Summary
Die Korrektur chromatischer Verschiebungen in dreidimensionalen (3D) mehrfarbigen Fluoreszenzmikroskopiebildern ist für quantitative Datenanalysen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um chromatische Verschiebungen in biologischen Proben durch Erfassung geeigneter Referenzbilder und Verarbeitung mit der Open-Source-Software Chromagnonzu messen und zu korrigieren.
Abstract
Die quantitative mehrfarbige Fluoreszenzmikroskopie beruht auf der sorgfältigen räumlichen Abgleich von Farbkanälen, die bei unterschiedlichen Wellenlängen erfasst werden. Aufgrund der chromatischen Aberration und der unvollkommenen Ausrichtung von Kameras können die in jedem Kanal aufgenommenen Bilder verschoben und vergrößert sowie in einer der drei Dimensionen relativ zueinander gedreht werden. Mit der klassischen Kalibrierungsmethode werden chromatische Verschiebungen durch mehrfarbige Perlen gemessen, die an der Oberfläche eines Deckblatts befestigt sind, und es stehen eine Reihe von Software zur Verfügung, um die chromatischen Verschiebungen von solchen Kalibrierproben zu messen. Chromatische Aberration kann jedoch mit der Tiefe variieren, sich mit Beobachtungsbedingungen ändern und durch die biologische Probe selbst induziert werden, wodurch die Bestimmung der tatsächlichen Menge der chromatischen Verschiebung in der Interessenprobe und über das Volumen behindert wird. Die Korrektur chromatischer Verschiebungen mit höherer Genauigkeit ist besonders für die hochauflösende Mikroskopie relevant, bei der nur leichte chromatische Verschiebungen quantitative Analysen beeinflussen und die Interpretation von mehrfarbigen Bildern verändern können. Wir haben eine Open-Source-Software Chromagnon und begleitende Methoden entwickelt, um 3D-Chromatische Verschiebungen in biologischen Proben zu messen und zu korrigieren. Hier stellen wir ihnen ein detailliertes Anwendungsprotokoll zur Verfügung, das spezielle Anforderungen an die Probenvorbereitung, Datenerfassung und Softwareverarbeitung zur Messung chromatischer Verschiebungen in biologischen Proben von Interesse enthält.
Introduction
Multicolor Imaging ist einer der grundlegenden Aspekte der biologischen Fluoreszenzmikroskopie, in Fällen, in denen die räumliche Beziehung verschiedener Moleküle oder Strukturen von großem Interesse ist. Chromatische Aberration, eine optische Aberration von polychromatischem Licht, die durch Dispersion verursacht wird, verändert die scheinbare Position der farbigen Objekte von Interesse. In ähnlicher Weise weisen Mikroskope, die mit mehreren Kameras ausgestattet sind, die sich der Erfassung jeder Farbe widmen, komplexere chromatische Verschiebungen aufgrund von Unterschieden in optischen Elementen und einer unvollkommenen Ausrichtung zwischen den Kanälen auf. Daher können solche chromatischen Verschiebungen zu einer falschen Schlussfolgerung führen, es sei denn, der Benutzer korrigiert sie ausdrücklich. Obwohl chromatische Verschiebungen kein großes Problem waren, solange die Auflösung der Mikroskopie durch die klassische Auflösungsgrenze begrenzt ist, hat die jüngste Entwicklung der Superauflösungsmikroskopie1 die Notwendigkeit einer genaueren Korrektur von Chromatischen Verschiebungen veranlasst.
Es ist eine gängige Praxis, chromatische Verschiebungen von Mikroskopsystemen mit einem mehrfarbigen Perlenkalibrierungsschlitten2zu messen. Das auf Perlen basierende Kalibrierverfahren eignet sich zur Messung chromatischer Verschiebungen von der gesamten Optik des Mikroskops zur Oberfläche des Coverslip2. Diese Methode ist jedoch nicht in der Lage, chromatische Verschiebungen in den biologischen Proben von Interesse zu messen. Es ist wichtig zu beachten, dass viele biologische Proben dreidimensional (3D) sind, und die chromatischen Verschiebungen solcher Proben unterscheiden sich von denen an der Oberfläche des Abdeckzettels. Darüber hinaus ändern sich chromatische Verschiebungen mit bildgebenden Bedingungen2,3. Wir haben die chromatischen Verschiebungen in biologischen 3D-Proben gemessen und festgestellt, dass die Unsicherheit chromatischer Verschiebungen oft bis zu 350 nm durch die klassische Multicolor-Perlen-Kalibrierungsmethode3betrug. Daher müssen chromatische Verschiebungen in biologischen Proben in der Tiefe des Interesses und unter den verwendeten bildgebenden Bedingungen gemessen werden.
Hier beschreiben wir Verfahren zur Messung chromatischer Verschiebungen in biologischen Proben und korrigieren diese Verschiebungen mit unserer Software Chromagnon3. Um chromatische Verschiebungen in biologischen Proben zu messen, verwendet unsere Methode zwei Arten von Datensätzen, ein "Ziel"-Bild und ein "Referenzbild". Das "Zielbild" ist ein mehrfarbiges Bild von Interesse, zum Beispiel Bilder für DNA, Kernhülle und Mikrotubuli gefärbt. Es ist oft unmöglich, chromatische Verschiebungen in einem solchen Bild zu messen. Daher benötigen wir ein "Referenzbild", das zur Messung der chromatischen Verschiebungen in der Probe gewidmet ist. Die einzige Definition eines "Referenzbildes" ist ein mehrfarbiges Bild desselben Objekts. In diesem Sinne ist ein mehrfarbiges Perlenbild auch eine Art Referenzbild. Hier beschreiben wir drei verschiedene Arten von Referenzbildern, die zur Messung chromatischer Verschiebungen in den biologischen Proben verwendet werden: "Crosstalk-Referenzbilder", "helle Feld-Referenzbilder" und "biologische Kalibrierreferenzbilder". Die Art des Referenzbildes hängt von der Art des verwendeten Mikroskops oder der erforderlichen Korrekturgenauigkeit ab, wie in Tabelle 1zusammengefasst.
| Übersprechen | Hellfeld | Biologische Kalibrierung (auf einem anderen Dia) | Biologische Kalibrierung (auf demselben Dia) | |
| Genauigkeita | +++ | + | ++b | +++ |
| Einfachheit | ++ | +++ | ++ | ++ |
| Anwendbare Mikroskopie | Weitfeld | Weitfeld | Alle | Alle |
| Verfügbarkeit der lokalen Ausrichtung | + | + | -c | -c |
|
a: Die Anzahl der "+" zeigt eine steigende Bewertung an. Single plus ist etwa 50 nm und drei plus ist etwa 15 nm in 3D. b: Die Genauigkeit hängt davon ab, wie stark die variablen Bildbedingungen konstant gehalten werden. c: Die lokale Kalibrierung, die mit mehrfarbigen Perlenproben gemessen wird, kann wie in Protokollabschnitt 4 beschrieben kombiniert werden. |
||||
Tabelle 1: Parameter bei der Auswahl des Typs der Referenzbilder.
"Crosstalk-Referenzbilder" haben die höchste Korrekturgenauigkeit und sind relativ einfach zu erreichen3,4 ( Tabelle1). Der Nachteil ist ihre Beschränkung in Mikroskopie-Anwendungen aufgrund ihrer Unfähigkeit, chromatische Verschiebungen in Anregungswegen zu messen. Um solche Bilder zu erhalten, sollte das Mikroskop auch mit mehrbandigen dichroitischen Spiegeln und Emissionsfiltern ausgestattet sein, die unabhängig von den Anregungsfiltern oder Lichtquellen gesteuert werden. Die geeignete Mikroskopie umfasst die konventionelle Weitfeldmikroskopie, die Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie/stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (PALM/STORM)5,6 und die Erweiterungsmikroskopie7, die mit der Weitfeldmikroskopie beobachtet wurde. Ein Crosstalk-Referenzbild wird aus der Zielprobe selbst erfasst. Es ist ein Bild der Crosstalk (durchbluteicht) Fluoreszenz eines Farbstoffs in allen erforderlichen Kanälen erhalten. Die Fluoreszenzemission dehnt sich immer auf die längeren Wellenlängen aus, daher werden Farbstoffe mit der kürzesten Emissionswellenlänge angeregt, um eine Crosstalkfluoreszenz in Kanälen mit längeren Wellenlängen zu erhalten. Wenn die Probe beispielsweise mit Blau, Grün und Rot gefärbt ist, wird nur der blaue Farbstoff angeregt, und das Emissionslicht wird in den blauen, grünen und roten Kanälen erhalten. In diesem Protokoll wurde DNA, die mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) gefärbt wurde, verwendet, um Übersprechenfluoreszenz zu erhalten.
"Helle Feld-Referenzbilder" sind eine einfachere und weniger fototoxische Alternative zu "Crosstalk-Referenzbildern", sind aber die am wenigstengenauen 3 (Tabelle 1). Dabei handelt es sich um helle Feldbilder des Zielbeispiels, die in allen Farbkanälen erfasst werden, die im Zielbild verwendet werden.
"Biologische Kalibrierreferenzbilder" haben den Vorteil, dass sie auf jede Art von Mikroskopie anwendbar sind, da sie die chromatischen Verschiebungen sowohl in den Anregungs- als auch in den Emissionspfaden3,8 ( Tabelle1) messen können. Geeignete Mikroskopie umfasst Weitfeldmikroskopie, konfokale Mikroskopie, Lichtbogenmikroskopie, stimulierte Emissionserschöpfung (STED)9, strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM)10, Airyscan/SORA11,12, SMLM beobachtet mit der gesamten internen Reflexionfluoreszenz (TIRF) Modus, Olympus Superauflösung (OSR)13, und so weiter. Ein biologisches Kalibrierreferenzbild wird aus einer Kalibrierprobe entnommen, die ähnlich wie die Zielprobe erstellt wurde, jedoch mit Färbung einer einzelnen Struktur mit mehreren Farben. Die Korrekturgenauigkeit übertrifft die Auflösung der meisten hochauflösenden Mikroskopie und die Vorbereitung einer biologischen Kalibrierprobe kann relativ einfach sein. Ein weiterer Vorteil ist die Verfügbarkeit, mehrere Referenzbilder zu "durchschnittlich" zu erstellen. Obwohl die einzelnen Bilder schlechte Informationen für die Messung chromatischer Verschiebungen enthalten, kann der Informationsgehalt durch die Mittelung mehrerer Bilder erhöht werden. Die Genauigkeit hängt davon ab, wie sehr die bildgebenden Bedingungen konstant gehalten werden. In dieser Hinsicht wird die beste Leistung erzielt, wenn sich sowohl Ziel- als auch Referenzproben auf demselben Dia befinden, z. B. mit 8-well-kammerierten Deckgläsern(Tabelle 1, rechts-am). In diesem Protokoll wurde Actin mit drei Farben von Phalloidin gefärbt wurde als biologische Kalibrierung verwendet.
Sobald ein Referenzbild erhalten ist, wird die chromatische Verschiebung von unserer Software Chromagnongemessen und korrigiert. Es gibt keine Begrenzung der Anzahl der Kanäle, Z-Abschnitte und Zeitrahmen, für die Chromagnon die chromatischen Verschiebungen messen und korrigieren kann. Chromagnon misst chromatische Verschiebungen in zwei Schritten. Der erste Schritt erfasst die "globalen" oder "affine" Ausrichtungsparameter der Übersetzung in den X-, Y-, Z-Achsen, die Vergrößerung entlang der X-, Y-, Z-Achse und die Drehung um die Z-Achse. Die Berechnungsgenauigkeit der globalen Ausrichtung beträgt 16 nm in 3D und 8 nm in 2D. Der zweite Schritt ist eine optionale iterative 2D-Ausrichtung auf projizierten Bildern, um eine höhere Genauigkeit zu erzielen. Im lokalen Ausrichtungsprozess werden die Bilder in mehrere Regionen unterteilt und chromatische Verschiebungen in diesen lokalen Regionen gemessen. Anschließend werden die Bereiche weiter geteilt und chromatische Verschiebungen in den Subregionen iterativ gemessen, bis die Anzahl der Pixel in der Region die minimale Anzahl von Pixeln (in der Regel 60 x 60 Pixel) erreicht. Die resultierende lokale Ausrichtungszuordnung wird mit dem globalen Ausrichtungsparameter kombiniert und durch eine elastische Transformation auf das Zielbild angewendet. Nach diesem Schritt wird die Berechnungsgenauigkeit auf 14 nm in 3D und 6 nm in 2D verbessert. Die lokale Ausrichtung eignet sich nicht für biologische Kalibrierreferenzbilder, da sich die biologische Struktur in der Referenz von der im Ziel unterscheidet (Tabelle 1). Daher wird nur die globale Ausrichtung für biologische Kalibrierreferenzbilder verwendet.
Die lokalen chromatischen Verschiebungen stammen aus zwei Quellen; Instrumente der lokalen Verzerrung und der biologischen strukturellen Inhomogenität. Da die instrumentelle lokale Verzerrung des Mikroskops konstant ist, kann dies anhand der referenzierten Referenzprobe der mehrfarbigen Perlen gemessen und als fester Parameter korrigiert werden. Chromagnon kann die instrumentelle lokale Verzerrungskarte des Mikroskops und die globalen Ausrichtungsparameter aus den biologischen Kalibrierungen kombinieren (Tabelle 1). Bei dieser Methode wird erwartet, dass die durchschnittliche Genauigkeit der biologischen Kalibrierung um zusätzliche 1 x 2 nm verbessert wird.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Korrektur der chromatischen Verschiebungen von 3D-Fluoreszenzbildern mit unserer Software Chromagnon, vom einfachsten Low-End bis zur höchsten Genauigkeit. Wir verwenden die Immunfärbung von HeLa-Zellen als Beispiel und beobachten sie mittels 3D-Weitfeldmikroskopie und 3D-SIM. Im ersten Abschnitt wird beschrieben, wie Zielproben und biologische Kalibrierproben vorbereitet werden. Dieser Teil des Protokolls sollte für die spezifischen Forschungsziele optimiert werden. Im zweiten Abschnitt beschreiben wir die Erfassungsmethoden für drei Arten von Referenzbildern durch Mikroskope. Die Annahme war, blaue, grüne und rote Kanäle zu erhalten, aber die Kanalzusammensetzung sollte durch die spezifischen Ziele der Forschung und durch die Einstellungen des Mikroskops geändert werden. Dabei spielt es keine Rolle, ob das Mikroskop mit einer einzelkamera oder mehreren Kameras ausgestattet ist. Im dritten Abschnitt beschreiben wir, wie man mit unserer Software chromatische Verschiebungen des Zielbildes mithilfe von Referenzbildern messen und korrigieren kann. Schließlich beschreiben wir im vierten Abschnitt eine Methode zur Ergänzung der biologischen Kalibrierreferenzbilder durch die instrumentelle lokale Kalibrierung eines Mikroskops.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Erstellung einer Zielprobe
- Samen 2,5 x 105 HeLa-Zellen auf einer 35-mm-Glasbodenschale und wachsen sie in 2 ml Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Adlermedium mit L-Glutamin und Natriumpyruvat, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum [FBS]) bei 37 °C und einerCO2-Konzentration von 5%. Alternativ können 6 x 104 HeLa-Zellen auf einem 8-Well-Kammer-Deckglas eingesetzt werden und in 0,5 ml Wachstumsmedium bei 37 °C und einerCO2-Konzentration von 5% wachsen. Verwenden Sie #1.5-Abdeckungsglas (mit einer Dicke von 0,170 mm) für die hochauflösende Mikroskopie.
ANMERKUNG: Verwenden Sie für das 8-Well-Kammer-Abdeckungsglas 1/4 Bände für weitere Schritte mit Ausnahme der Schritte 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 und 1.2.5, wobei das Volumen unabhängig von der Art des Behälters 100 l beträgt. - Nach ca. 24 h Inkubation die Lösung durch 2 ml 3,7% Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) ersetzen. Nach dem sanften Mischen weiterhin Zellen für 15 min bei Raumtemperatur (RT) auf einer Rotationsplattform fixieren.
VORSICHT: Arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube. - Waschen Sie Zellen mit 2 ml PBS, 3x je für 5 x 10 min auf einer Rotationsplattform.
HINWEIS: Befolgen Sie die örtlichen Vorschriften zur Entsorgung von Formaldehydabfällen. - Permeabilisieren Sie Zellen mit 2 ml 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min auf einer Rotationsplattform, gefolgt von drei Waschungen mit 2 ml PBS, jeweils für 5 x 10 min auf einer Rotationsplattform.
- Inkubieren Sie Zellen in 100 l von 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 1 h bei RT auf einer Rotationsplattform.
- Ersetzen Sie die Lösung durch 100 l einer Mischung von Primärantikörpern (Antiemerin-Polyklonalantikörper14 und Monoklonaler Antitubulin-Antikörper15) in 1% BSA in PBS bei entsprechenden Verdünnungen (1/500 für Anti-Emerin und 1/100 für Anti-Tubulin) und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie Zellen mit 2 ml PBS, je 3x 5x für 10 min auf einer Rotationsplattform.
- Ersetzen Sie die Lösung durch 100 l einer Mischung aus sekundären Antikörpern (Anti-Kaninchen-IgG mit Alexa Fluor 488 und Anti-Maus-IgG mit Alexa Fluor 555) in 1% BSA in PBS bei 1/500 Verdünnung, und inkubieren für 3 x 4 h bei RT.
- Waschen Sie Zellen mit 2 ml PBS, je 3x 4x für 5 min auf einer Rotationsplattform.
- Ersetzen Sie die Lösung durch 2 ml 0,5 g/ml DAPI in PBS, um DNA für 30 min bei RT auf einer Rotationsplattform zu färben.
HINWEIS: Anstelle von DAPI kann auch Hoechst 33342 bei gleicher Konzentration verwendet werden. - Ersetzen Sie die Lösung durch das Montagemedium mit einem Anteil von 100 l (Materialtabelle).
- Samen 2,5 x 105 HeLa-Zellen auf einer 35-mm-Glasbodenschale und wachsen sie in 2 ml Wachstumsmedium (Dulbeccos modifiziertes Adlermedium mit L-Glutamin und Natriumpyruvat, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum [FBS]) bei 37 °C und einerCO2-Konzentration von 5%. Alternativ können 6 x 104 HeLa-Zellen auf einem 8-Well-Kammer-Deckglas eingesetzt werden und in 0,5 ml Wachstumsmedium bei 37 °C und einerCO2-Konzentration von 5% wachsen. Verwenden Sie #1.5-Abdeckungsglas (mit einer Dicke von 0,170 mm) für die hochauflösende Mikroskopie.
- Vorbereitung einer biologischen Kalibrierprobe
- Bereiten Sie feste Zellen vor, wie in den Schritten 1.1.1-1.1.4 beschrieben.
HINWEIS: Vorzugsweise werden Proben auf einem kammerförmigen Deckglas vorbereitet, um sowohl die Ziel- als auch die Referenzproben in getrennten Kammern auf demselben Deckzettel zu platzieren(Tabelle 1, rechts-am). Diese Vorbereitung ist vorzuziehen, wenn das Experiment die höchste Korrekturgenauigkeit erfordert. Wenn die Probe auf einem regelmäßigen Deckblatt vorbereitet werden muss, verwenden Sie Präzisionsabdeckungen mit geringer Dickenvariation ("Nr. 1.5H"), um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. - Bereiten Sie die Lagerlösung von fluoreszierendem, farbkonjugiertem Phalloidin in 1,5 ml Methanol vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Phalloidin-Stammlösung in PBS bei folgender Verdünnung mischen: 1/100 für Phalloidin mit Alexa Fluor 405, 1/1.000 für Phalloidin mit Alexa Fluor 488 und 1/200 für Phalloidin mit Alexa Fluor 594.
- Ersetzen Sie die Lösung durch 1 ml des in Schritt 1.2.2 hergestellten Phalloidin-Gemischs und inkubieren Sie 30 min bei RT auf einer Rotationsplattform.
- Waschen Sie Zellen mit 2 ml PBS, je 3x 5x für 10 min auf einer Rotationsplattform.
- Ersetzen Sie die Lösung durch ein Montagemedium mit einem Anteil von 100 l.
HINWEIS: Die Kalibrierproben können bei 4 °C oder -20 °C zur wiederholten Verwendung gelagert werden.
- Bereiten Sie feste Zellen vor, wie in den Schritten 1.1.1-1.1.4 beschrieben.
2. Erfassung von Referenzbildern
- Crosstalk-Referenzbilder
- Stellen Sie die in Schritt 1.1 vorbereitete Zielprobe auf ein Weitfeldmikroskop.
- Erfassen Sie ein Fluoreszenzbild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen.
HINWEIS: Bei 3D-Bildern kann sich die Z-Schrittgröße im Referenzbild von der im Zielbild unterscheiden, solange die Bilddatei Informationen über die Schrittgröße enthält. Die Z-Schrittgröße für Referenz- und Zielbilder beträgt vorzugsweise weniger als die Hälfte der optischen Auflösung der Z-Achse, die
durch eine beugungsbegrenzte Mikroskopie berechnet wird, wobei die Wellenlänge in Nanometern und NA die numerische Blende der Objektivlinse ist. Wenn die axiale Auflösung beispielsweise 550 nm beträgt, verwenden Sie einen Z-Schritt kleiner als 275 nm. Für das Referenzbild ist keine Zeitreihe erforderlich. - Wählen Sie anschließend das Anregungslicht nur für DAPI aus, um ein Fluoreszenzbild der Referenz zu erhalten, und wählen Sie es in blauen, grünen und roten Kanälen aus. Erfassen Sie das Referenzbild genau an der gleichen Bühnenposition und Z-Höhe, im Falle eines 3D-Stacks.
HINWEIS: Für längere Emissionswellenlängen sind eine erhöhte Beleuchtungsintensität und Belichtungszeit erforderlich.
- Helle Referenzbilder
- Stellen Sie die in Schritt 1.1 vorbereitete Zielprobe auf ein Weitfeldmikroskop.
- Erfassen Sie ein Fluoreszenzbild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen.
HINWEIS: Die Z-Schrittgröße erfüllt vorzugsweise das Inschritt 2.1.2 beschriebene Nyquist-Kriterium. - Erfassen Sie ein helles Feldbild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen genau an der gleichen Bühnenposition wie in 2.2.2 und der gleichen Z-Höhe bei einem 3D-Stack.
- Biologische Kalibrierreferenzbilder
- Stellen Sie die in Schritt 1.1 vorbereitete Zielprobe auf ein 3D-SIM-Mikroskop.
- Erwerben Sie ein Fluoreszenzbild des Ziels in blauen, grünen und roten Kanälen per 3D-SIM. Rekonstruieren Sie das super aufgelöste Bild.
HINWEIS: Der Typ des Mikroskops kann von jedem Typ sein, wie 3D-SIM, konfokale, STED, etc. Z-Schrittgröße erfüllt vorzugsweise das Inschritt 2.1.2 beschriebene Nyquist-Kriterium. - Erfassen Sie mehrere Fluoreszenzbilder der Referenz, die in Schritt 1.2 in verschiedenen Stufenpositionen ähnlich dem Zielbild (Schritt 2.3.2) von 3D-SIM erstellt wurden. Rekonstruieren Sie die super aufgelösten Bilder.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Pixel in XY muss in allen Referenzbildern gleich sein. Die Schrittgröße in Z muss in allen Referenzbildern gleich sein. Die Gesamtzahl der Z-Abschnitte wird bevorzugt, um die gleiche wie im Zielbild zu sein, aber dies ist keine absolute Anforderung. Die XY-Position auf der Bühne für diese Referenzbilder spielt keine Rolle, da sich die Position oder der Deckslip bereits von der Position der Zielprobe unterscheidet und darüber hinaus der Unterschied in der chromatischen Verschiebung auf einem einzelnen Deckschein weniger als 15 nm3beträgt. Bildgebende Bedingungen wie Objektivlinse, Beobachtungstemperatur, Tauchöl, Lochgröße in der konfokalen Mikroskopie und Neigungswinkel in der hochgeneigten Beleuchtungsmikroskopie16sollten alle der Referenz für die beste Leistung entsprechen. Wenn das Mikroskop mehrere Kameras so ausstattet, dass mehrere Kanäle gleichzeitig erfasst werden, sollten die Referenzbilder so oft wie wöchentlich erfasst werden, um die instrumentale Drift zu korrigieren.
durch eine beugungsbegrenzte Mikroskopie berechnet wird, wobei die Wellenlänge in Nanometern und NA die numerische Blende der Objektivlinse ist. Wenn die axiale Auflösung beispielsweise 550 nm beträgt, verwenden Sie einen Z-Schritt kleiner als 275 nm. Für das Referenzbild ist keine Zeitreihe erforderlich.3. Korrektur der chromatischen Verschiebung mit Chromagnon Software
- Wechseln Sie mit einem Webbrowser zu https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releases, und laden Sie die neueste binäre Version von Chromagnonherunter.
HINWEIS: Binäre Versionen sind für Windows, Mac und einige Linux-Versionen verfügbar. - Extrahieren Sie das Programm und setzen Sie die ausführbare Datei an einem geeigneten Speicherort. Doppelklicken Sie auf einem Windows- oder Mac-Computer auf die Datei, um sie zu öffnen, oder führen Sie die Binärdatei über die Befehlszeile auf einem Linux-System aus.
HINWEIS: Die grafische Benutzeroberfläche wie in Abbildung 1 wird geöffnet. Das Programm kann aus Sicherheitsgründen durch einen Doppelklick zum ersten Mal am Öffnen gehindert werden. Verwenden Sie in diesem Fall die plattformabhängige Methode, um das aus dem Internet heruntergeladene Programm zu öffnen.
Abbildung 1: Ein Screenshot der grafischen Chromagnon-Benutzeroberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Ziehen Und legen Sie die Referenzdateien im "Referenzfeld" (Abbildung 1) ab, oder klicken Sie auf Referenzdateien (Abbildung 1A), um ein Dialogfeld für die Dateiauswahl zu öffnen. Abhängig von den Dateiformaten, wenn das Programm bittet, ein Java Development Kit (JDK) zu installieren, drücken Sie ja und der Benutzer wird zur Download-Seite navigiert. Laden Sie das JDK für das Betriebssystem wie angewiesen herunter und installieren Sie es. Chromagnon sollte in der Lage sein, das Bilddateiformat nach dem Neustart des Programms zu lesen.
HINWEIS: Chromagnon kann die meisten Bilddateiformate lesen (mehrseitige 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv', etc.). Das ursprüngliche Bildformat des Mikroskops wird in diesem Schritt bevorzugt, da Metadaten verloren gehen können, wenn ein Bildformat in eine mehrseitige TIF-Datei konvertiert wird. Wenn der Kanalname als 0, 1, 2 usw. anstelle von Wellenlängen wie 528, 609(Abbildung 2A, grüne Kästchen) angezeigt wird, kennt Chromagnon die Identität der Kanäle im Bild nicht. Stellen Sie in diesem Fall sicher, dass die Reihenfolge der Kanäle und die Pixelgröße in der Referenzdatei mit der Reihenfolge in der Zieldatei übereinstimmen. Wenn z. B. die Reihenfolge der Kanäle in der Referenz grün und rot ist, muss die Reihenfolge der Kanäle im Ziel ebenfalls grün und rot sein, nicht aber rot und grün.
Abbildung 2: Beispiel-Screenshot zum Laden mehrerer Dateien. (A) Ein Fall, in dem alle Referenzbilder die entsprechenden Zielbilder haben. Kanalnamen werden korrekt durch Wellenlängen (angezeigt durch ein grünes Feld) in den in diesem Beispiel verwendeten Bilddateien identifiziert. (B) Ein Fall, in dem ein einzelnes Referenzbild verwendet wird, um mehrere Zielbilder zu korrigieren. (C) Ein Fall, in dem mehrere Referenzbilder (angezeigt durch ein rotes Feld) gemittelt werden und das resultierende Referenzbild nach der Mittelung verwendet wird, um mehrere Zielbilder zu korrigieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Ziehen Sie die Zieldateien in das "Zielfeld" (Abbildung 1) oder klicken Sie auf Zieldateien (Abbildung 1B), um ein Dialogfeld für die Dateiauswahl zu öffnen.
HINWEIS: Wenn es mehrere Zielbilder gibt und jedes von ihnen entsprechende Referenzbilder hat, muss sich das entsprechende Referenzbild und das Zielbild in der gleichen Zeile in den entsprechenden Referenz- und Zielfeldern befinden (Abbildung 2A). Ein einzelnes Referenzbild kann auch verwendet werden, um mehrere Zielbilder auszurichten (Abbildung 2B). - Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zuschneideränder, wenn diese deaktiviert sind (Abbildung 1C).
HINWEIS: Wenn dieses Kontrollkästchen aktiviert ist, werden die aus der Ausrichtung resultierenden Ränder abgeschnitten. Aktivieren Sie diese Option für die allgemeine Verwendung, aber deaktivieren Sie, ob ein Vergleich auf Pixelebene zwischen Bildern vor und nach der Ausrichtung erforderlich ist. - Wählen Sie ein Ausgabebildformat aus der Auswahlliste aus (Abbildung 1D).
HINWEIS: Die verfügbaren Formate sind 'tif' (ImageJ17-Format), 'dv' und 'ome.tif'; Das Format 'ome.tif' ist erst nach der Installation von JDK verfügbar. - Geben Sie das Suffix für den Ausgabedateinamen(Abbildung 1E, der Standardwert ist '_ALN') an, der dem Zieldateinamen hinzugefügt wird.
- Verwenden Sie für Crosstalk-Referenzbilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis die lokale Ausrichtung aus der Auswahlliste der lokalen Ausrichtung (Abbildung 1F), wählen Sie Projektion, um die lokale Ausrichtung zu verwenden, und Keine, um sie zu deaktivieren. Verwenden Sie eine minimale Fenstergröße von 60 (Abbildung 1G).
HINWEIS: Bei Verwendung der lokalen Ausrichtung müssen alle Zielbilder über entsprechende Referenzbilder verfügen (Abbildung 2A). Lokale Ausrichtung wird für biologische Kalibrierreferenzbilder nicht empfohlen, da lokale chromatische Verschiebungen von einer Probe zur anderen variieren (Tabelle 1). Aus dem gleichen Grund kann eine einzelne lokale Ausrichtung nicht auf viele Zielbilder angewendet werden (Abbildung 2B). Ausnahmsweise kann es verwendet werden, wenn sich die Voninteressesprobe nur an der Oberfläche des Coverslipbefindets befindet und das Sichtfeld mit hellen Objekten gefüllt ist, genau wie die mehrfarbigen fluoreszierenden Perlenproben. - Für mehrere biologische Kalibrierreferenzbilder aktivieren Sie die Option "Durchschnittliche Referenzen" (Abbildung 1H), um einen einzelnen Ausrichtungsparameter aus dem gemittelten Bild zu messen, und der Einzelne Ausrichtungsparameter wird dann auf alle Zielbilder angewendet (Abbildung 2C). Wählen Sie Keine für lokale Ausrichtung (Abbildung 1F).
- Klicken Sie auf Alle ausführen (Abbildung 1I), um Messungen zu starten; die Ausrichtungsparameter werden auf die Zielbilder angewendet.
HINWEIS: Nach der Messung chromatischer Verschiebungen von den Referenzdateien, macht das Programm Dateien mit der Erweiterung "chromagnon.csv" oder "chromagnon.tif". Der Typ der Ausgabedatei hängt davon ab, ob die lokale Ausrichtung wirksam ist (Abbildung 1F). Wenn die Ausrichtung ohne lokale Ausrichtung erfolgt, ist die Ausgabe "chromagnon.csv", während, wenn lokale Ausrichtung verwendet wird, die Ausgabe "chromagnon.tif" ist. Die Dateinamen sind identisch mit der Referenzdatei mit Ausnahme des angegebenen Suffixes(Abbildung 1J, der Standardwert ist ohne Suffix) und der Erweiterung ("chromagnon.csv" oder "chromagnon.tif"). Eine detaillierte Beschreibung des Ausrichtungsprozesses finden Sie in der Im selben Ordner erstellten Datei "Chromagnon.log". - Warten Sie, bis das korrigierte Bild im Viewer angezeigt wird (Abbildung 3).
HINWEIS: Wenn Sie das Bild mit der Maus ziehen, wird das Bild verschoben, und das Mausrad wird verschoben. Verschieben Sie den Schieberegler (Abbildung 3A), um den Abschnitt Z (und/oder T falls zutreffend) für die Anzeige zu ändern. Wenn der Viewer zu langsam ist, um ein Bild zu aktualisieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Ganze Daten in den Speicher laden ( Abbildung3B), um den Zugriff auf die Daten auf der Festplatte zu beenden. Durch Ziehen des linken oder rechten Rands von Farbfeldern (Abbildung 3C) können die minimalen oder maximalen Werte für die Anzeige gesteuert werden. Wenn Sie auf die Schaltfläche für jeden Kanal klicken (Abbildung 3D), wechseln Sie zwischen dem Ein- oder Ausblenden des ausgewählten Kanals im Viewer. Mit einem rechtsklickenden Klick auf das Farbfeld (Abbildung 3D) können Benutzer die Farben für die Anzeige auswählen oder die Anzeigeoptionen der Farbleiste ändern, und es ermöglicht Benutzern auch, die genauen minimalen und maximalen Werte für die Anzeigeskalierung anzugeben, indem sie "Skalieren auf ...". Wenn Sie auf die Schaltfläche Orthogonale Ansicht klicken (Abbildung 3E), werden die Bilder der ZY- und XZ-Ansichten angezeigt. Durch Verschieben der Querlinien wird die Position geändert, die in den Seitenansichten angezeigt wird.
Abbildung 3: Ein Screenshot des Bildbetrachters. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Um zu überprüfen, ob die Messung korrekt durchgeführt wurde, ziehen Sie die Referenzbilder in das "Referenzfeld" und das "Zielfeld". Führen Sie das Programm aus, und überprüfen Sie, ob die Bilder perfekt überlappen.
HINWEIS: Wenn verfügbar, können "chromagnon.csv"- oder "chromagnon.tif"-Dateien als Referenzen verwendet werden, um Messungen zu überspringen. Wenn die chromatische Verschiebung des Bildes unkorrigiert bleibt, versuchen Sie es mit Den Lösungen, die in Tabelle 2zusammengefasst sind. - Um auf die Ausrichtungsparameter im Beispiel zuzugreifen oder wenn die Ausrichtungsparameter manuell bearbeitet werden müssen, öffnen Sie "chromagnon.csv"-Dateien direkt mit einem beliebigen Texteditor oder einer Beliebigen Tabelle. Wenn es bearbeitet wird, speichern Sie es als "csv".
HINWEIS: Die Werte sind in Pixeln für "tz", "ty", "tx" und in Grad für "r" und in Vergrößerungsfaktoren für "mz", "my" und "mx".- Alternativ laden Sie eine Datei "chromagnon.csv" oder "chromagnon.tif" in das Feld Referenz oder Ziel von Chromagnon(Abbildung 1),und doppelklicken Sie dann darauf, um den Ausrichtungseditor zu öffnen (Abbildung 4).
- Um zu sehen, wie stark ein Kanal verschoben wird, wenn die Parameter bearbeitet werden, ziehen Sie die Referenzbilddatei in den unteren Bereich (Abbildung 4A), um das Bild im Editor zu öffnen. Beachten Sie beim Bearbeiten der Werte in der Tabelle (Abbildung 4B) und beim Drücken der Eingabe-/Rückgabetaste, wie sich das Bild des entsprechenden Kanals bewegt, wenn sich die Werte geändert haben. Klicken Sie nach der Bearbeitung auf Speichern unter... (Abbildung 4C), um die Änderungen zu speichern.
Abbildung 4: Ein Screenshot eines Ausrichtungsparameter-Editors. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Um die lokale Ausrichtungskarte zu überprüfen, laden Sie die "chromagnon.tif" über das Chromagnon-Referenz- oder Zielfeld (Abbildung 1), und doppelklicken Sie darauf, um den Ausrichtungseditor zu öffnen ( Abbildung4). Klicken Sie auf Ansicht (Abbildung 4D), um die lokale Verschiebung anzuzeigen, die durch Linien angezeigt wird, deren Längen durch den in der Auswahlliste für die Vergrößerung angegebenen Faktor vergrößert werden ( Abbildung4E).
HINWEIS: Durch Angabe der "Originalbilddatei" (Abbildung 4F) werden die Verschiebungen zusammen mit dem Originalbild zugeordnet.
4. Erstellen einer mikroskopspezifischen lokalen Ausrichtungskarte
- Verdünnen Sie 2 l mehrfarbige fluoreszierende Perlen mit einem Durchmesser von 200 nm in 18 l Ethanol.
- Wirbel die Lösung und platzieren Sie 10 l der Perlenlösung in der Mitte einer Glasbodenschale. Stellen Sie sicher, dass #1.5-Abdeckungsglas (mit einer Dicke von 0,170 mm) für die hochauflösende Mikroskopie verwendet wird.
- Lassen Sie das Gericht bei RT für 1 h vollständig trocknen.
- Legen Sie die Schale auf ein zu kalibrierendes Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf die fluoreszierenden Perlen.
- Erhalten Sie 2D- oder 3D-Bilder mit der zu kalibrierenden Mikroskopie. Erhalten Sie mehrere Bilder, indem Sie die Bühnenposition ändern.
- Öffnen Sie die grafische Chromagnon-Benutzeroberfläche.
- Ziehen Und legen Sie die Perlenbilddateien im "Referenzfeld" (Abbildung 1) ab, oder klicken Sie auf Referenzdateien (Abbildung 1A), um ein Dialogfeld für die Dateiauswahl zu öffnen.
- Überprüfen Sie die Option Durchschnittsreferenzen (Abbildung 1H). Wählen Sie aus der Auswahlliste der lokalen Ausrichtung ( Abbildung1F) Projektionaus. Verwenden Sie eine minimale Fenstergröße von 60 (Abbildung 1G). Klicken Sie auf Alle ausführen (Abbildung 1I), um Messungen zu starten.
HINWEIS: Es wird eine Datei ".chromagnon.tif" erstellt, in der die lokale Ausrichtungskarte des Mikroskops gespeichert ist. - Klicken Sie nach der Messung auf Extra-Parameter (Abbildung 1K). Klicken Sie in der lokalen Verzerrung Ihres Mikroskop-Instrumentfelds auf die Auswahlliste und wählen Sie Neu... um einen Dialog zu öffnen. Ziehen Sie die in Schritt 4.8 generierte Datei "chromagnon.tif" in das Dateinamensfeld, und legen Sie sie ab, oder klicken Sie auf Dateitaste auswählen, um ein Dateiauswahldialogfeld zu öffnen. Geben Sie den Namen des Mikroskops ein und klicken Sie auf OK.
- Wenn Sie chromatische Verschiebungen von Übersprechen oder biologischen Kalibrierreferenzbildern messen, klicken Sie auf Extra-Parameter (Abbildung 1K). Wählen Sie aus der lokalen Verzerrung Ihres Mikroskop-Instrumentenkastens den Namen des in Schritt 4.9 angegebenen Mikroskops aus. Klicken Sie auf OK.
HINWEIS: Die Wahl der "Lokalen Verzerrung Ihres Mikroskopinstruments" wird nach dem Herunterfahren des Programms nicht gespeichert. - Fahren Sie mit der chromatischen Korrektur ohne lokale Ausrichtung fort, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
HINWEIS: Es ist auch möglich, die lokale Ausrichtung zusätzlich zur Mikroskopkalibrierung zu verwenden. In diesem Fall beginnt die lokale Ausrichtung mit der Mikroskopkalibrierung.
Representative Results
Ein Beispiel für die chromatische Verschiebungskorrektur mit einem Übersprechenreferenzbild ist in Abbildung 5dargestellt. Das Bild wurde mit einem Weitfeldmikroskop mit einer einzigen Kamera aufgenommen. Die Fluoreszenzemission aus DAPI wurde als Referenz verwendet (Abbildung 5A,B), um die blauen, grünen und roten Kanäle zu korrigieren. Das Bild besteht aus 3 Kanälen mit 60 Z-Slices, die jeweils aus 256 x 256 Pixeln bestehen. Die Bilder wurden vor der Messung der chromatischen Verschiebungen dekonvolviert. Die Messung der lokalen chromatischen Verschiebungen mit Chromagnon nahm 51 s auf einem Mac mit Intel Core i7 (Quad-Core, 8-Threads, 2,7 GHz), 16 GB RAM und 1 TB Flash-Speicher. Der Ausrichtungsparameter wurde auf das Zielbild angewendet (Abbildung 5C,D), das genau die gleiche Anzahl von Voxeln wie das Referenzbild hat. Das Vorbereiten der ausgerichteten Datei dauerte 3 s. Durch das Trimmen der Kantenpixel während des Ausrichtungsprozesses (KontrollkästchenZuschneideränder in Abbildung 1C) wurde die Anzahl der Voxel nach der Ausrichtung reduziert(Abbildung 5B, 51 Z-Slices, 252 x 251 Pixel). DNA in der Anaphasenbrücke (angezeigt durch Pfeilspitzen) wird vor der Ausrichtung vor der Ausrichtung fälschlicherweise außerhalb der Kernhülle gesehen(Abbildung 5C, offensichtlich in der unteren Ansicht), aber wie erwartet innerhalb des Umschlags nach der Ausrichtung(Abbildung 5D).
Ein Beispiel für die chromatische Schichtkorrektur mit einem biologischen Kalibrierreferenzbild ist in Abbildung 6dargestellt. Die Bilder wurden mit einem SIM-Mikroskop mit drei Kameras erhalten. Drei Bilder von HeLa-Zellen, die mit Phalloidinen befleckt sind, die mit blauen, grünen und roten Farbstoffen konjugiert sind, wurden gemittelt (Abbildung 6A). Das Referenzbild besteht aus 3 Kanälen mit 76 Z-Slices, die jeweils aus 1.024 x 1.024 Pixeln bestehen. Die Messung chromatischer Verschiebungen mit Chromagnon ohne lokale Ausrichtung erforderte 194 s auf dem oben beschriebenen Mac-System. Der Parameter wurde auf ein Zielbild angewendet, das aus 3 Kanälen mit 73 Z-Slices besteht, die jeweils aus 1.024 x 1.024 Pixeln bestehen. Die Generierung der ausgerichteten Datei dauerte 25 s. Die XZ-Ansicht zeigt falsche Kanalpositionen entlang des Z und leicht entlang der X-Richtungen (Abbildung 6A,C), aber diese Fehlregistrierung wurde nach der Ausrichtung korrigiert (Abbildung 6B,D).
Abbildung 5: Ein Beispiel für die Ausrichtung mit einem Crosstalk-Referenzbild. HeLa-Zellen wurden mit DAPI für DNA (in Magenta dargestellt), Alexa Fluor 488 (gelb dargestellt) für nukleare Hülle und Alexa Fluor 555 (blau dargestellt) für Mikrotubuli gefärbt. Die Bilder wurden durch 3D-Weitfeldmikroskopie mit einer einzigen Kamera aufgenommen und dekonvolviert. (A,B) Ein repräsentatives Crosstalk-Referenzbild mit DAPI-Emission vor und nach der Ausrichtung durch Chromagnon. Drei Farbkanäle werden als überlagert angezeigt. (C,D) Ein optischer Abschnitt des 3D-Stacks in drei Kanälen vor und nach der Ausrichtung. Axiale chromatische Aberration ist an der Anaphasenbrücke, die von Pfeilspitzen gezeigt wird, offensichtlich. Die Skalenleiste in Tafel A zeigt für alle Panels 5 m an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Ein Beispiel für die Ausrichtung mit einem biologischen Kalibrierreferenzbild Die Bilder wurden mit 3D-SIM mit drei Kameras aufgenommen. (A,B) Ein Referenzbild gemittelt aus drei Bildern vor (A) und nach (B) Ausrichtung. HeLa-Zellen wurden mit Phalloidin konjugiert mit Alexa Fluor 405, 488 oder 594 gefärbt. (C,D) Das Zielbild vor (C) und nach (D) Ausrichtung. HeLa-Zellen wurden mit DAPI für DNA (in Magenta dargestellt), Alexa Fluor 488 (gelb dargestellt) für nukleare Hülle und Alexa Fluor 594 (blau dargestellt) für Mikrotubuli gefärbt. Die Skalenleiste in Tafel A zeigt für alle Panels 5 m an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das Verfahren zur chromatischen Korrektur ist ein Kompromiss zwischen Genauigkeit und Aufwand. Um unnötige Anstrengungen zu sparen, ist es besser zu wissen, wie viel Genauigkeit für Ihre Studie erforderlich ist. Die höchste Genauigkeit ist für herkömmliche Großfeldaufnahmen (Live-Bildgebung) möglicherweise nicht erforderlich, so dass helle Feldreferenzbilder oft ausreichen, um die chromatische Verschiebung zu korrigieren. Wenn der bildgebende Zustand und die Umgebung konstant sind, spart die wiederholte Verwendung einer biologischen Kalibrierung Zeit. Ist andererseits eine hochgenaue Registrierung gewünscht, sind hochwertige Crosstalk- oder biologische Kalibrierreferenzbilder erforderlich. Für die beste Leistung sollten Referenzbilder mit möglichst ähnlichen Bedingungen und Timings wie die Zielbilder erhalten werden. Solange sowohl Referenz- als auch Zielbilder durch dieselbe Mikroskopie erhalten werden, wird eine höhere räumliche Auflösung die Korrekturgenauigkeit verbessern. Wenn die Dekonvolution sowohl für Referenz- als auch für Zielbilder verfügbar ist, kann die Implementierung dieser vor der Korrektur die Korrekturgenauigkeit verbessern. Für die beste Leistung sollte der Samplingsatz für die optische Achse (Z) sowohl in der Referenz- als auch in der Zieldatei für eine präzise Subpixelinterpolation (Protokollschritt 2.1.3) erfüllt sein.
Wenn die chromatische Verschiebung nicht korrigiert wird, führt dies zu falschen Schlussfolgerungen. Darüber hinaus kann die Verwendung der falschen Kalibrierung die chromatischen Verschiebungen sogar verschlimmern, anstatt sie zu korrigieren, und dies muss daher vermieden werden. Wir haben die möglichen Ursachen von Fehlern und ihre gemeinsamen Lösungen in Tabelle 2zusammengefasst. Um die Ursache eines Fehlers zu untersuchen, ist es zunächst notwendig, visuell zu überprüfen, ob die chromatische Verschiebung im Referenzbild genau korrigiert wird (Protokollschritt 3.12). Die meisten Fehler sind auf die Qualität der Referenzbilder zurückzuführen und lassen sich gemäß den Beschreibungen in Tabelle 2leicht beheben. Hinsichtlich der Qualität von Referenzbildern ist zu beachten, dass die Genauigkeit der globalen Ausrichtung abnimmt, wenn das gesamte Sichtfeld nicht mit der Stichprobe gefüllt wird (Abbildung 7, Tabelle 2). Im Vergleich zum guten Beispiel in Abbildung 7Aenthält das schlechte Beispiel in Abbildung 7B nur drei kerntechnische Hüllkurven im oberen linken Bereich, und Chromagnon konnte einen Teil dieses Bildes nicht ausrichten. Dies liegt daran, dass die globale Ausrichtungsmethode von Chromagnon das Sichtfeld in vier Bereiche unterteilt (Abbildung 7C), um die Unterschiede in Rotation und Vergrößerung mit hoher Genauigkeit zu messen3. Diese Methode ist bei korrekter Anwendung eine Reihenfolge genauer als andere lineare Methoden wie die Logpolartransformation und simplex-Methoden3. Wenn eine der vier Regionen nicht verfügbar ist, wechselt Chromagnon zu weniger effektiven linearen Methoden. Daher sind die in Abbildung 7B und Abbildung 7C gezeigten Beispiele für die beste Leistung unerwünscht, und die vier Bereiche sollten mit Objekten gefüllt werden. Benutzer können überprüfen, ob ein quadratischer Bereich des Sichtfelds für die Messung nicht verfügbar ist, indem sie sich die Protokolldatei ansehen ("Chromagnon.log"; siehe Protokollschritt 3.10). Glücklicherweise kann dieses Problem leicht durch die Mittelung mehrerer biologischer Kalibrierbilder oder die Verwendung lokaler Ausrichtung für Übersprechen oder helle Feldreferenzbilder überwunden werden (Tabelle 2). Im Gegensatz zum Fall der Fehlenden Korrektur von Referenzbildern ist das Versäumnis, Zielbilder zu korrigieren, schwieriger zu identifizieren. Da solche Fehler aufgrund von Unterschieden in Dateiformaten, Bildbedingungen, Bildgebungs-Timings, Bildgebungs-/Ausrichtungsmethoden zwischen Referenz- und Zielbildern auftreten (Tabelle 2), sollten Benutzer bei der Verwendung von Referenzbildern, die unter unterschiedlichen Bedingungen/Timings aus den Zielbildern abgerufen werden, immer vorsichtig sein. Einige Beispielbilder stehen zum Testen (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) zur Verfügung, um eine konkrete Vorstellung von den guten und schlechten Beispielbildern zu erhalten.
| Problem | Ursache | Lösung |
| Fehler beim Korrigieren des Referenzbilds | Geringer Kontrast | Erfassen Sie nach Möglichkeit ein Bild mit höherem Kontrast. Wenn ein helles Feld-Referenzbild verwendet wird, erfassen Sie das Bild in einer wasserbasierten Lösung erneut, um einen höheren Kontrast der Zelle zu erhalten. Alternativ können Sie auch die Berechnungsrauschenreduzierung anwenden (z. B. Gaußsche Filterung). Deaktivieren Sie die lokale Ausrichtung, die empfindlicher auf Geräusche reagiert. |
| Kontamination nicht verwandter Bilder | Entfernen Sie nach Möglichkeit die Quelle der nicht verwandten Bilder im Beispiel. Für Crosstalk-Referenzbilder, überprüfen Sie die Anregungsspektren der Farbstoffe, die für die Zielbilder verwendet werden. Wenn die Farbstoffe bei der Erfassung eines Crosstalkbildes angeregt werden (z.B. Alexa Fluor 568 oder 594), sollten Sie andere Farbstoffe (z.B. Alexa Fluor 555) in Betracht ziehen. Wenn Stäube auf dem Kamerachip einen offensichtlichen Kanalunterschied erzeugen, reinigen Sie den Kamerachip oder verwenden Sie eine Computer-Flatfielding-Methode. | |
| Ein extrem heller Fleck, der von einem kosmischen Strahl gemacht wird | Erfassen Sie das Bild nach Möglichkeit erneut. Alternativ können Sie auch die Berechnungsrauschenreduzierung anwenden (z. B. Median- oder Gaußsche Filterung). | |
| Dekonvolution-Artefakte (künstliche Signale an axialen und seitlichen Rändern) | Trimmen Sie die Kantenpixel oder Z-Abschnitte nach der Dekonvolution. Wenn eine Seite getrimmt ist, sollte auch die andere Seite getrimmt werden, um die Bildmitte beizubehalten. | |
| Die Z-Schrittgröße zu spärlich | Ein Z-Stack sollte erworben werden, um das Nyquist-Kriterium gemäß Protokoll 2.1.3 zu erfüllen. | |
| Optische Aberration | Sphärische Aberration ist die größte Aberration, die von Benutzern verursacht wird. Wählen Sie die richtige Objektivlinse für die Probe und verwenden Sie eine Decksrutschdicke von 170 m. Wenn die Objektivlinse mit einem Korrekturring ausgestattet ist, passen Sie sie an, um die Position zu finden, an der die höchste Fluoreszenzzahl aus dem Fokus ermittelt wird. Passen Sie bei einem Öl-Immersion-Objektiv ohne Korrekturring den Brechungsindex des Tauchöls an, der die Fluoreszenzzahl im Fokus erhöht. | |
| Sichtfeld ist unbesetzt (Abb. 7) | Bei biologischen Kalibrierreferenzbildern sind es durchschnittlich viele Bilder. Verwenden Sie bei Crosstalk- oder Bright-Field-Referenzbildern die lokale Ausrichtung. | |
| Ein nicht identifizierter Softwarefehler | Melden Sie das Problem über GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues) | |
| Fehler beim Korrigieren des Zielabbilds | Metadaten der Bilddatei gehen verloren | Verwenden Sie das ursprüngliche Mikroskopdateiformat, das vollständige Metadaten enthält, und vermeiden Sie die Konvertierung in eine mehrseitige Tiff-Datei vor der Verarbeitung. Verwenden Sie die gleiche Reihenfolge der Kanäle wie in Protokoll 3.3 geschrieben. |
| Falsche Ausrichtungsmethoden für die gegebene Mikroskopie | Wenden Sie die lokale Ausrichtungsmethode nicht an, wenn Sie von biologischen Kalibrierreferenzbildern auf Zielbilder messen. Verwenden Sie keine Crosstalk-Referenzbilder außer der Weitfeldmikroskopie. | |
| Unterschiede in den bildgebenden Bedingungen | Halten Sie die Bildbedingungen zwischen der Referenz und den Zielbildern konstant, wie in Protokoll 2.3.3 geschrieben. | |
| Unterschiede in der Stichprobe (einschließlich Deckzettel) | Verwenden Sie immer das gleiche Montagemedium, Coverslip (z.B. Nr. 1.5H) und eine ähnliche Schärfentiefe. | |
| Mikroskopdrift seit der letzten Kalibrierung | Machen Sie eine Kalibrierung so oft wie alle zwei Wochen. Halten Sie die Temperatur konstant, und verwenden Sie einen schwebenden Tisch, um Hardware-Drift des Mikroskops zu vermeiden. |
Tabelle 2: Fehlerbehebung bei chromatischer Korrektur.
Abbildung 7: Beispiele für Referenzbilder. Kernhülle in Spalthefezellen, die mit GFP und mCherry beschriftet sind. Die Bilder wurden mit konventioneller Weitfeldmikroskopie aufgenommen. Chromatische Verschiebungen wurden mit Chromagnon ohne lokale Ausrichtung korrigiert, indem die Bilder selbst als Referenzbilder verwendet wurden. Die Bilder wurden dann dekonvold, um die Details zu zeigen. (A) Ein gutes Beispiel mit vielen Objekten im Sichtfeld. (B) Ein schlechtes Beispiel mit Objekten nur in der linken oberen Ecke. Fehlausrichtung ist an einem bestimmten Bereich des Bildes offensichtlich. (C) Ein unerwünschtes Beispiel, bei dem einer der Vierecke (durch gepunktete Querlinien getrennt) leer ist. Die Maßstabsleiste in Panel A zeigt 5 m für die vollständige Feldansicht und 1,25 m für die vergrößerte Ansicht an und ist für alle Panels anwendbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In diesem Protokoll haben wir drei verschiedene Referenztypen beschrieben (Tabelle 1). Unter ihnen müssen Crosstalk-Referenzbilder und biologische Kalibrierreferenzbilder weiter sorgfältig diskutiert werden. Für Crosstalk-Referenzbilder können Proben, die mit DAPI oder Hoechst 33342 gebeizt und in Glycerin- oder kommerziellen Montagemedien montiert sind, effizient verwendet werden, um die blauen, grünen und roten Kanäle auszurichten. Ebenso kann Alexa Fluor 488 verwendet werden, um die grünen und roten Kanäle auszurichten. Die Herstellung von Crosstalk-Fluoreszenz ist jedoch oft schwierig, da viele blaue Farbstoffe außer DAPI und Hoechst dimmer nimmern und schneller zerfallen als die meisten grünen und roten Farbstoffe. Darüber hinaus sind die Emissionsspektren moderner Farbstoffe schmaler, was die Ausrichtung von mehr als drei Kanälen durch diese Methode schwierig macht. Beachtet werden sollte auch einige gängige rote Farbstoffe (z.B. Alexa Flour 568 und 594, aber nicht Alexa Fluor 555), die durch violettes Licht angeregt werden können, die verhindern, dass hochkontrastreiche Crosstalk-Bilder von blauen Farbstoffen erhalten. Ein weiterer Nachteil ist, dass diese Methode die chromatische Aberration von Anregungslichtpfaden in mehrfarbiger Anregung nicht messen kann, da nur eine einzige Anregungswellenlänge für die Anregung verwendet wird (Tabelle 1). Da die meisten fortschrittlichen Mikroskopie verwendet veränderte Beleuchtungsoptiken, ist die Anwendung dieser Methode begrenzt. Dennoch ist seine höhere Korrekturgenauigkeit ausreichend vorteilhaft, um in diesem Protokoll beschrieben zu werden. Im Allgemeinen sollte ein Crosstalk-Bild nach einem Zielbild aufgenommen werden, um Bleichmittel oder phototoxische Effekte zu verhindern. Für SMLM, das im Weitfeldmodus beobachtet wird, sollte ein Referenzbild erfasst werden, bevor ein Zielbild aufgenommen wird, da Fluoreszenzfarbstoffe während der Bildgebung gebleicht werden können.
Biologische Kalibrierreferenzbilder ermöglichen es Benutzern, jede gewünschte Anzahl von Kanälen auf Kosten einer zusätzlichen Probenvorbereitung einfach auszurichten. Ein weiterer Vorteil biologischer Kalibrierreferenzbilder ist die Verfügbarkeit von "Mittelwert" mehrerer Referenzen, die beim Ausfüllen aller Sichtfelder helfen. Bei dieser Methode kann es zu Unterschieden in den bildgebenden Bedingungen kommt, wenn die Kalibrierprobe auf einem anderen Dia vorbereitet wird. Der größte Teil dieses Problems kann gelöst werden, wenn sowohl Ziele als auch Referenzen auf demselben Dia mithilfe von handelsüblichen Kammerschutzbrillen(Tabelle 1) vorbereitet werden und andere bildgebende Bedingungen wie in Protokollschritt 2.3.3 konstant gehalten werden. In diesem Fall ist mit einer Korrekturgenauigkeit ähnlich der von Crosstalk-Referenzbildern zu rechnen3. Das Protokoll zur Verwendung von Phalloidin, wie hier gezeigt, ist eine der einfachsten Möglichkeiten, eine einzelne Zellstruktur mit mehreren Farben zu beflecken. Es gibt zahlreiche mögliche Szenarien zur Vorbereitung biologischer Kalibrierproben. Zur Immunfärbung kann eine Probe mit einem einzigen primären Antikörper beschriftet werden, gefolgt von der Färbung mit sekundären Antikörpern in mehreren Farben. Auf diese Weise kann eine einzelne Zielstruktur mit mehreren Farben beschriftet werden. Alternativ, 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridin, durch "Klick" Chemie Etiketten neu synthetisierte DNA in mehreren Farben mit hoher Dichte, wie im Detail zuvor beschrieben8. Für lebende Zellen ist es nützlich, einen transgenen Stamm vorzubereiten, der zwei Kopien eines Gens enthält, die mit GFP oder mCherry verschmolzen sind, um dieselbe Struktur mit zwei Farben zu kennzeichnen. Wenn die Kopiernummer des Gens kritisch ist, wie oft für Membranproteine beobachtet, kann eine einzige Kopie des Gens tandemly mit GFP und mCherry verschmolzen werden (Abbildung 7). Photokonvertierbare fluoreszierende Proteine, wie mEOS218, können auch verwendet werden, indem ein moderates Maß an violettem Licht beleuchtet wird, um beide Proteinarten mit oder ohne Photokonvertierung zu erhalten. Unter sauerstoffarmen Bedingungen kann GFP auch als photokonvertierbares Protein von grün bis rot19,20verwendet werden. Die Wahl der richtigen Kalibrierprobe macht das Experiment somit robuster.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 bis A.M. JP18H05528 und JP17H03636 an T.H., und JP17H01444 und JP18H05533 an H.Y. L.S. bestätigen die Unterstützung durch die Welcome Trust Strategic Awards 091911 und 107457/Z/15/Z funding advanced imaging at Micron Oxford.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% formaldehyde solution | Polyscience | 18814-10 | |
| 35 mm glass-bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Alexa Fluor 405 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A30104 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16170078 | |
| Coverslip | Matsunami | No. 1S HT | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate | Nacalai Tesque | 08458-16 | |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) | Described in Ref 15. | ||
| Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) | A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased. | ||
| Secondary antibody with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21424 | |
| Secondary antibody with Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm | Thermo Fisher Scientific | T7280 |
References
- Schermelleh, L., et al.
- Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).
- Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S.
- Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
- Hell, S. W.
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
- Müller, C. B., Enderlein, J.
- Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
- Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
- Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
- Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Sawin, K. E., Nurse, P.
- Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).
