Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Korrektion med høj nøjagtighed af 3D-kromatisk forskydninger i en alder af biologisk billedbehandling i superopløsning ved hjælp af Chromagnon

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60800
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 1,2
1Advanced ICT Research Institute Kobe, National Institute of Information and Communications Technology, 2Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University, 3Micron Advanced Bioimaging Unit, Department of Biochemistry, University of Oxford

Summary

Korrektion af kromatiske forskydninger i tredimensionale (3D) flerfarvede fluorescensmikroskopibilleder er afgørende for kvantitative dataanalyser. Denne protokol er udviklet til at måle og korrigere kromatiske skift i biologiske prøver gennem erhvervelse af egnede referencebilleder og behandling med open source-software, Chromagnon.

Abstract

Kvantitativ flerfarvet fluorescensmikroskopi er afhængig af den omhyggelige rumlige matchning af farvekanaler erhvervet ved forskellige bølgelængder. På grund af kromatisk aberration og den ufuldkomne tilpasning af kameraer, billeder erhvervet i hver kanal kan flyttes, og forstørret, samt roteret i forhold til hinanden i nogen af de tre dimensioner. Med den klassiske kalibreringsmetode måles kromatiske skift med flerfarvede perler fastgjort til overfladen af en dækslip, og der findes en række software til måling af de kromatiske skift fra sådanne kalibreringsprøver. Kromatisk aberration kan dog variere med dybde, ændre sig med observationsbetingelser og fremkaldes af selve den biologiske prøve, hvilket hindrer bestemmelse af den sande mængde kromatisk forskydning i prøven af interesse og på tværs af volumen. Korrektion af kromatiske skift ved højere nøjagtighed er særlig relevant for superopløsningsmikroskopi, hvor kun små kromatiske forskydninger kan påvirke kvantitative analyser og ændre fortolkningen af flerfarvede billeder. Vi har udviklet en open source software Chromagnon og ledsagende metoder til at måle og korrigere 3D kromatiske skift i biologiske prøver. Her leverer vi en detaljeret applikationsprotokol, der indeholder særlige krav til prøveforberedelse, dataindsamling og softwarebehandling til måling af kromatiske skift i biologiske prøver af interesse.

Introduction

Flerfarvet billeddannelse er et af de grundlæggende aspekter af biologisk fluorescensmikroskopi i tilfælde, hvor det rumlige forhold mellem forskellige molekyler eller strukturer er af stor interesse. Kromatisk aberration, en optisk aberration af polykromatisk lys forårsaget af dispersion, ændrer den tilsyneladende position af de farvede objekter af interesse. Tilsvarende mikroskoper udstyret med flere kameraer, der afsættes til at erhverve hver farve har mere komplekse kromatiske skift på grund af forskelle i optiske elementer og ufuldkommen tilpasning mellem kanalerne. Sådanne kromatiske skift kan således føre til en falsk konklusion, medmindre brugeren udtrykkeligt korrigerer dem. Selv om kromatiske skift ikke har været et stort problem, så længe opløsningen af mikroskopi er begrænset af den klassiske opløsningsgrænse, har den seneste udvikling af superopløsningsmikroskopi1 givet anledning til behovet for en mere præcis korrektion af kromatiske skift.

Det har været almindelig praksis at måle kromatiske forskydninger af mikroskopsystemer ved hjælp af et flerfarvet perlekalibreringsdias2. Den perlebaserede kalibreringsmetode er egnet til måling af kromatiske skift fra mikroskopets samlede optik til overfladen af dækslerne2. Denne metode er imidlertid ikke i stand til at måle kromatiske forskydninger i de biologiske prøver af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at mange biologiske prøver er tredimensionelle (3D), og de kromatiske skift af sådanne prøver er forskellige fra dem på overfladen af dækslerne. Desuden ændres kromatisk skift med billeddannelsesforhold2,3. Vi har målt de kromatiske forskydninger i 3D biologiske prøver og konstateret, at usikkerheden om kromatiske skift ofte var så meget som 350 nm ved den klassiske flerfarve-perle kalibreringsmetode3. Kromatiske skift skal derfor måles i biologiske prøver i den dybde af interesse og under de anvendte billeddannelsesforhold.

Her beskriver vi procedurer til at måle kromatiske skift i biologiske prøver og korrigere disse skift ved hjælp af vores software, Chromagnon3. For at måle kromatiske skift i biologiske prøver bruger vores metode to slags datasæt, et "målbillede" og et "referencebillede". Billedet "target" er et flerfarvet billede af interesse, for eksempel billeder, der er farves til DNA, nuklear konvolut og mikrotubuli. Det er ofte umuligt at måle kromatiske forskydninger i et sådant billede. Derfor har vi brug for en "reference" billede, der er dedikeret til at måle de kromatiske forskydninger i prøven. Den eneste definition af et "referencebillede" er et flerfarvet billede af det samme objekt. I denne forstand er en flerfarvet perler billede også en type reference billede. Her beskriver vi tre forskellige typer referencebillede, der bruges til at måle kromatiske forskydninger i de biologiske prøver: "krydstalereferencebilleder", "bright-field referencebilleder" og "biologiske kalibreringsreferencebilleder". Referencebilledets type afhænger af den anvendte type mikroskop eller den korrektionsnøjagtighed, der kræves som opsummeret i tabel 1.

Krydstale Lyst felt Biologisk kalibrering (på et andet dias) Biologisk kalibrering (på samme slide)
Nøjagtigheden +++ + ++b +++
Enkelhed ++ +++ ++ ++
Gældende mikroskopi Bredt felt Bredt felt Alle Alle
Tilgængelighed af lokal justering + + -c -c
a: Antallet af "+" angiver en stigende bedømmelse. Enkelt plus er omkring 50 nm og tre plus er omkring 15 nm i 3D.
b: Nøjagtigheden afhænger af, hvor meget de variable billeddannelsesforhold holdes konstante.
c: Lokal kalibrering målt ved flerfarvede perleprøver kan kombineres som beskrevet i protokolsektion 4.

Tabel 1: Parametre, når du vælger typen af referencebilleder.

"Krydstalereferencebilleder" har den højeste korrektionsnøjagtighed og er relativt enkle at opnå3,4 (tabel 1). Ulempen er deres begrænsning i mikroskopi applikationer på grund af deres manglende evne til at måle kromatiske forskydninger i excitation stier. For at opnå sådanne billeder bør mikroskopet også være udstyret med multibånddicespejle og emissionsfiltre, der styres uafhængigt af excitationsfiltrene eller lyskilderne. Egnet mikroskopi omfatter konventionel bredfeltmikroskopi, enkeltmolekylelokaliseringsmikroskopi (SMLM) såsom fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi/stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (PALM/STORM)5,,6 og udvidelsesmikroskopi7 observeret med bredfeltmikroskopi. Et krydstalereferencebillede er hentet fra selve målprøven. Det er et billede af krydstale (bleed-through) fluorescens af et farvestof opnået i alle nødvendige kanaler. Fluorescensemissionen udvider sig altid mod de længere bølgelængder, og farvestoffer med den korteste emissionsbølgelængde er glade for at opnå krydstalefluorid i kanaler med længere bølgelængder. For eksempel, når prøven er plettet med blå, grøn og rød, er det kun det blå farvestof, der er ophidset, og emissionslyset opnås i de blå, grønne og røde kanaler. I denne protokol, DNA farves med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) blev brugt til at opnå krydstale fluorescens.

"Bright-field reference billeder" er en lettere og mindre fototoksisk alternativ til "krydstale reference billeder", men er de mindst nøjagtige3 (Tabel 1). Disse er lyse feltbilleder af målprøven, der er anskaffet i alle de farvekanaler, der bruges i målbilledet.

"Biologiske kalibreringsreferencebilleder" har den fordel, at de kan anvendes på enhver type mikroskopi på grund af deres evne til at måle de kromatiske forskydninger både i excitations- og emissionsvejene3,8 (tabel 1). Egnet mikroskopi omfatter bredfeltmikroskopi, konfokal mikroskopi, lysarkmikroskopi, stimuleret emissionsudtømning (STED)9, struktureret belysningsmikroskopi (SIM)10, Airyscan/SORA11,,12, SMLM observeret med den samlede interne refleksionfluorescens (TIRF) tilstand, Olympus super opløsning (OSR)13, og så videre. Et biologisk kalibreringsreferencebillede anskaffes fra en kalibreringsprøve, der fremstilles på samme måde som målprøven, men med farvning af en enkelt struktur med flere farver. Korrektionen nøjagtighed excellerer opløsningen af de fleste super-opløsning mikroskopi og forberede en biologisk kalibreringsprøve kan være relativt enkel. En anden fordel er tilgængeligheden til "gennemsnitlige" flere reference billeder. Selvom de enkelte billeder indeholder dårlige oplysninger til måling af kromatiske skift, kan informationsindholdet derfor øges ved at beregne flere billeder. Nøjagtigheden afhænger af, hvor meget billeddannelsesforholdene holdes konstante. I denne forbindelse opnås den bedste ydeevne, når både mål- og referenceprøverne er på samme dias,Table 1f.eks. I denne protokol, actin farves med tre farver falloidin blev brugt som en biologisk kalibrering.

Når en reference billede er opnået, så den kromatiske skift måles og korrigeres af vores software Chromagnon. Der er ingen begrænsning på antallet af kanaler, Z sektioner og tidsrammer, at Chromagnon kan måle og korrigere de kromatiske skift for. Chromagnon måler kromatiske skift i to trin. Det første trin erhverver de "globale" eller "affine" justering parametre for oversættelse i X, Y, Z akser, forstørrelse langs X, Y, Z akser, og rotation omkring Z akse. Beregningsnøjagtigheden af den globale tilpasning er ~ 16 nm i 3D og ~ 8 nm i 2D. Det andet trin er en valgfri 2D iterativ "lokal justering" på projicerede billeder for at opnå en højere nøjagtighed. I den lokale justeringsproces opdeles billederne i flere regioner, og kromatiske skift i disse lokale regioner måles. Derefter fordeles regionerne yderligere, og kromatiske forskydninger i underregionerne måles iterativt, indtil antallet af pixels i regionen når det mindste antal pixel (normalt 60 x 60 pixel). Det resulterende lokaljusteringskort kombineres med den globale justeringsparameter og anvendes på målbilledet ved hjælp af en elastisk transformation. Efter dette trin er beregningsnøjagtigheden forbedret til ~14 nm i 3D og ~6 nm i 2D. Den lokale justering er ikke egnet til biologiske kalibreringsreferencebilleder, fordi den biologiske struktur i referencen er forskellig fra strukturen i målet (tabel 1). Derfor bruges kun global justering til biologiske kalibreringsreferencebilleder.

De lokale kromatiske skift stammer fra to kilder; mikroskop instrumental lokal forvrængning og biologisk strukturel inhomogenitet. Da mikroskopets instrumentale lokale forvrængning er konstant, kan dette måles fra referenceprøven for flerfarvede perler og korrigeres som en fast parameter. Chromagnon kan kombinere mikroskopets instrumentelle lokale forvrængningskort og de globale justeringsparametre fra de biologiske kalibreringer (tabel 1). Ved hjælp af denne metode forventes det, at den gennemsnitlige nøjagtighed af biologisk kalibrering vil blive forbedret med yderligere 1-2 nm.

Her beskriver vi en protokol til at korrigere de kromatiske skift af 3D fluorescens billeder ved hjælp af vores software Chromagnon, fra den nemmeste lave ende til den højeste nøjagtighed. Vi bruger immunstaining af HeLa-celler som et eksempel og observerede dem ved hjælp af 3D wide-field mikroskopi og 3D-SIM. I første afsnit beskriver vi, hvordan du forbereder målprøver og biologiske kalibreringsprøver. Denne del af protokollen bør optimeres til forskningens specifikke mål. I andet afsnit beskriver vi anskaffelsesmetoderne for tre slags referencebilleder med mikroskoper. Antagelsen var at opnå blå, grønne og røde kanaler, men kanalsammensætning bør ændres ved de specifikke mål for forskningen og ved opsætninger af mikroskopet. Det betyder ikke noget, hvis mikroskopet er udstyret med et enkelt kamera eller flere kameraer. I tredje afsnit beskriver vi, hvordan man kan bruge vores software til at måle og korrigere kromatiske skift af målbilledet ved hjælp af referencebilleder. Endelig beskriver vi i fjerde afsnit en metode til at supplere de biologiske kalibreringsreferencebilleder ved hjælp af et mikroskops instrumentale lokale kalibrering.

Protocol

1. Forberedelse af prøver

  1. Udarbejdelse af en målprøve
    1. Frø 2,5 x 105 HeLa celler på en 35-mm glas-bund fad og dyrke dem i 2 ml vækst medium (Dulbecco modificerede ørn medium med L-glutamin og natriumpyruvat suppleret med 10% føtal kvæg serum [FBS]) ved 37 °C og en CO2 koncentration på 5%. Alternativt frø 6 x 104 HeLa celler på en 8-godt chambered coverglass og dyrke dem i 0,5 ml vækstmedium ved 37 °C og en CO2 koncentration på 5%. Brug #1,5 coverglas (med en tykkelse på 0,170 mm) til mikroskopi med høj opløsning.
      BEMÆRK: Brug 1/4-volumener til det 8-brønds chambered coverglass i yderligere trin undtagen trin 1.1.5, 1.1.6, 1.1.8, 1.1.11 og 1.2.5, hvor volumen er 100 μl uanset beholdertype.
    2. Efter ca. 24 timer inkubation erstattes opløsningen med 2 ml 3,7% formaldehyd i fosfatbufferet saltvand (PBS). Efter forsigtig blanding fortsættes cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) på en rotationsplatform.
      FORSIGTIG: Arbejd i en røghætte.
    3. Celler vaskes med 2 ml PBS, 3x hver i 5−10 min på en rotationsplatform.
      BEMÆRK: Følg lokale bestemmelser for bortskaffelse af formaldehydaffald.
    4. Permeabilize celler med 2 ml 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min på en rotationsplatform, efterfulgt af tre vasker med 2 ml PBS, hver for 5−10 min på en rotationsplatform.
    5. Inkubere celler i 100 μL af 1% kvæg serum albumin (BSA) i PBS for 1 time ved RT på en rotation platform.
    6. Opløsningen erstattes med 100 μL af en blanding af primære antistoffer (anti-emerin polyklonalt antistof14 og anti-tubulin monoklonalt antistof15)i 1% BSA i PBS ved passende fortyndinger (1/500 for anti-emerin og 1/100 for anti-tubulin), og inkubere natten over ved 4 °C.
    7. Celler vaskes med 2 ml PBS, 3−5x hver i 10 minutter på en rotationsplatform.
    8. Opløsningen udskiftes med 100 μL af en blanding af sekundære antistoffer (antikanin-IgG med Alexa Fluor 488 og antimuse-IgG med Alexa Fluor 555) i 1% BSA i PBS ved 1/500 fortynding og inkuberes i 3−4 timer ved RT.
    9. Celler vaskes med 2 ml PBS, 3−4x hver i 5 minutter på en rotationsplatform.
    10. Opløsningen udskiftes med 2 ml 0,5 μg/ml DAPI i PBS for at plette DNA i 30 min ved RT på en rotationsplatform.
      BEMÆRK: I stedet for DAPI kan Hoechst 33342 ved samme koncentration også anvendes.
    11. Opløsningen udskiftes med ~100 μL monteringsmedium (Tabel over Materialer).
  2. Fremstilling af en biologisk kalibreringsprøve
    1. Forbered faste celler som beskrevet i trin 1.1.1−1.1.4.
      BEMÆRK: Prøverne fremstilles fortrinsvis på et kammerdækselglas for at placere både mål- og referenceprøverne i separate kamre på samme dækslip(tabel 1,højre). Dette præparat er at foretrække, når forsøget kræver den højeste korrektionsnøjagtighed. Når prøven skal fremstilles på en almindelig dækslip, skal der anvendes præcisionsovertræk med lav tykkelsesvariation ("Nr. 1,5 H") for at sikre reproducerbarheden.
    2. Stamopløsningen af fluorescerende farvestofkonjugeret falloidin fremstilles i 1,5 ml methanol og opbevares ved -20 °C. Der blandes falloidinbestandopløsning i PBS ved følgende fortynding: 1/100 for falloidin med Alexa Fluor 405, 1/1.000 for falloidin med Alexa Fluor 488 og 1/200 for falloidin med Alexa Fluor 594.
    3. Opløsningen udskiftes med 1 ml af falloidinblandingen, der er fremstillet i trin 1.2.2, og inkuberes i 30 min ved RT på en rotationsplatform.
    4. Celler vaskes med 2 ml PBS, 3−5x hver i 10 minutter på en rotationsplatform.
    5. Opløsningen udskiftes med ~100 μL monteringsmedium.
      BEMÆRK: Kalibreringsprøverne kan opbevares ved 4 °C eller -20 °C til gentagen brug.

2. Erhvervelse af referencebilleder

  1. Krydstale referencebilleder
    1. Den i trin 1.1 fremstillede målprøve anbringes på et mikroskop med bred felt.
    2. Anskaf et fluorescensbillede af målet i blå, grønne og røde kanaler.
      BEMÆRK: For 3D-billeder kan Z-trinstørrelsen i referencebilledet være forskellig fra størrelsen på målbilledet, så længe billedfilen indeholder oplysninger om trinstørrelsen. Z-trinstørrelsen for reference- og målbilleder er fortrinsvis mindre end halvdelen af Z-aksens optiske opløsning, som beregnes ved Equation 1 for en diffraktionsbegrænset mikroskopi, hvor λ er bølgelængden i nanometer, og NA er den numeriske blænde af objektivets objektiv. Hvis den aksiale opløsning f.eks. Der kræves ingen tidsserier til referencebilledet.
    3. Hvis du derefter vil anskaffe et fluorescensbillede af referencen, skal du vælge excitationslyset kun for DAPI og vælge at anskaffe sig i blå, grønne og røde kanaler. Anskaf referencebilledet nøjagtigt på samme stadieposition og Z-højde i tilfælde af en 3D-stak.
      BEMÆRK: Ved længere emissionsbølgelængder vil øget belysningsintensitet og eksponeringstid være påkrævet.
  2. Bright-field reference billeder
    1. Den i trin 1.1 fremstillede målprøve anbringes på et mikroskop med bred felt.
    2. Anskaf et fluorescensbillede af målet i blå, grønne og røde kanaler.
      BEMÆRK: Z-trinstørrelsen opfylder fortrinsvis Nyquist-kriteriet som beskrevet i trin 2.1.2.
    3. Anskaf et lyst feltbillede af målet i blå, grønne og røde kanaler nøjagtigt på samme sceneposition som i 2.2.2 og den samme Z-højde i tilfælde af en 3D-stak.
  3. Biologiske kalibreringsreferencebilleder
    1. Den målprøve, der er fremstillet i trin 1.1, anbringes på et 3D-SIM-mikroskop.
    2. Anskaf et fluorescensbillede af målet i blå, grønne og røde kanaler ved 3D-SIM. Rekonstruere det superløste billede.
      BEMÆRK: Typen af mikroskop kan være af enhver type som 3D-SIM, konfokal, STED osv. Z-trinsstørrelsen opfylder helst Nyquist-kriteriet som beskrevet i trin 2.1.2.
    3. Anskaf flere fluorescensbilleder af referencen, der er forberedt i trin 1.2 på forskellige stadier, der ligner målbilledet (trin 2.3.2) med 3D-SIM. Rekonstruere de super-løste billeder..
      BEMÆRK: Det samlede antal pixel i XY skal være det samme i alle referencebilleder. Trinstørrelsen i Z skal være den samme i alle referencebilleder. Det samlede antal Z-sektioner foretrækkes at være det samme som i målbilledet, men dette er ikke et absolut krav. XY-positionen på scenen for disse referencebilleder er ligegyldig, fordi positionen eller dækstykket allerede er forskellig fra målprøvens position, og desuden er forskellen i kromatisk skift på en enkelt coverslip mindre end 15 nm3. Billeddannelse betingelser, herunder objektive linse, observation temperatur, nedsænkning olie, pinhole størrelse i konfokal mikroskopi, og tilt vinkel i stærkt skrå belysning mikroskopi16, bør alle matche referencen for den bedste ydeevne. Hvis mikroskopet udstyrer flere kameraer til at erhverve flere kanaler samtidigt, bør referencebillederne erhverves så ofte som ugentligt for at korrigere den instrumentale drift.

3. Korrektion af kromatisk skift ved hjælp af Chromagnon software

  1. Ved hjælp af en webbrowser skal du gå til https://github.com/macronucleus/Chromagnon/releasesog hente den nyeste binære udgave af Chromagnon.
    BEMÆRK: Binære udgivelser er tilgængelige til Windows, Mac og nogle Linux-versioner.
  2. Uddrag programmet og sætte den eksekverbare fil på et praktisk sted. Dobbeltklik på en Windows eller Mac i en Windows- eller Mac-fil for at åbne den, eller udfør den binære fil fra kommandolinjen på et Linux-system.
    BEMÆRK: Den grafiske brugergrænseflade som i figur 1 åbnes. Programmet kan forhindres i at åbne ved at dobbeltklikke for første gang på grund af en sikkerhedsmæssig årsag. I dette tilfælde skal du bruge den platform-afhængige metode til at åbne programmet hentet fra internettet.

Figure 1
Figur 1: Et skærmbillede af Chromagnon grafisk brugergrænseflade. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Træk og slip referencefilerne i feltet "Reference" (Figur 1), eller klik på Referencefiler (Figur 1A) for at åbne en dialogboks med filvælger. Afhængigt af filformaterne, hvis programmet beder om at installere en Java Development Kit (JDK), skal du trykke ja og brugeren vil blive navigeret til download siden. Hent og installer JDK til operativsystemet som anvist. Chromagnon bør være i stand til at læse billedfilformatet efter genstart af programmet.
    BEMÆRK: Chromagnon kan læse de fleste billedfilformater (flersidet 'tif', 'czi', 'nd2', 'oib', 'lif', 'dv' osv.). Det oprindelige mikroskopbilledformat foretrækkes på dette trin, fordi metadata kan gå tabt, når et billedformat konverteres til en tif-fil med flere sider. Hvis kanalnavnet vises som 0, 1, 2 osv.Figure 2A Chromagnon I dette tilfælde skal du sikre dig, at rækkefølgen af kanalerne og pixelstørrelsen i referencefilen svarer til dem i destinationsfilen. Hvis rækkefølgen af kanaler i referencen f.eks.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på skærmbillede til indlæsning af flere filer. (A) Et tilfælde, hvor alle referencebilleder har de tilsvarende målbilleder. Kanalnavne identificeres korrekt ved bølgelængder (angivet med en grøn boks) i de billedfiler, der bruges i dette eksempel. (B) Et tilfælde, hvor et enkelt referencebillede bruges til at korrigere flere målbilleder. (C) Et tilfælde, hvor flere referencebilleder (angivet med en rød boks) er gennemsnit, og det resulterende referencebillede efter gennemsnit bruges til at korrigere flere målbilleder. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Træk og slip destinationsfilerne i feltet "Målfelt" (Figur 1), eller klik på Målfiler (Figur 1B) for at åbne en dialogboks med filvælger.
    BEMÆRK: Hvis der er flere målbilleder, og hver af dem har tilsvarende referencebilleder, skal det tilsvarende referencebillede og målbilledet være på samme række i de respektive reference- og målbokse (Figur 2A). Et enkelt referencebillede kan også bruges til at justere flere målbilleder (Figur 2B).
  2. Markér afkrydsningsfeltet beskæringsmargener, hvis det ikke er markeret (Figur 1C).
    BEMÆRK: Hvis dette afkrydsningsfelt er markeret, beskæres margener, der skyldes justeringen. Markér denne indstilling for generel brug, men fjern markeringen, hvis der kræves en sammenligning på pixelniveau mellem billeder før og efter justering.
  3. Vælg et outputbilledformat på valglisten (Figur 1D).
    BEMÆRK: De tilgængelige formater er 'tif' (ImageJ17-format), 'dv' og 'ome.tif'; formatet 'ome.tif' er kun tilgængeligt efter installation af JDK.
  4. Angiv suffikset for outputfilnavnet (Figur 1E, standardværdien er '_ALN'), som føjes til destinationsfilnavnet.
  5. For krydstalereferencebilleder med et højt signal-støj-forhold skal du bruge lokal justering fra valglisten for Lokal justering (Figur 1F), vælge Projektion for at bruge lokal justering, og Ingen for at deaktivere den. Brug en mindste vinduesstørrelse på 60 (Figur 1G).
    BEMÆRK: Når du bruger lokal justering, skal alle målbilleder have tilsvarende referencebilleder (Figur 2A). Lokal justering anbefales ikke til biologiske kalibreringsreferencebilleder, da lokale kromatiske skift varierer fra den ene prøve til den anden (tabel 1). Af samme grund kan en enkelt lokal justering ikke anvendes på mange målbilleder (Figur 2B). Som en undtagelse kan det bruges, når prøven af interesse er kun på overfladen af coverslip, og synsfeltet er fyldt med lyse objekter, ligesom flerfarvet fluorescerende perle prøver.
  6. For flere biologiske kalibreringsreferencebilleder skal du kontrollere den gennemsnitlige referenceindstilling (Figur 1H) for at måle en enkelt justeringsparameter fra det gennemsnitlige billede, og den enkelte justeringsparameter anvendes derefter på alle målbilleder ( Figur2C). Vælg Ingen for Lokal justering ( Figur1F).
  7. Klik på Kør alle (Figur 1I) for at starte målinger. justeringsparametrene anvendes på målbillederne.
    BEMÆRK: Efter måling af kromatiske skift fra referencefilerne, programmet gør filer med udvidelse "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif". Outputfilen afhænger af, om den lokale justering er aktiveret (Figur 1F). Hvis justeringen sker uden lokal justering, er outputtet "chromagnon.csv", mens outputtet er "chromagnon.tif", hvis der bruges lokal justering. Filnavnene er de samme som referencefilen med undtagelse af det angivne suffiks (Figur 1J, standarden er uden suffiks) og udvidelsen ("chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif"). En detaljeret beskrivelse af justeringsprocessen kan findes i filen "Chromagnon.log", der er oprettet i samme mappe.
  8. Vent, indtil det korrigerede billede vises i fremviseren (Figur 3).
    BEMÆRK: Hvis du trækker i billedet med musen, flyttes billedet, og musehjulet flyttes, ændres zoomen. Flyt skyderen (Figur 3A) for at ændre sektionen Z (og/eller T, når det er relevant) til visning. Hvis fremviseren er for langsom til at opdatere et billede, skal du klikke på knappen Indlæs hele data i hukommelse ( Figur3B) for at forhindre, at den får adgang til dataene på harddisken. Hvis du trækker i venstre eller højre kant af farvebokse (Figur 3C), kan det styre minimum- eller maksimumværdierne for visningen. Hvis du klikker på knappen for hver kanal (Figur 3D), skiftes mellem visning eller skjulning af den valgte kanal i fremviseren. Højreklik på farveboksen (Figur 3D) giver brugerne mulighed for at vælge de farver, der skal vises, eller ændre visningsindstillingerne på farvelinjen, og det giver også brugerne mulighed for at angive de nøjagtige minimum- og maksimumværdier for visningsskalering ved at vælge "skalering til ...". Hvis du klikker på knappen Ortogonal visning (Figur 3E), vises billederne af ZY- og XZ-visninger. Hvis du flytter krydslinjerne, ændres placeringen, så den vises i sidevisningerne.

Figure 3
Figur 3: Et skærmbillede af billedfremviseren. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis du vil kontrollere, om målingen blev udført korrekt, skal du trække og slippe referencebillederne i feltet "Reference" og "Målboks". Kør programmet, og kontroller, om billederne er perfekt overlappet.
    BEMÆRK: Når det er tilgængeligt, kan "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif" filer bruges som referencer for at springe målinger. Hvis det kromatiske skift i billedet forbliver ukorrigeret, kan du prøve løsninger, der er opsummeret i tabel 2.
  2. For at få adgang til justeringsparametrene i eksemplet, eller når justeringsparametrene skal redigeres manuelt, skal du åbne "chromagnon.csv"-filer direkte med teksteditor- eller regnearkssoftware. Når den redigeres, skal du gemme den som "csv".
    BEMÆRK: Værdierne er i pixels for "tz", "ty", "tx", og i grader for "r", og i forstørrelse faktorer for "mz", "min" og "mx".
    1. Alternativt kan du indlæse en fil "chromagnon.csv" eller "chromagnon.tif" i Chromagnonsreference- eller målboks (figur 1), og dobbeltklik derefter på den for at åbne justeringseditoren (Figur 4).
    2. Hvis du vil se, hvor meget en kanal flyttes, når parametrene redigeres, skal du trække og slippe referencebilledfilen til det nederste område (Figur 4A) for at åbne billedet i editoren. Når du redigerer værdierne i tabellen (Figur 4B) og trykker på enter/returtasten, skal du observere, hvordan billedet af den tilsvarende kanal bevæger sig, efterhånden som værdierne ændres. Når du har redigeret, skal du klikke på Gem som... (Figur 4C) for at gemme ændringerne.

Figure 4
Figur 4: Et skærmbillede af en justeringsparametereditor. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis du vil kontrollere det lokale justeringskort, skal du indlæse "chromagnon.tif" via Chromagnonsreference- eller målfelt (Figur 1) og dobbeltklikke på det for at åbne justeringseditoren (Figur 4). Klik på visning (Figur 4D) for at få vist det lokale skift, der er angivet med linjer, hvis længder forstørres med den faktor, der er angivet på listen forstørrelsesvalg (Figur 4E).
    BEMÆRK: Ved at angive den "oprindelige billedfil" (Figur 4F) tilknyttes skiftene sammen med det oprindelige billede.

4. Generering af et mikroskop-specifikt lokalt justeringskort

  1. 2 μL fluorescerende perler med en diameter på 200 nm fortyndes i 18 μL ethanol.
  2. Vortex opløsningen og placere 10 μL af perle opløsning i midten af et glas bund fad. Sørg for at bruge #1,5 coverglas (med en tykkelse på 0,170 mm) til mikroskopi med høj opløsning.
  3. Lad fadet på RT i 1 time for at tørre helt.
  4. Anbring skålen på et mikroskop, der skal kalibreres, og fokuser på de fluorescerende perler.
  5. Hent 2D- eller 3D-billeder med den mikroskopi, der skal kalibreres. Hent flere billeder ved at ændre scenepositionen.
  6. Åbn Chromagnon grafisk brugergrænseflade.
  7. Træk og slip perlebilledfilerne i feltet "Referenceboks" (Figur 1), eller klik på Referencefiler (Figur 1A) for at åbne en dialogboks med filvælger.
  8. Kontroller den gennemsnitlige referenceindstilling (Figur 1H). Vælg Projektion på valglisten for Lokal justering(Figur 1F). Local align Brug en mindste vinduesstørrelse på 60 (Figur 1G). Klik på Kør alle (Figur 1I) for at starte målinger.
    BEMÆRK: Der oprettes en ".chromagnon.tif"-fil, hvor det lokale justeringskort over mikroskopet gemmes.
  9. Efter måling skal du klikke på Ekstra parametre (Figur 1K). Fra den lokale forvrængning af dit mikroskop instrument boks, skal du klikke på valglisten og vælge Ny ... for at åbne en dialog. Træk og slip filen "chromagnon.tif", der blev genereret i trin 4.8, til filnavnet, eller klik på vælg filknappen for at åbne en dialogboks med filvælger. Angiv navnet på mikroskopet, og klik på OK.
  10. Når du måler kromatiske skift fra krydstale- eller biologiske kalibreringsreferencebilleder, skal du klikke på Ekstra parametre (Figur 1K). Fra den lokale forvrængning af din mikroskop instrumentboks, skal du vælge navnet på det mikroskop, der er angivet i trin 4.9. Klik på OK.
    BEMÆRK: Valget af "Lokal forvrængning af dit mikroskopinstrument" gemmes ikke, når programmet er lukket ned.
  11. Fortsæt til kromatisk korrektion uden lokal justering som i afsnit 3.
    BEMÆRK: Det er også muligt at bruge lokal justering ud over mikroskopkalibrering. I dette tilfælde starter den lokale justering med mikroskopkalibrering.

Representative Results

Et eksempel på kromatisk skiftkorrektion ved hjælp af et krydstalereferencebillede vises i figur 5. Billedet blev opnået med et bredt felt mikroskop udstyret med et enkelt kamera. Fluorescensemission fra DAPI blev brugt som reference (figur 5A,B) til at korrigere de blå, grønne og røde kanaler. Billedet består af 3 kanaler med 60 Z-udsnit, der hver består af 256 x 256 pixel. Billederne blev dekonroveret, før de måler de kromatiske skift. Måling af lokale kromatiske skift ved hjælp af Chromagnon tog 51 s på en Mac med Intel Core i7 (quad core, 8-tråde, 2,7 GHz), 16 GB RAM og 1 TB flash opbevaring. Justeringsparameteren blev anvendt på målbilledet (Figur 5C,D), som har nøjagtigt det samme antal voxels som referencebilledet. Forberedelse af den justerede fil tog 3 s. Som et resultat af trimning af kantpixel under justeringsprocessen(afkrydsningsfelt for beskæringsmargener i figur 1C) blev antallet af voxels reduceret efter justering (Figur 5B,51 Z-udsnit, 252 x 251 pixel). DNA i anaphasebroen (angivet med pilespidser) ses forkert uden for den nukleare kuvert før justering (Figur 5C, tydeligt i det nederste panel, der viser XZ-visningen), men som forventet inde i konvolutten efter justering (Figur 5D).

Et eksempel på kromatisk skiftkorrektion ved hjælp af et biologisk kalibreringsreferencebillede er vist i figur 6. Billederne blev opnået med et SIM-mikroskop udstyret med tre kameraer. Tre billeder af HeLa celler farves med falloidiner konjugeret til blå, grønne og røde farvestoffer blev i gennemsnit (Figur 6A). Referencebilledet består af 3 kanaler med 76 Z-udsnit, der hver består af 1.024 x 1.024 pixel. Måling kromatisk skift ved hjælp af Chromagnon uden lokal tilpasning kræves 194 s på Mac-systemet beskrevet ovenfor. Parameteren blev anvendt på et målbillede bestående af 3 kanaler med 73 Z-udsnit, der hver består af 1.024 x 1.024 pixel. Generering af den justerede fil tog 25 s. XZ-visningen viser forkerte kanalpositioner langs Z og lidt langs X-anvisningerne (Figur 6A,C), men denne fejlregistrering blev korrigeret efter justering (Figur 6B,D).

Figure 5
Figur 5: Et eksempel på justering med et krydstalereferencebillede. HeLa celler blev plettet med DAPI for DNA (vist i magenta), Alexa Fluor 488 (vist med gul) for nuklear kuvert, og Alexa Fluor 555 (vist med blå) for mikrotubuli. Billeder blev erhvervet af 3D wide-field mikroskopi med et enkelt kamera og dekoncentraleret. (A,B) Et repræsentativt krydstalereferencebillede ved hjælp af DAPI-emission før og efter justering foretaget af Chromagnon. Tre farvekanaler vises som overlejret. (C,D) En optisk del af 3D-stakken i tre kanaler før og efter justering. Aksial kromatisk aberration er tydelig på anaphasebroen vist med pilespidser. Vægtbjælke i panel A angiver 5 μm for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Et eksempel på tilpasning til et biologisk kalibreringsreferencebillede Billeder blev erhvervet med 3D-SIM udstyret med tre kameraer. (A,B) Et referencebillede gennemsnit fra tre billeder før (A) og efter (B) justering. HeLa celler blev plettet med falloidin konjugeret med Alexa Fluor 405, 488 eller 594. (C,D) Målbilledet før (C) og efter (D) justering. HeLa celler blev plettet med DAPI for DNA (vist i magenta), Alexa Fluor 488 (vist med gul) for nuklear kuvert, og Alexa Fluor 594 (vist med blå) for mikrotubuli. Vægtbjælke i panel A angiver 5 μm for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Proceduren for kromatisk korrektion er en afvejelse mellem nøjagtighed og indsats. For at spare unødvendige indsats, er det bedre at vide, hvor meget nøjagtighed der kræves for dit studie. Den højeste nøjagtighed er muligvis ikke nødvendig for konventionel billeddannelse i bred felt (live), og derfor er lyse feltreferencebilleder ofte tilstrækkelige til at korrigere det kromatiske skift. Tilsvarende, når billeddannelse tilstand og miljø er konstant, gentagen brug af en biologisk kalibrering vil spare tid. På den anden side, hvis en meget præcis registrering ønskes, høj kvalitet krydstale eller biologiske kalibrering reference billeder er nødvendige. For at opnå den bedste ydeevne bør referencebilleder opnås med så ensartede betingelser og tidspunkter som målbillederne som muligt. Så længe både reference- og målbilleder opnås ved samme mikroskopi, vil højere rumlig opløsning forbedre korrektionsnøjagtigheden. Hvis deconvolution er tilgængelig for både reference- og målbilleder, kan implementering af dette før korrektion forbedre korrektionens nøjagtighed. For at opnå den bedste ydeevne skal prøvetagningsteoret for den optiske (Z) akse også være opfyldt i både reference- og målfilen for præcis subpixel interpolation (protokoltrin 2.1.3).

Manglende korrektkorakromatisk skift fører til forkerte konklusioner. Desuden kan brugen af forkert kalibrering endda forværre de kromatiske skift i stedet for at korrigere dem, og det skal derfor undgås. Vi har opsummeret de mulige årsager til fejl og deres fælles løsninger i tabel 2. For at undersøge årsagen til en fejl er det for det første nødvendigt visuelt at kontrollere, om det kromatiske skift i referencebilledet er præcist korrigeret (protokoltrin 3.12). De fleste fejl skyldes kvaliteten af referencebillederne og afhjælpes let i henhold til beskrivelserne i tabel 2. Med hensyn til kvaliteten af referencebillederne er det vigtigt at bemærke, at nøjagtigheden af den globale tilpasning mindskes, hvis hele synsfeltet ikke fyldes med stikprøven (figur 7, tabel 2). Sammenlignet med det gode eksempel, der er vist i figur 7A, indeholder det dårlige eksempel i figur 7B kun tre nukleare kuverter i det øverste venstre område, og Chromagnon kunne ikke justere en del af dette billede. Dette skyldes , at Chromagnons globale tilpasningsmetode opdeler synsfeltet i fire regioner (figur 7C) for at måle forskellene i rotation og forstørrelse med høj nøjagtighed3. Denne metode, hvis den betjenes korrekt, er én ordre mere præcis end andre lineære metoder såsom log polar transformation og simplex metoder3. Hvis nogen af de fire regioner ikke er tilgængelige, vil Chromagnon skifte til mindre effektive lineære metoder. For at opnå den bedste ydeevne er de eksempler, der er vist i figur 7B og figur 7C, derfor uønskede, og de fire regioner skal fyldes med objekter. Brugerne kan kontrollere, om et kvadratisk område i synsfeltet ikke er tilgængeligt for måling, ved at se på logfilen ("Chromagnon.log"; se protokoltrin 3.10). Heldigvis kan dette problem let løses ved at beregne flere biologiske kalibreringsbilleder eller ved hjælp af lokal justering for krydstale eller lyse feltreferencebilleder (tabel 2). I modsætning til tilfældet med manglende korrekt korrekte referencebilleder er det vanskeligere at identificere manglende korrektring af målbilleder. Da sådanne fejl opstår på grund af forskelle i filformater, billedbehandlingsforhold, billedbehandlingstider, billeddannelses-/justeringsmetoder mellem reference- og målbillederne (tabel 2), bør brugerne altid være forsigtige, når de bruger referencebilleder, der er opnået under forskellige forhold/tidspunkter fra målbillederne. Nogle eksempler billeder er tilgængelige for test (https://github.com/macronucleus/Chromagnon) for at opnå konkret idé om de gode og dårlige eksempel billeder.

Problem Forårsage Løsning
Referencebilledet kunne ikke rettes Lav kontrast Anskaf et billede med højere kontrast, hvis det er muligt. Hvis der bruges et klart feltreferencebillede, skal du hente billedet igen i en vandbaseret løsning for at opnå større kontrast i cellen. Alternativt kan du prøve at anvende beregningsmæssig støjreduktion (f.eks. gaussisk filtrering). Slå lokal justering fra, som er mere støjfølsom.
Forurening af uafhængige billeder Fjern kilden til de ikke-relaterede billeder i eksemplet, hvis det er muligt. For krydstale reference billeder, kontrollere excitation spektre af farvestoffer, der anvendes til målet billeder. Hvis farvestofferne er ophidsede under erhvervelsen af et krydstalebillede (f.eks. Hvis støv på kamerachippen skaber en tydelig kanalforskel, skal du rengøre kamerachippen eller bruge en beregningsmetode med flad fielding.
Et ekstremt lyspunkt lavet af en kosmisk stråle Anskaf billedet igen, hvis det er muligt. Alternativt kan du prøve at anvende beregningsmæssig støjreduktion (f.eks. median- eller gaussisk filtrering).
Deconvolution artefakter (kunstige signaler på den aksiale og laterale kanter) Beskære kantpixel eller Z-sektioner efter deconvolution. Hvis den ene side er beskåret, skal den anden side også beskæres for at bevare billedets centrum.
Z-trinstørrelsen er for sparsom En Z-stak skal anskaffes for at opfylde Nyquist-kriteriet som skrevet i protokol 2.1.3.
Optisk aberration Sfærisk aberration er den største afvigelse forårsaget af brugere. Vælg den rigtige objektive linse til prøven og bruge en coverslip tykkelse på 170 μm. Hvis objektivet linse er udstyret med en korrektion ring, justere den for at finde den position, hvor den højeste fluorescens tæller er opnået fra fokus. I tilfælde af et oliedænsningsmål uden korrektionsring justeres brydningsoliens brydningsindeks, der øger fluorescenstallet i fokus.
Synsfelt er ubesatte (fig. 7) I tilfælde af biologiske kalibrering reference billeder, gennemsnit mange billeder. I tilfælde af krydstale eller lyse felt reference billeder, skal du bruge lokale justering.
En uidentificeret softwarefejl Rapportér problemet via GitHub (https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)
Målbilledet kunne ikke rettes Metadata for billedfilen går tabt Brug det oprindelige mikroskopfilformat, der indeholder komplette metadata, og undgå at konvertere til en flersidet tiff-fil før behandling. Brug samme rækkefølge af kanaler som skrevet i protokol 3.3.
Forkerte justeringsmetoder for den givne mikroskopi Anvend ikke den lokale justeringsmetode, når der måles fra biologiske kalibreringsreferencebilleder til målbilleder. Brug ikke krydstalereferencebilleder, bortset fra bredfeltmikroskopi.
Forskelle i billeddannelsesforhold Billeddannelsesforholdene holdes konstante mellem reference- og målbillederne som skrevet i protokol 2.3.3.
Forskelle i stikprøve (herunder coverslip) Brug altid det samme monteringsmedium, dækslæbe (f.eks. nr. 1,5 H) og en lignende fokusdybde.
Mikroskopafdrift siden kalibreringen sidst blev foretaget Lav en kalibrering så ofte som hver anden uge. Hold temperaturen konstant, og bruge en flydende tabel for at undgå hardware drift af mikroskopet.

Tabel 2: Fejlfinding i forbindelse med kromatisk korrektion.

Figure 7
Figur 7: Eksempler på referencebilleder. Nuklear kuvert i fissionsgærceller mærket med GFP og mCherry. Billeder blev erhvervet med konventionel bredfeltmikroskopi. Kromatiske skift blev korrigeret ved hjælp af Chromagnon uden lokal justering ved hjælp af selve billederne som referencebilleder. Billeder blev derefter dekonroveret for at vise detaljerne. (A) Et godt eksempel med mange objekter i synsfeltet. (B) Et dårligt eksempel med objekter kun i øverste venstre hjørne. Forskydning er indlysende på en bestemt region af billedet. (C) Et uønsket eksempel, hvor en af firlsektionen (adskilt af punkterede tværgående linjer) er tom. Vægtlinjen i panel A angiver 5 μm for den fulde feltvisning og 1,25 μm for den udvidede visning og gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.

I denne protokol beskrev vi tre forskellige referencetyper (tabel 1). Blandt dem, krydstale reference billeder og biologiske kalibrering reference billeder har brug for yderligere omhyggelig diskussion. Til krydstalereferencebilleder kan prøver, der er farves med DAPI eller Hoechst 33342, og som er monteret i glycerol eller kommercielle monteringsmedier, effektivt bruges til at justere de blå, grønne og røde kanaler. På samme måde kan Alexa Fluor 488 bruges til at justere de grønne og røde kanaler. Men at opnå krydstale fluorescens er ofte vanskeligt, da mange blå farvestoffer undtagen DAPI og Hoechst er svagere og henfald hurtigere end de fleste grønne og røde farvestoffer. Desuden er emissionsspektrene af moderne farvestoffer smallere, hvilket gør tilpasningen af mere end tre kanaler ved denne metode udfordrende. Opmærksomheden bør også rettes mod nogle almindelige røde farvestoffer (f.eks. Alexa Flour 568 og 594, men ikke Alexa Fluor 555), der kan ophidses af violet lys, som forhindrer at opnå krydstalebilleder med høj kontrast fra blå farvestoffer. En anden ulempe er, at denne metode ikke kan måle den kromatiske aberration af excitation lysstier i flerfarvet excitation, fordi kun en enkelt excitation bølgelængde bruges til excitation (Tabel 1). Da de fleste avancerede mikroskopi bruger ændret belysning optik, anvendelsen af denne metode er begrænset. Alligevel er dens højere korrektion nøjagtighed tilstrækkeligt fordelagtigt for det at blive beskrevet i denne protokol. Generelt bør en krydstale billede tages efter et mål billede for at forhindre blegning eller fototoksiske effekter. For SMLM, der observeres med wide field-mode, skal der anskaffes et referencebillede, før der erhverves et målbillede, da fluorescensfarvestoffer kan bleges, mens der billeddiagnostiske midler.

Biologiske kalibreringsreferencebilleder giver brugerne mulighed for nemt at justere det ønskede antal kanaler på bekostning af yderligere prøveforberedelse. En anden fordel ved biologiske kalibrering reference billeder er tilgængeligheden af "gennemsnit" flere referencer, der hjælper med at udfylde alle synsfelter. Denne metode kan lide under forskelle i billeddannelsesforhold, hvis kalibreringsprøven fremstilles på et andet dias. Det meste af dette problem kan løses, hvis både mål og referencer fremstilles på samme dias ved hjælp af kommercielle chambered coverglasses (Tabel 1), og andre billeddannelsesforhold holdes konstante som i protokol trin 2.3.3. I dette tilfælde kan der forventes en korrektionsnøjagtighed svarende til krydstalereferencebillederne3. Protokollen til at bruge falloidin som vist her er en af de nemmeste måder at plette en enkelt cellulære struktur med flere farver. Der er mange mulige scenarier for at forberede biologiske kalibreringsprøver. Til immunfarvning kan en prøve mærkes med et enkelt primært antistof efterfulgt af farvning med sekundære antistoffer i flere farver. På denne måde kan en enkelt målstruktur mærkes med flere farver. Alternativt, 5-ethynyl-2'-deoxyuridin, opdaget af "klik" kemi etiketter nyligt syntetiseret DNA i flere farver ved høj tæthed, som beskrevet i detaljer tidligere8. For levende celler er det nyttigt at forberede en transgen stamme, der huser to kopier af et gen, der er smeltet til GFP eller mCherry for at mærke den samme struktur med to farver. Hvis genets kopinummer er kritisk, så ofte observeret for membranproteiner, kan en enkelt kopi af genet sammensmeltet til GFP og mCherry (Figur 7). Fotokonverterbare fluorescerende proteiner, såsom mEOS218, kan også bruges ved at belyse et moderat niveau af violet lys for at opnå både proteinarter med eller uden fotokonversion. Under lave iltforhold kan bruttoinvesteringer også bruges som et fotokonverterbart protein fra grøn til rød19,20. At vælge den rigtige kalibreringsprøve vil således gøre eksperimentet mere robust.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Numbers JP19H03202 til A.M., JP18H05528 og JP17H03636 til T.H., og JP17H01444 og JP18H05533 til H.Y. L.S. anerkender støtte fra Welcome Trust Strategic Awards 091911 og 107457/Z/15/Z finansiering avanceret billedbehandling på Micron Oxford.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% formaldehyde solution Polyscience 18814-10
35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Alexa Fluor 405 phalloidin Thermo Fisher Scientific A30104
Alexa Fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Alexa Fluor 594 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12381
Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16170078
Coverslip Matsunami No. 1S HT
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Dulbecco’s Modified Eagle Medium with L-Gln and sodium pyruvate Nacalai Tesque 08458-16
Mounting medium (VECTASHIELD) Vector Laboratories H-1000
Mouse anti-tubulin monoclonal antibody (TAT1) Described in Ref 15.
Nunc Lab-Tek II chambered coverglass (8 well) Thermo Fisher Scientific 155409
Rabbit anti-emerin polyclonal antibody (ED1) A gift from Hiroshi Yorifuji, Gunma University, Gunma, Japan and Kiichi Arahata, National Center of Neurology and Psychiatry, Tokyo, Japan; deceased.
Secondary antibody with Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11034
Secondary antibody with Alexa Fluor 555 Thermo Fisher Scientific A-21424
Secondary antibody with Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A-11032
TetraSpeck Microspheres, 0.2 µm Thermo Fisher Scientific T7280

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  2. Manders, E. M. M. Chromatic shift in multicolour confocal microscopy. Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).
  3. Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 7583 (2018).
  4. Grünwald, D., Singer, R. H. In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport. Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).
  5. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).
  9. Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  10. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  11. Schulz, O., et al. Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).
  12. Müller, C. B., Enderlein, J. Image Scanning Microscopy. Physical Review Letters. 104 (19), 198101 (1981).
  13. Hayashi, S., Okada, Y. Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics. Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).
  14. Yorifuji, H., et al. Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane. Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).
  15. Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies. Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).
  16. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  19. Sawin, K. E., Nurse, P. Photoactivation of green fluorescent protein. Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).
  20. Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. Photoactivation turns green fluorescent protein red. Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).

Tags

Biologi kromatisk aberration fluorescensmikroskopi superopløsningsbilleddannelse colocaliseringsanalyse cellebiologi billedbehandling
Korrektion med høj nøjagtighed af 3D-kromatisk forskydninger i en alder af biologisk billedbehandling i superopløsning ved hjælp af <em>Chromagnon</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matsuda, A., Koujin, T.,… More

Matsuda, A., Koujin, T., Schermelleh, L., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon. J. Vis. Exp. (160), e60800, doi:10.3791/60800 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter