Summary

基于内显微镜的方法,用于评估肠道渗透性和上皮细胞脱落性能

Published: December 03, 2020
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Summary

利用病毒内显微镜,这里介绍的方法使活体动物的肠道上皮细胞脱落的实时可视化。因此,麻醉小鼠的局部染色肠道粘膜(acriflavine 和 rhodamineB-dextran)使用共和显微镜被成像为单细胞分辨率。

Abstract

使用共体成像对肠道进行病毒内显微镜,可以实时观察活体动物的上皮细胞脱落和屏障泄漏。因此,麻醉小鼠的肠道粘膜被局部染色,并染色有非特异性染色(acriflavine)和荧光示踪剂(rhodamine-B dextran),安装在盐水溶液冲洗板上,并使用共和显微镜直接成像。该技术可以补充其他非侵入性技术,以识别肠道渗透性泄漏,如口头管理的示踪剂的跨粘膜通道。除此之外,这里介绍的方法允许实时直接观察细胞脱落事件。与适当的荧光记者小鼠结合,这种方法适用于将光分入控制肠道上皮细胞挤出的细胞和分子机制,以及其他生物过程。过去几十年,使用病毒内显微镜进行有趣的研究有助于了解内皮渗透性、免疫细胞肠道定位、免疫上皮通信和灯具成分的入侵等。这里提出的协议不仅有助于增进对控制上皮细胞挤出的机制的理解,而且可以作为其他方法的发展的基础,这些方法可以用作工具,以可视化其他高动态细胞过程,即使在其他组织中。在技术限制中,特定组织的光学特性以及选定的成像技术和显微镜配置反过来将决定成像工作距离和采集图像的分辨率。

Introduction

肠道是一个高度专业化的器官,具有严格调节的功能,能够产生冲突过程,即营养和防止有害发光物质。在人体与环境之间,肠道上皮作为物理和免疫屏障,有助于维持肠道1,2的粘平衡。上皮完整性的丧失和紧密结渗透性增加是众所周知的与炎症性肠病(IBD)3,4,5,6。3,4,5,6然后,上皮改变被认为是IBD慢性肠道炎症的原因和辅助放大器。因此,更好地了解IBD患者肠道的早期上皮变化,对于制定恢复上皮完整性的新战略,以便进行可靠的预测和随后预防IBD复发,将具有巨大的价值。

肠道上皮遵循一个复杂和严格监管的周转过程。从墓穴底部,从多能干细胞中提取的端点分化肠道上皮细胞(IECs)向上迁移至维卢斯尖端,在那里老化/受损的细胞被流变到流明7。分裂和细胞挤出之间的平衡能够维持肠道上皮细胞数,避免形成间隙和泄漏,以及上皮细胞的积累,可能导致细胞质量和肿瘤发生,8,9,10。,10尽管上皮细胞脱落在肠道上皮的生理更新中起着关键作用,但有关分子机制推动细胞在维卢斯尖端挤出的知识是有限的。因此,有必要进行基础研究,对上皮细胞脱落所涉及的分子事件序列进行精确描述。

肠道粘膜内不同细胞类型之间的复杂相互作用是了解调节上皮周转和肠道平衡的分子机制的关键。因此,在这种情况下,体内研究比体外和体外方法具有很高的优势。此外,实时成像技术允许描述控制特定现象的事件序列。在这方面,研究高动态过程需要使用优化的高分辨率技术直接观察组织。体内成像技术似乎作为独特的适当工具,用于研究上皮细胞在肠道脱落。

术语”病毒内显微镜”是指利用高分辨率成像技术(多光子或共生显微镜)直接可视化活体动物11内其原生环境内的细胞和组织的实验方法。它支持实时获取体内信息,高达单细胞分辨率,并且与静态或低分辨率方法相比具有明显的优势。内维图显微镜提供补充信息,并克服经典和/或高端技术的一些限制,如组织加工造成的伪影。相比之下,病毒内显微镜的主要局限性是,组织应直接暴露在显微镜下,在大多数情况下,这需要手术。虽然复杂的方法保持活力,并尽量减少图像组织(皮肤折叠室和成像窗口)的影响12,13,,13在大多数情况下,一个简单的皮肤切口执行组织外化(皮肤皮瓣)14。在过去十年中,这些方法为高度动态的过程提供了关键证据,这些进程以前是难以理解的。翻译上,实时成像提供了新的生物学见解干细胞和白细胞,以及癌症传播和转移形成13,16。13,16在临床背景下,内皮镜目前被利用作为癌症17和胃肠道疾病的诊断工具,如IBD18,19;,19而共体马赛克显微镜成为手术20期间的快速病理工具。一起,病毒内显微镜最近已成为生物医学研究和未来在临床应用的宝贵和通用的工具。

内维他微显微镜是在这里实现的肠道上皮泄漏的实时可视化和上皮细胞脱落事件的观察。肠道渗透性泄漏可以通过其他体内非侵入性技术进行识别,例如在血清21中对荧光示踪剂进行口头注射。然而,这种技术不允许直接观察脱落性能,也不允许分离准细胞和跨细胞渗透性。标准示踪剂实验和病毒内显微镜的结合代表了一种合适的方法:i) 识别肠道渗透性中的干扰,ii) 分离准细胞和跨细胞上皮渗透性。除了细胞脱落,体内显微镜与体内荧光标签相结合,使研究其他细胞和分子机制(例如,使用荧光报告小鼠22或在肠道粘膜23 内的其他细胞在细胞脱落过程中紧密结再分配或国际细胞与肠道粘膜23内的其他细胞之间的相互作用)。

此处介绍的方法表示对病毒内显微镜的适应,以便使用共和激光扫描显微镜 (CLSM) 实时观察肠道粘膜。因此,我们使用有条件的敲除小鼠GGTase(Geranylgeranyl转移酶)在肠道上皮细胞(IECs)在(Pggt1bi+IEC 小鼠),因为他们患有严重的肠道疾病和增加上皮渗透性24。介绍了小鼠的手术准备和肠道粘膜的染色,以及用于成像采集和采集后分析的适当设置。该协议可以使未来的研究有助于目前关于肠道上皮细胞脱落动力学和动力学的知识。此外,该协议可以作为各种适应的基础,以研究发生在肠道粘膜表面,甚至在其他组织的其他现象。

Protocol

以下议定书已获埃尔兰根(德国维尔茨堡雷吉隆·冯·翁特弗兰肯)相关地方当局批准。老鼠被安置在特定的无病原体条件下。 注:在IECs内抑制GGTase-中压的预膜抑制会导致 Pggt1bi+IEC 小鼠24肠道渗透性严重改变。因此,此鼠标模型用于演示该协议如何可用于研究肠道屏障缺陷。但是,此协议可用于研究任何其他鼠标行。 1. 手…

Representative Results

此处介绍的协议描述了一种基于病毒内显微镜的方法,用于可视化肠道上皮泄漏并实时观察肠道中的细胞脱落性能。简单地说,小鼠麻醉和提交手术准备,以暴露小肠粘膜的表面。然后,通过局部应用 acriflavine 来染色 IECs;而发光的罗达明B-dextran被用作示踪剂,以检测从流明到亚上皮空间的透气通道。因此,手术准备和麻醉小鼠被放置在安装在培养皿中的幻灯片上,并随着…

Discussion

虽然技术上具有挑战性,但基于病毒内显微镜的方法代表了一种独特的实验方法,可以实时可视化高动态细胞过程,例如细胞脱落性能。到目前为止,还没有其他的实验方法来可视化体内的细胞挤出。我们相信,该协议有助于描述不同的细胞过程在维持肠道平衡方面发挥作用。

利用病毒内显微镜,这里介绍的方法使活体动物的肠道上皮细胞脱落的实时可视化。因此,麻醉小?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

导致这些结果的研究得到了《人民方案》(玛丽居里行动)根据欧洲联盟第七框架方案第302170号《REA赠款协定》(FP7/2007-2013)提供的资金;埃尔兰根-纽伦堡大学跨学科临床研究中心( IZKF);合作研究中心TRR241和德国研究理事会(DFG)的临床研究组KFO257;和 Dfg 。

Materials

Acriflavine hydrochloride Sigma Aldrich A8251 1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad BrainTree B-DP-PAD
Gemini Cautery System BrainTree B-GEM-5917
Ketamin WDT 9089.01.00
LAS X Leica
LSM microscope SP8 Leica
PBS Biochrom L182
Rhodamine B dextran Invitrogen D1824 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS) Fine Science Tools 11203-23
Straight fine scissors Fine Science Tools 14060-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648 50 mg/mL in ethanol
Xylazin Bayer 1320422

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Martínez-Sánchez, L. D., Pradhan, R., Ngo, P. A., Erkert, L., Becker, L. S., Watson, A. J., Atreya, I., Neurath, M. F., López-Posadas, R. An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance. J. Vis. Exp. (166), e60790, doi:10.3791/60790 (2020).

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