazapyr | Millipore Sigma | 37877 | |
Incubator, 20 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow mother plate and incubate embryos during Agro infection |
Incubator, 27 °C | Percival Scientific | Model I-36NL | To grow co-cultivation plate and maize embryo culture |
Incubator, 45 °C | Heat shock treatment | ||
Insert TO Standard, pots | Hummert International (Earth City, Mo) | 11030000 | For transplanting plants from rooting to soil, fits flat and Humidome |
Laminar flow hood | Maintains sterile conditions | ||
L-proline | Phytotech | P698 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Millipore Sigma | M1880 | |
Maize inbred seed B73 | U.S National Plant Germplasm | id=47638 | |
Maize inbred seed Mo17 | U.S National Plant Germplasm | id=15785 | |
Maize inbred seed W22 | U.S National Plant Germplasm | id=61755 | |
Manganese Sulfate Monohydrate | Millipore Sigma | M7899 | |
Milli-Q Water purification systems | Millipore sigma | MILLIQ | For tissue culture grade water |
MS Basal Medium | Millipore Sigma | M5519 | |
MS Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | M5524 | |
N6 Basal Salt Mixture | Millipore Sigma | C1416 | |
Paperclips, non-skid | Holding on tassel bags | ||
Peptone | BD bioscience | 211677 | |
Petri dish (100×15 mm) | Fisher scientific | FB0875713 | For bacteria culture medium |
Petri dish (100×25 mm) | Fisher scientific | FB0875711 | For the plant tissue culture medium |
pH meter | Fisher scientific | AB150 | To adjust pH of media |
Pipette (1 mL) | ThermoFischer Scientific | 4641100N | |
Plastic Boxes | The Container Store | 10048430 | For tissue culture storage and incubation |
Plastic humidy dome (Humi-Dome) | Hummert International (Earth City, Mo) | 14385100 | Plastic cover for soil flat |
Potassium Iodide | Millipore Sigma | 793582 | |
Potassium Nitrate | Millipore Sigma | P8291 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Millipore Sigma | P5655 | |
Scale | To weigh chemicals for media | ||
Scalpel Blade (No. 11, 4 cm) | Thermo Scientific | 3120030 | remove the top of the kernel crowns for embryo dissection |
Scalpel handle | Holding scalpel blades | ||
Schenk & Hildebrandt Vitamin (S&H vitamin) | Phytotech | S826 | 100x powder |
Scissors | Cutting ear shoots | ||
Shoot bag (Canvasback- semi-transparent) | Seedburo (Des Plaines, IL) | S26 | Semi-transparent bag to cover ear shoots |
Silver Nitrate | Millipore Sigma | S7276 | |
Sodium Molybdate Dihydrate | Millipore Sigma | M1651 | |
Soiless substrate LC1 | SunGro Horticulture (Agawam, Ma) | #521 | For growing maize plants |
Spatula (Double Ended Micro-Tapered) | Fischer Scientific | 2140110 | Dissecting embryos from kernels |
Spatula (with spoon) | Fisher scientific | 14-375-10 | To measure chemicals for media |
Spectinomycin | Millipore Sigma | S4014 | |
Spectrophotometer (Genesys 10S UV-Vis) | Thermo Scientific | 840-300000 | Measure OD of Agro suspension |
Stirring bar | Fisher scientific | 14-513-67 | To mix media |
Stirring hotplates | To mix media | ||
Syringe (without needle, 60 mL) | Fisher scientific | 14-823-43 | For filter sterilization |
Syringe filter (0.22 µm) | Fisher scientific | 09-720-004 | For filter sterilization |
Tassel bag (Canvasback- brown) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514 | Bag to cover tassels of non-transgenic plants |
Tassel bag (Canvasback-green stripe) | Seedburo (Des Plaines, IL) | T514G | Bag to cover tassels of transgenic plants |
Thiamine HCl | Phytotech | T390 | |
Thidiazuron | Phytotech | T888 | |
Thymidine | Millipore Sigma | T1895 | |
Timentin | Phytotech | T869 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | Cas #9005-64-5 | surfactant |
Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI0236 | Homogenizes liquids (Agro suspension) |
Water bath (large – Precision model 186) | Fisher scientific | any that can fit 4+ 2L flasks and reach 55 °C | Keeps autoclaved media at optimal temperature |
Weigh dish | Fisher scientific | 08-732-112 | To measure chemicals for media |
Weighing paper | Fisher scientific | 09-898-12A | To measure chemicals for media |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP14222 | |
Zeatin | Millipore Sigma | Z0164 |