Summary

İmmünofluoresans kullanarak TNBS'ye Bağlı Crohn Hastalığı olan Farelerin Kolonlarında Östrojen Reseptörlerinin Görüntülenmesi

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

Protokol, Crohn hastalığının tam doğrulanmış TNBS kaynaklı murine modelini ve parafine gömülü formalin-sabit kolon bölümlerinin immünororesansını kullanarak immünohistokimya ile östrojen reseptörlerinin görüntülenmesi için kullanılan yöntemleri sunar.

Abstract

Crohn hastalığı inflamatuar barsak hastalığının en çok tanı konulan tipidir. Bağırsakta gelişen kronik inflamasyon peristalsis bozukluğu ve bağırsak mukozası hasarına yol açar ve kolon neoplastik dönüşüm riski ile ilişkili gibi görünüyor. Kanıt birikmesi östrojen ler ve östrojen reseptörleri sadece hormona duyarlı dokuları etkiler gösterir, ama aynı zamanda diğer dokular doğrudan östrojen ile ilgili değil, akciğerler veya kolon gibi. Burada, tnbs kaynaklı Crohn hastalığının bir murine modelinden elde edilen kolonda östrojen reseptörlerinin başarılı immünororesans boyama protokolünü açıklıyoruz. Crohn hastalığının fare ve bağırsak preparatına indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol ve formalin-sabit parafin gömülü bağırsak bölümleri kullanılarak adım adım immünohistokimyasal bir prosedür sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler sadece östrojen reseptör algılama ve in vivo östrojen sinyal araştırma için yararlı değil, aynı zamanda kolit gelişiminde rol olabilir diğer proteinler için uygulanabilir.

Introduction

Crohn hastalığı (CD) kronik bağırsak iltihabı olarak kendini gösteren inflamatuar bir barsak hastalığıdır (IBD). CD etiyolojisi kötü anlaşılmaktadır, ancak cd gelişimi için sorumlu gibi görünen birkaç önemli faktörler vardır, bağırsak mikrobiyota dahil, ve genetik ve çevresel faktörler, diyet veya stres gibi1. Crohn hastalığının patogenezinin daha iyi anlaşılması için, bağırsak iltihabının çeşitli modelleri,2,3,34,5,6,7olarak kullanılmaktadır. Bu makalede, CD’nin 2,4,6-trinitrobenzene sülfonik asit (TNBS) kaynaklı murine modelinden elde edilen sonuçları satıyoruz.

Bu östrojenler kronik bağırsak iltihabı8,9,,10,,11,12modüle yeteneğine sahip olduğu belgelenmiştir. Östrojenlerin biyolojik aktivitesi, aralarında nükleer östrojen reseptörleri (ER), yani ERα (ESR1geni) ve ERβ (ESR2geni) ve G proteinle birleşen östrojen reseptörü, yani GPER (gen GPER1),membrana bağlı ER13,14gibi konjenital reseptörler tarafından aracılık edilir. Östrojen reseptörlerinin düzeyini belirlemek için çeşitli yöntemler vardır, ama sadece birkaç bağırsakta onları görselleştirmek için kullanılabilir.

İmmünohistokimya (IHC), florokrom konjuge antikorları olan hücre veya dokularda bazı antijenlerin saptanması için klinik ve temel çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. IHC doku yapısı görselleştirme önemli bir yöntem gibi görünüyor, yanı sıra belirlenmesi ve kolit gelişimini anlamak için çok önemli olabilir belirli proteinlerin lokalizasyonu. Burada, immünoresans kullanarak bağırsakta östrojen reseptörlerinin immünohistokimyasal görüntüleme için tam ve doğrulanmış bir protokol salıyoruz.

Protocol

Hayvan çalışmaları, Avrupa Parlamentosu’nun 2010/63/AB Direktifi ve 22 Eylül 2010 Tarihli Konsey Direktifi ve kurumsal tavsiyeler doğrultusunda Yerel Etik Komitesi’nin (28/ŁB29/2016) onayı ile gerçekleştirilmiştir. 1. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı ürinen üriner modeli NOT: Bu protokol, 25-28 g. Ağırlığındaki erkek BALB/C farelerini kullanır. ad libitum Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatı…

Representative Results

TNBS’ye bağlı Crohn hastalığı olan farelerde kolonların makroskopik özellikleriKontrolden alınan kolonlar ve TNBS ile tedavi edilen farelerin temsili görüntüleri Şekil 2’degösterilmiştir. Crohn hastalığının TNBS kaynaklı modeli olan farelerde, kolon genişliği artarken kolon uzunluğu azalır. <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/6…

Discussion

Genetik, immünolojik veya spontan modeller de dahil olmak üzere IBD patofizyolojisi muayenesi için çok sayıda hayvan modeli, yanı sıra kimyasal olarak indüklenen modeller15vardır. Kolitin çeşitli hayvan modelleri arasında, bu protokolde açıklanan TNBS kaynaklı model gibi kimyasal kaynaklı modeller nispeten ucuz ve elde edilmesi kolaydır. Kolitin TNBS’ye bağlı murine modelinde CD’nin patolojik temeli ile ilgili çeşitli klinik semptomlar vardır. İndüklenen kolit olan hayvanla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma, Lodz Üniversitesi yetkililerinin mali desteği sayesinde yayınlandı: Bilimsel Araştırmadan Sorumlu Rektör Yardımcısı, Ulusal ve Uluslararası İşbirliğinden Sorumlu Rektör Yardımcısı ve Biyoloji ve Çevre Koruma Fakültesi Dekanı. Damian Jacenik, Polonya Ulusal Bilim Merkezi’nden (2017/24/T/NZ5/00045 ve 2015/17/N/NZ5/00336) hibeler ile desteklenmiştir.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

References

  1. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
  2. Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  3. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  4. Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
  5. Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
  6. Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
  7. Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
  8. Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
  9. Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
  10. Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
  11. Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
  12. Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
  13. Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
  14. Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
  15. Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
  16. Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
  17. Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
  18. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).

Play Video

Cite This Article
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

View Video