Summary
Protokollen præsenterer en komplet valideret TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom og metoder til visualisering af østrogen receptorer ved immunhistokemi ved hjælp af immunofluorescens af formalin-faste kolon sektioner indlejret i paraffin.
Abstract
Crohns sygdom er den mest diagnosticerede form for inflammatorisk tarmsygdom. Kronisk betændelse udvikler sig i tarmen fører til peristalkse lidelse og skader på tarmslimhinden og synes at være forbundet med en øget risiko for kolon neoplastisk transformation. Akkumulerende beviser tyder på, at østrogener og østrogen receptorer påvirker ikke kun hormon-følsomme væv, men også andre væv ikke direkte relateret til østrogener, såsom lunger eller tyktarmen. Her beskriver vi protokollen for vellykket immunfluorescens farvning af østrogenreceptorer i tyktarmen fremstillet af en murinemodel af TNBS-induceret Crohns sygdom. En detaljeret protokol for induktion af Crohns sygdom i mus og tarm præparat er fastsat samt en trin-for-trin immunhistokemiske procedure ved hjælp af formalin-faste paraffin-indlejrede tarm sektioner. De beskrevne metoder er ikke kun nyttige for østrogen receptor afsløring og østrogen signalering undersøgelse in vivo, men kan også anvendes til for andre proteiner, som kan være involveret i udviklingen af colitis.
Introduction
Crohns sygdom (CD) er en inflammatorisk tarmsygdom (IBD) manifesteret som kronisk tarm betændelse. Ætiologien af CD er dårligt forstået, men der er et par vigtige faktorer, der synes at være ansvarlig for CD udvikling, herunder intestinal mikrobiota, og genetiske og miljømæssige faktorer, såsom kost eller stress1. For en bedre forståelse af patogenesen af Crohns sygdom, flere modeller af tarmbetændelse er blevet brugt2,3,4,5,6,7. I denne artikel præsenterer vi resultater opnået fra en 2,4,6-trinitrobenzen sulfonsyre (TNBS)-induceret murine model af CD.
Det er blevet dokumenteret, at østrogener er i stand til at modulere kronisk tarmbetændelse8,9,10,11,12. Den biologiske aktivitet af østrogener er medieret af cognate receptorer, blandt hvilke er nukleare østrogen receptorer (ERs), dvs ERα (gen ESR1) og ERβ (genESR2), samt G protein-koblet østrogen receptor, dvs GPER (gen GPER1), benævnt membran-bundet ER13,14. Der er flere metoder til bestemmelse af niveauet af østrogen receptorer, men kun få kan bruges til at visualisere dem i tarmen.
Immunhistokemi (IHC) er en udbredt metode i kliniske og grundlæggende undersøgelser til påvisning af visse antigener i celler eller væv med fluoromoni-konjugerede antistoffer. IHC synes at være en vigtig metode i vævsstruktur visualisering, samt i identifikation og lokalisering af specifikke proteiner, som kan være afgørende for at forstå udviklingen af colitis. Her præsenterer vi en komplet og valideret protokol for immunhistokemisk visualisering af østrogenreceptorer i tarmen ved hjælp af immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev gennemført med samtykke fra det lokale etiske udvalg (28/łB29/2016) i overensstemmelse med Europa-Parlamentets og Rådets direktiv 2010/63/EU af 22.
1. TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom
BEMÆRK: Denne protokol bruger han-BALB/C-mus, der vejer 25-28 g. Dyr anbringes ved en konstant temperatur (22-24 °C) og relativ luftfugtighed 55 ± 5%, og holdes i en 12 timers lys/mørk cyklus med fri adgang til standard chow-pellets og postevand ad libitum.
- Placer musen i induktionskammeret, og luk låget tæt. Bedøve musen kortvarigt med isofluran (25% O2 med O2 strømningshastighed på 1,5-2 L/min).
BEMÆRK: Respirationsfrekvensen bør forblive rytmisk og langsommere end normalt og bør ikke ændres som reaktion på en skadelig stimulus. - Instill 4 mg TNBS i 0,1 ml 30% ethanol i 0,9% NaCl eller 0,1 ml 30% ethanol i 0,9% NaCl som et køretøj kontrol i det distale kolon gennem et kateter.
BEMÆRK: Kateteret skal forsigtigt indføres ca. 3 cm i anus. - Overvåg musen dagligt fra dag to til otte for kliniske parametre, herunder kropsvægt, rektal blødning, afføring konsistens og dødelighed.
- På dag otte, aflive musen ved cervikal dislokation.
Figur 1: Tidslinje for TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Adskillelse og makroskopisk evaluering af tyktarmen
BEMÆRK: En dag før kolonseparation fortyndes 100 μL antibiotikum i 1 ml fosfatbuffersaltvand (PBS) og henstår ved 4 °C natten over.
- Rengør huden over maven med 75% ethanol og steril gaze.
- Skær bugvæggen fra brystbenet til anus ved hjælp af steril saks og pincet.
- Afskær tyktarmen så tæt som muligt på anus og cecum.
- Placer tyktarmen på petriskålen. Skær tyktarmen langs fra anus i cecum ende. Rengør og vask tyktarmen 2-4 gange i kold antibiotisk-PBS opløsning.
- Udfør makroskopisk evaluering ved hjælp af en kaliper i henhold til tabel 1.
BEMÆRK: Væv vedhæftning* og erythema / blødning#, fækal blod# og diarré# er underlagt visuel vurdering. * Væv vedhæftning evaluere ved hjælp af en tre-punkts skala (0: kolon uden væv vedhæftning, 1: kolon med moderat væv vedhæftning, 2: kolon med omfattende væv vedhæftning); #baseret på fravær (0) eller tilstedeværelse (1) af erythema/blødning, fækal blod og diarré.
| Vedhæftning* | Erythema/ blødning# | Fækal blod# | Diarré# | Længden af sår | Kolontykkelse | Kolonlængde |
| point (0 – 2) | point (0 – 1) | point (0 – 1) | point (0 – 1) | cm/point | mm/punkter | cm/point |
| 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0 – fraværende | 0,5 cm = 0,5 point | n mm = n punkter | 0 – <10 % kortere end kontrolelementet |
| 1 – moderat | 1 – til stede | 1 – til stede | 0.5 – let/løs afføring | 1 – fra 10 til 20% kortere end styringen | ||
| 2 – til stede | 1 – til stede | 2 – over 20 % kortere end styringen |
Tabel 1: Makroskopisk scoring af tarmen af mus med TNBS-induceret model af Crohns sygdom.
- Omtædning sår i centimeter til et punkt skala, dvs hver 0,5 cm af sår tælles som 0,5 point. Kolonens tykkelse omregnes i millimeter til en punktskala, n dvs. n
- Konverter længden af tyktarmen i centimeter på en tre-punkts skala. Længden af kolon opnået fra hver mus med TNBS-induceret Crohns sygdom vurderes i forhold til den gennemsnitlige kolonlængde for kontrolgruppen (0: <10% kortere end kontrol, 1: fra 10 til 20% kortere end kontrol, 2: over 20% kortere end kontrol).
- Beregn den samlede makroskopiske score i henhold til ligningen: Samlet makroskopisk score = vedhæftning (point) + erythema /blødning (point) + fækal blod (point) + diarré (point) + længden af sår (point) + kolon tykkelse (point) + kolon længde (point).
3. Kolon prøve forberedelse
- Skær tyktarmen i 1-2 cm fragmenter og læg hver på svamp en passende mærket histologisk kassette.
BEMÆRK: Svampe til histologiske kassetter forhindrer kolonfoldning under dehydrering og inkubation i flydende paraffin. - Kolonfragmentet anbringes i 4% formaldehyd og inkuberes i mindst 24 timer ved 4 °C.
- Forbered og programmer vævsprocessoren til 1 timers inkubation i 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethanol, xylen/100% ethanol (1:1; v/v) og kun xylen samt for mindst 3 timers inkubation i flydende paraffin.
BEMÆRK: Dehydrering skal udføres i stigende koncentrationer af ethanol og xylen, men koncentrationen af ethanol kan ændres. Xylen/ethanolblandingen anbefales, men ikke påkrævet. - Overfør kolonfragmentet til en histologisk kasse og sted i den forprogrammerede vævsprocessor.
- Kør vævsprocessoren.
- Efter inkubation trin, placere tyktarmen fragment i en metal skimmel, således at de to ender af tyktarmen er i en oprejst position og fylde en tredjedel af formen med flydende paraffin.
- Placer formen i køleområdet (-5 °C) i et par sekunder, og derefter flytte formen til opvarmning område (70 °C). Placer i den nederste del af den histologiske boks og dække hele kolon fragment med flydende paraffin.
- Lad metalformen med kolonfragmentet i paraffin i et par minutter i køleområdet. Fjern metalformen fra paraffinblokken, og inkuber i mindst 24 timer ved 4 °C.
- Fjern overskydende paraffin fra blokken og indsæt det i en fuldautomatisk roterende mikrotom.
BEMÆRK: Paraffinblokken kan opbevares ved -20 °C i et par minutter før dette trin. - Skær kolonfragmentet i 5 μm sektioner.
- Overfør tyktarmen sektion til et vandbad forvarmet til 40 °C.
- Brug den mærkede glasrutsjebane til at fjerne kolonsektionen fra vandbadet.
BEMÆRK: Kolonsektionerne flyder på vandet. Sæt den mærkede glasrutsjebane i vandet under tyktarmen sektion og træk glasdiaset forsigtigt. - Lad glasrutsjebanen være 24 timer ved stuetemperatur. Til langtidsopbevaring opbevares glasslæden ved 4 °C efter 24 timers inkubation ved stuetemperatur.
4. Immunhistokemi med immunofluorescensfarvning
BEMÆRK: Kolonsektionen må ikke tørre på noget trin under proceduren.
- Fjern paraffin ved at inkubere glasslidsen i xylen i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
- Glasslæden anbringes i xylen/100% ethanol (1:1; v/v) i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
- Rehydrere tyktarmen sektion i en række faldende ethanol koncentrationer, dvs 70%, 50%, 30% og 10% ethanol i 5 min. Gentag hvert trin tre gange.
- Skyl glasrutsjebanen under rindende vand i 5 min.
- Forvarm antigenudtagningsbuffer (10 mM natriumcitrat; 0,05% Tween 20, pH 6.0) til 95-98 °C og opvarmes glasdiaset i kogende antigenudtagningsopløsning i 10 min.
BEMÆRK: Antigenudtagningstrinnet er valgfrit, men anbefales. Afdækningsopløsningen skal optimeres afhængigt af det antistof, der anvendes i forsøget. - Tegn en cirkel rundt om kolonsektionen ved hjælp af en hydrofob pen.
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, men anbefales. Den hydrofobe pen forhindrer spild af reagenser ved at holde væsken samlet i en lille volumen inde markeret cirklen. - Inkubersektionen i 3% vandopløsning af hydrogenperoxidase i 10 min.
- Vaskeopløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) i 5 min.
- Inkuber i blokerende opløsning (5% normalt gedeserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: I den blokerende opløsning skal det normale serum være fra samme art som det sekundære antistof. I trin, hvor inkubation er påkrævet, skal glasslæden placeres i et fugtighedskammer for at forhindre overdreven fordampning. - Blokereopløsningen fjernes, og der tilsættes 20-50 μL primært antistof mod ERα, ERβ eller GPER fortyndet i 1% bovinserumalbumin med 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
BEMÆRK: De anbefalede fortyndinger af primære antistoffer er vist i tabel 2.
| Antistoftype | Antistof mod | Clonalitet | Værtsarter | Reaktivitet af arter | Fortynding |
| Primære | ERα (ERα) | Polyklonale | Kanin | Menneskelige | 1:100 |
| Musen | |||||
| Skildpadde | |||||
| Capybara (Capybara) | |||||
| ERβ (ERβ) | Polyklonale | Kanin | Menneskelige | ||
| Abe | |||||
| Rotte | |||||
| Musen | |||||
| Får | |||||
| Gris | |||||
| GPER (GPER) | Polyklonale | Kanin | Menneskelige | ||
| Rotte | |||||
| Musen | |||||
| Sekundære | DyLight 650 | Polyklonale | Ged | Kanin | 1:250 |
Tabel 2: Antistoffernes karakteristika.
- Inkuber med primært antistof natten over ved 4 °C i mørke.
- Antistofopløsningen fjernes og vaskes i vaskeopløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
- Der tilsættes 20-50 μL DyLight 650 sekundært antistof fortyndet i 1% bovinserumalbumin (indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Inkuber med sekundært antistof konjugeret med farvestof i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
BEMÆRK: Den anbefalede fortynding af det sekundære antistof er vist i tabel 2. - Antistofopløsningen fjernes og vaskes i vaskeopløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
- Der tilsættes 2% DiOC6(3), fortyndet i 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl og inkuberes i 10 min ved stuetemperatur i mørke.
- Opløsningen fjernes og vaskes i vaskeopløsning (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
- Tilsæt et par dråber glycerol-baseret væske med DAPI direkte på tyktarmen sektion og dække omhyggeligt med et dæksel dias. Indvæn tyktarmen i mindst 24 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: Undgå luftbobler, når du dækker vævet med dækselsglasset. - Analysere kolon sektion under konfokale mikroskop byder 20x eller 63x mål og olie nedsænkning ved hjælp af dedikeret software.
BEMÆRK: Tabel 3 viser karakteristika for de fluoromer, der anvendes i denne undersøgelse.
| Fluorochome type | Bølgelængde (nm) | Farvestof | |
| Excitation | Emission | ||
| DAPI (DAPI) | 405 | 460 – 480 | Blå |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Grøn |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | Rød |
Tabel 3: Fluoromkroners karakteristika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Makroskopisk karakter i koloner hos mus med TNBS-induceret Crohns sygdom
Repræsentative billeder af koloner taget fra kontrol og TNBS-behandlede mus er vist i figur 2. I mus med en TNBS-induceret model af Crohns sygdom reduceres tyktarmens længde, mens tyktarmens bredde øges.
Figur 2: Repræsentativt kolon fra kontrolmusene (kontrol) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Klik her for at se en større version af dette tal.
De evaluerede makroskopiske parametre er angivet i tabel 1. Administration af TNBS til mus fører til en stigning i den samlede colon makroskopisk score (Figur 3A) og inflammationlængde (Figur 3B) i forhold til kontrolmusene.
Figur 3: Samlet makroskopisk score i tyktarmen (A) og den samlede kolonsyreinflammationslængde (B) i kontrolmus (kontrol) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Ti mus pr. gruppe. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af One-Way ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post-hoc test. Data præsenteres som midler ± SEM; ***p < 0,001 TNBS vs. kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Østrogen receptor antistof validering
Validering af specificiteten af østrogen receptor antistoffer, der anvendes i undersøgelsen blev udført ved hjælp af MCF-7 celler. MCF-7 celler blev valgt baseret på tidligere undersøgelser, hvor flere uafhængige forskere fandt, at østrogen receptorer er til stede på mRNA og protein niveauer. Som vist iFigure 4BFigure 4C figur 4gør de antistoffer , der anvendes i undersøgelsen , det muligtFigure 4Aat påvise både nukleare østrogenreceptorer, dvs. Nuklearøstrogen receptorer er lokaliseret i cytoplasmaet og kerner, og signalet fra GPER farvning er kun til stede i cytoplasmaet af MCF-7 celler.
Figur 4: Repræsentative billeder af immunfluorescensfarvning af ERα (A), ERβ (B) og GPER (C) i MCF-7-cellerne. Detaljeret beskrivelse øverst på billederne. Skalastænger: 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ud over den positive kontrol blev der også udført en negativ kontrol, hvor kun det sekundære antistof blev anvendt. Figur 5 viser et billede af MCF-7-celler, der kun farves med sekundært antistof konjugeret med fluoromkrom og glycerolbaseret væske med DAPI.
Figur 5: Repræsentativt billede af immunfluorescensfarvning af DyLight 650 i MCF-7-cellerne. Yderligere beskrivelse er tilgængelig over billedet. Skalastænger: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Østrogen receptor lokalisering i TNBS-induceret murine model af Crohns sygdom
Der blev fundet et stærkt cytoplasmatisk signal om ERα i tyktarmen fra kontrolmus og mus med TNBS-induceret Crohns sygdom (figur 6A). Men det fremgår, at kun i tarmen opnået fra kontrol mus havde ERα lokaliseret i bægercellecytoplasma. Konfokal mikroskopi afslørede også cytoplasmatisk lokalisering af ERβ i tyktarmen del af både kontrol og TNBS-behandlede mus (Figur 6B). Tilsvarende blev cytoplasmatisk lokalisering af GPER dokumenteret i tyktarmen sektion opnået fra kontrol mus og TNBS-behandlede mus (Figur 6C).
Figur 6: Repræsentative billeder af immunfluorescensfarvning af ERα (A), ERβ (B) og GPER (C) i tyktarmen, der er fremstillet af kontrolmus (kontrol) og TNBS-behandlede mus (TNBS). Yderligere beskrivelse er tilgængelig over hvert billede. Skalastænger: 50 μm; zoom skala linjer: 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er mange dyremodeller til IBD-patologiundersøgelse, herunder genetiske, immunologiske eller spontane modeller samt kemisk inducerede modeller15. Blandt de mange typer af dyremodeller af colitis, kemisk inducerede modeller såsom TNBS-induceret model, der er beskrevet i denne protokol, er relativt billige og nemme at opnå. Den TNBS-inducerede murine model af colitis har flere kliniske symptomer relateret til den patologiske grundlag af CD. Dyr med induceret colitis er karakteriseret ved inkonsekvent afføring dannelse, blodig diarré og tab af kropsvægt. Men, Dette betyder ikke, at denne model kan bruges til at studere CD etiopathogenesis udelukkende. Den TNBS-inducerede model anbefales og anvendes ofte, for eksempel til potentiel terapeutisk screening. I tilfælde af kemisk induceret colitis er det nødvendigt at fremhæve nogle kritiske punkter. TNBS skal fortyndes i ethanol, som forstyrrer slimhindebarrieren og gør det muligt for TNBS at trænge gennem tarmvæggen og interagere med proteiner med høj molekylvægt, hvilket fører til et cellulært medieret immunrespons2,16,17. Både TNBS-dosis og ethanolkoncentrationen bør optimeres til musestammen og -vægten. For høj tnbs-dosis og ethanolkoncentration kan forårsage overdreven dødelighed, hvilket forhindrer yderligere analyse. På den anden side kan for lav TNBS-dosis og ethanolkoncentration forårsage dårlig respons og unødigt forlænge forsøget.
Tarmen fra mus med TNBS-induceret colitis kan undersøges ikke blot på makroskopisk niveau, som beskrevet i denne protokol, men kan også anvendes til biokemisk og molekylær analyse. En nyttig metode til at studere både udtryk og lokalisering er en immunhistokemisk teknik med brug af immunfluorescens. Dog skal nogle kritiske skridt indgå i udarbejdelsen og gennemførelsen af IHC for formalin-faste paraffin-indlejret murine kolon sektioner. Det første afgørende skridt, dvs forberedelse af tyktarmen bestemmer kvaliteten af resultaterne. Fikseringstiden, som afhænger af vævstykkelsen, skal optimeres. En anden afgørende fase er dehydrering, som bør udføres forsigtigt ved flere inkubationer i stigende koncentrationer af ethanol. Endelig er den korrekte placering af tyktarmen i formen afgørende for at generere de korrekte tværsnit. Vævspræparat er ikke det eneste vigtige spørgsmål i immunhistokemi. Selv om antigenudtagning er et valgfrit trin, forekommer det nødvendigt i formalinfaste paraffinindlejrede sektioner. Under fiksering med formaldehyd dannes methylenbroer mellem proteiner, og proteinkrydsbindingsmasker antigensteder18. Der er to hovedmetoder, baseret på varme- eller enzymatisk-induceret (trypsin, pepsin eller proteinase K) antigen hentning. Varmeinduceret antigenudtagning, udført i natriumcitratbuffer, ethylenediamintetraeddikesyre (EDTA) buffer eller Tris-EDTA buffer, er mere udbredt, fordi det ikke påvirker cellemorfologi. Antigenoptagelsestypen og betingelserne skal justeres eksperimentelt. Det skal bemærkes, at antigenudtagningsmetoden nogle gange bestemmes af det antistof, der anvendes i forsøgene. Permeabilisering er en tilstand, der er afhængig af det undersøgte antigen, og er nødvendig især for intracellulære proteiner. Der er flere tilgange, der bruger opløsningsmidler (acetone eller methanol) og barske (Triton X-100 eller NP-40) samt milde (Tween 20 eller saponin) rengøringsmidler. I denne protokol blev to vaskemidler anvendt samtidigt, dvs. Det skal understreges, at permeabilisering skal optimeres afhængigt af det anvendte antistof. Blokering af ikke-specifikke bindingssteder er særlig vigtig under immunhistokemisk analyse. Blokeringsopløsningerne omfatter normalt serum, kvægserumalbumin eller endda brugsklare blokeringsopløsninger. I denne protokol anbefales det, at der anvendes både normalt serum og serumalbumin. Som allerede nævnt i protokollen bør blokeringsopløsningen indeholde normalt serum fra samme art som det sekundære antistof.
Endelig kan IHC-detektion ved immunfluorescens som beskrevet i denne protokol udvides til at omfatte farvning af andre proteiner i undersøgelser af proteinproteininteraktion. Når man søger samlokalisering af udvalgte proteiner, skal visse betingelser være opfyldt. Fluoromkromer bør vælges på grundlag af excitations- og emissionsspektre. Dette trin er afgørende for at eliminere spektrale overlapninger og skal udføres i forsøgets planlægningsfase. I denne protokol anvendes tre fluoromer, dvs. Som vist i tabel 3, DyLight 650 anvendes til østrogen receptor detektion er observeret som et rødt farvestof med 654 nm excitation og emission ved 660-680 nm. Til pletter cellekerner og den indre membran anvendes DyLight 650 sammen med DAPI nuklear markør og DiOC6 (3) membranmarkør. DAPI er observeret som et blåt farvestof med 405 nm excitation og emission ved 460-480 nm. Til gengæld observeres DiOC6(3) som et grønt farvestof med 485 nm excitation og emission ved 538-595 nm. Farvning af det næste protein skal udføres efter trin 4.14, begyndende med blokeringstrinnet (se trin 4.9.). For to proteiner anbefales det at anvende farvningsantistoffer fra forskellige arter. Denne fremgangsmåde gør det muligt at udelukke binding af det farvestofkonjugerede sekundære antistof til det tidligere farvede protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev offentliggjort takket være den finansielle støtte fra University of Lodz myndigheder: Vicerektor for videnskabelig forskning, vicerektor for nationalt og internationalt samarbejde og dekanen for Fakultetet for Biologi og Miljøbeskyttelse. Damian Jacenik blev støttet af tilskud (2017/24/T/NZ5/00045 og 2015/17/N/NZ5/00336) fra National Science Centre, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
