Summary
Le protocole présente un modèle murine TNBS-induit complet de Crohn' la maladie de s et des méthodes pour visualiser des récepteurs d’oestrogène par immunohistochemistry utilisant l’immunofluorescence des sections formelles-fixes de colon incorporées dans la paraffine.
Abstract
La maladie de Crohn est le type le plus diagnostiqué de maladie inflammatoire de l’intestin. L’inflammation chronique se développant dans l’intestin mène au désordre de périsphyse et aux dommages de la muqueuse intestinale et semble être associée à un risque accru de transformation néoplastique du côlon. L’accumulation de preuves indique que les œstrogènes et les récepteurs d’oestrogène affectent non seulement les tissus hormono-sensibles, mais aussi d’autres tissus non directement liés aux oestrogènes, tels que les poumons ou les colons. Ici, nous décrivons le protocole pour la coloration réussie d’immunofluorescence des récepteurs d’oestrogène dans le côlon obtenu d’un modèle murin de Crohn-induit de TNBS' la maladie de s. Un protocole détaillé pour l’induction de crohn' la maladie de s chez la souris et la préparation d’intestin est fourni aussi bien qu’une procédure immunohistochimique étape par étape utilisant des sections formelles-définies d’intestin paraffin-embedded. Les méthodes décrites sont non seulement utiles pour la détection des récepteurs d’oestrogène et l’étude de signalisation d’oestrogène in vivo mais peuvent également être appliquées pour d’autres protéines qui peuvent être impliquées dans le développement de la colite.
Introduction
Crohn' la maladie de s (CD) est une maladie inflammatoire d’entrailles (IBD) manifestée comme inflammation chronique d’intestin. L’étiologie du CD est mal comprise, mais il ya quelques facteurs majeurs qui semblent être responsables du développement de CD, y compris le microbiote intestinal, et des facteurs génétiques et environnementaux, tels que l’alimentation ou le stress1. Pour une meilleure compréhension de la pathogénie de la maladie de Crohn, plusieurs modèles d’inflammation intestinale ont été utilisés2,3,4,5,6,7. Dans cet article, nous présentons des résultats obtenus à partir d’un modèle de sulfonique de 2,4,6 trinitrobenzene (TNBS) induit de CD.
Il a été documenté que les oestrogènes sont capables de moduler l’inflammation intestinale chronique8,9,10,11,12. L’activité biologique des oestrogènes est médiatisée par les récepteurs cognate, parmi lesquels les récepteurs d’oestrogène nucléaire (ER), c’est-à-dire ERMD (gène ESR1) et ERMD (gène ESR2), ainsi que le récepteur d’oestrogène couplé à la protéine G, c’est-à-dire GPER (gène GPER1), appelé ERER 13,14. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le niveau des récepteurs d’oestrogène, mais seulement quelques-uns peuvent être utilisés pour les visualiser dans l’intestin.
L’immunohistochimie (IHC) est une méthode largement utilisée dans les études cliniques et fondamentales pour la détection de certains antigènes dans les cellules ou les tissus avec des anticorps fluorochrome-conjugués. IHC semble être une méthode importante dans la visualisation de la structure tissulaire, ainsi que dans l’identification et la localisation de protéines spécifiques, qui peuvent être cruciales pour comprendre le développement de la colite. Ici, nous présentons un protocole complet et validé pour la visualisation immunohistochimique des récepteurs d’oestrogène dans l’intestin utilisant l’immunofluorescence.
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Protocol
Des études sur les animaux ont été menées avec le consentement du Comité local d’éthique (28/29/2016) conformément à la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010, ainsi que des recommandations institutionnelles.
1. Modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn
REMARQUE : Ce protocole utilise des souris BALB/C mâles pesant 25-28 g. Les animaux sont logés à une température constante (22-24 oC) et, humidité relative 55 à 5%, et maintenus dans un cycle léger/obscurité de 12 h avec un accès gratuit aux granulés standard et à l’eau du robinet ad libitum.
- Placer la souris dans la chambre d’induction et fermer le couvercle fermement. Anesthésiez brièvement la souris avec l’isoflurane (25% O2 avec un débit O2 à 1,5-2 L/min).
REMARQUE : Le taux respiratoire doit rester rythmé et plus lent que la normale et ne doit pas changer en réponse à un stimulus nocif. - Inculquez 4 mg de TNBS dans 0,1 ml d’éthanol de 30 % dans 0,9 % de NaCl ou 0,1 mL de 30 % d’éthanol dans 0,9 % de NaCl en tant que véhicule contrôlant le côlon dans le côlon par un cathéter.
REMARQUE : Le cathéter doit être soigneusement introduit environ 3 cm dans l’anus. - Surveillez la souris quotidiennement du deuxième au huitième jour pour obtenir des paramètres cliniques, y compris le poids corporel, les saignements rectales, la consistance des selles et la mortalité.
- Le huitième jour, euthanasiez la souris par dislocation cervicale.
Figure 1 : Chronologie du modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
2. Séparation et évaluation macroscopique du côlon
REMARQUE : Un jour avant la séparation du côlon, diluer 100 l d’antibiotique dans 1 ml de tampon de phosphate saline (PBS) et laisser à 4 oC pendant la nuit.
- Nettoyer la peau sur l’abdomen à l’aide de 75% d’éthanol et de gaze stérile.
- Couper la paroi abdominale du sternum à l’anus à l’aide de ciseaux stériles et de pinces à épile.
- Couper le côlon aussi près que possible de l’anus et du cecum.
- Déposer le côlon sur le plat Petri. Couper le côlon le long de l’anus dans l’extrémité de ccum. Nettoyer et laver le côlon 2-4 fois dans la solution antibiotique-PBS froide.
- Effectuez une évaluation macroscopique à l’aide d’un étrier selon le tableau 1.
REMARQUE : L’adhérencetissulaire et l’érythème/hémorragie,le sang fécal etla diarrhée font l’objet d’une évaluation visuelle.# * L’adhérence tissulaire évalue à l’aide d’une échelle de trois points (0 : colon sans adhérence tissulaire, 1 : côlon avec l’adhérence modérée de tissu, 2 : côlon avec adhérence étendue de tissu); -basé sur l’absence (0) ou la présence (1) de l’érythème/hémorragie, du sang fécal et de la diarrhée.
| Adhésion* | Érythème/ hémorragie# | Sang fécal# | Diarrhée# | Longueur de l’ulcère | Épaisseur du côlon | Longueur de colon |
| points (0 à 2) | points (0 à 1) | points (0 à 1) | points (0 à 1) | cm/points | mm/points | cm/points |
| 0 - absent | 0 - absent | 0 - absent | 0 - absent | 0,5 cm à 0,5 point | n mm et n points | 0 - lt;10% plus court que le contrôle |
| 1 - modéré | 1 - présent | 1 - présent | 0.5 - selles légères/lâches | 1 - de 10 à 20% plus court que le contrôle | ||
| 2 - présent | 1 - présent | 2 - plus de 20% plus court que le contrôle |
Tableau 1 : Notation macroscopique de l’intestin des souris avec le modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn.
- Convertir la longueur de l’ulcère en centimètres en échelle de point, c’est-à-dire que tous les 0,5 cm d’ulcère sont comptés comme 0,5 point. Convertir l’épaisseur du côlon en millimètres à une échelle de point, c’est-à-dire, chaque n mm correspond à n points.
- Convertir la longueur du côlon en centimètres sur une échelle de trois points. La longueur du côlon obtenue de chaque souris atteinte de la maladie de Crohn induite par le TNBS est évaluée par rapport à la longueur moyenne du côlon pour le groupe témoin (0 : 'lt;10% plus courte que le contrôle, 1: de 10 à 20% plus courte que le contrôle, 2: plus de 20% plus courte que le contrôle).
- Calculez le score macroscopique total en fonction de l’équation : score macroscopique total , adhérence (points) , érythème/hémorragie (points) - sang fécal (points) , diarrhée (points) - longueur d’ulcère (points) - épaisseur du côlon (points) et longueur du côlon (points).
3. Préparation de l’échantillon de colon
- Couper le côlon en fragments de 1-2 cm et les placer sur une éponge dans une cassette histologique correctement étiquetée.
REMARQUE : Les éponges pour les cassettes histologiques empêchent le pliage du côlon pendant la déshydratation et l’incubation dans la paraffine liquide. - Placer le fragment de côlon dans 4% de formaldéhyde et incuber pendant au moins 24 h à 4 oC.
- Préparer et programmer le processeur tissulaire pour 1 h d’incubation dans 50%, 70%, 90%, 95%, 100% d’éthanol, xylène/100% d’éthanol (1:1; v/v), et xylène seulement, ainsi que pour au moins 3 h d’incubation dans la paraffine liquide.
REMARQUE : La déshydratation doit être effectuée dans des concentrations croissantes d’éthanol et de xylène, mais la concentration d’éthanol peut être modifiée. Le mélange de xylène/éthanol est recommandé mais pas nécessaire. - Transférer le fragment de côlon dans une boîte histologique et placer dans le processeur de tissu préprogrammé.
- Exécutez le processeur de tissu.
- Après les étapes d’incubation, placez le fragment de côlon dans un moule en métal de sorte que les deux extrémités du côlon soient en position verticale et remplissent un tiers du moule avec la paraffine liquide.
- Placer le moule dans la zone de refroidissement (-5 oC) pendant quelques secondes, puis déplacer le moule vers la zone de réchauffement (70 oC). Placer dans la partie inférieure de la boîte histologique et couvrir le fragment de côlon entier avec de la paraffine liquide.
- Laisser le moule métallique avec le fragment de côlon dans la paraffine pendant quelques minutes dans la zone de refroidissement. Retirer le moule métallique du bloc de paraffine et incuber pendant au moins 24 h à 4 oC.
- Retirez l’excès de paraffine du bloc et insérez-le dans une microtome rotative entièrement automatisée.
REMARQUE : Le bloc de paraffine peut être stocké à -20 oC pendant quelques minutes avant cette étape. - Couper le fragment de côlon en sections de 5 m.
- Transférer la section du côlon dans un bain d’eau préchauffé à 40 oC.
- Utilisez la glissière en verre étiquetée pour retirer la section du côlon du bain d’eau.
REMARQUE : Les sections du côlon flottent sur l’eau. Placez la glissière en verre étiquetée dans l’eau sous la section du côlon et retirez soigneusement la glissière en verre. - Laisser la lame de verre 24 h à température ambiante. Pour un stockage à long terme, maintenez la glissière en verre à 4 oC après 24 h d’incubation à température ambiante.
4. Immunohistochemistry avec coloration d’immunofluorescence
REMARQUE : Ne laissez pas sécher la section du côlon à n’importe quelle étape pendant la procédure.
- Retirer la paraffine en incuber la lame de verre dans le xylène pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
- Placer la lame de verre dans du xylène/100% d’éthanol (1:1; v/v) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
- Réhydratrant la section du côlon dans une série de concentrations décroissantes d’éthanol, c’est-à-dire 70 %, 50 %, 30 % et 10 % d’éthanol pendant 5 min. Répétez chaque étape trois fois.
- Rincer la glissière de verre sous l’eau courante pendant 5 min.
- Préchauffer le tampon antigène (10 mM de sodium citrate; 0,05% Tween 20, pH 6.0) à 95-98 oC et chauffer la glissière en verre en solution bouillante de récupération d’antigène pendant 10 min.
REMARQUE : L’étape de récupération d’antigène est facultative mais recommandée. La solution de démasquage doit être optimisée en fonction de l’anticorps utilisé dans l’expérience. - Dessinez un cercle autour de la section du côlon à l’aide d’un stylo hydrophobe.
REMARQUE : Cette étape est facultative mais recommandée. Le stylo hydrophobe empêche les déchets de réactifs en gardant le liquide mis en commun dans un petit volume à l’intérieur marqué le cercle. - Incuber la section dans 3% solution d’eau de peroxidase d’hydrogène pendant 10 min.
- Laver en solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) pour 5 min.
- Incubate dans la solution de blocage (sérum de chèvre normal de 5 % ; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 ; 150 mM NaCl; 0,05 % Triton X-100) pour 1 h à température ambiante.
REMARQUE : Dans la solution de blocage, le sérum normal doit provenre de la même espèce que l’anticorps secondaire. Dans les étapes où l’incubation est nécessaire, placez la glissière de verre dans une chambre d’humidité pour empêcher l’évaporation excessive. - Retirez la solution de blocage et ajoutez 20-50 l d’anticorps primaires contre ER, ER OU GPER dilué dans l’albumine de sérum bovin de 1% avec 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
REMARQUE : Les dilutions recommandées des anticorps primaires sont indiquées dans le tableau 2.
| Type d’anticorps | Anticorps contre | Clonalité | Espèces hôtes | Réactivité des espèces | Dilution |
| Primaire | ER | Polyclonaux | Lapin | Humain | 1:100 |
| Souris | |||||
| Tortue | |||||
| Capybara | |||||
| ER | Polyclonaux | Lapin | Humain | ||
| Singe | |||||
| Rat | |||||
| Souris | |||||
| mouton | |||||
| Porc | |||||
| GPER GPER | Polyclonaux | Lapin | Humain | ||
| Rat | |||||
| Souris | |||||
| Secondaire | DyLight 650 Annonces | Polyclonaux | Chèvre | Lapin | 1:250 |
Tableau 2 : Caractéristiques des anticorps.
- Incubate avec anticorps primaires pendant la nuit à 4 oC dans l’obscurité.
- Retirez la solution d’anticorps et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
- Ajouter 20-50 l d’anticorps secondaires DyLight 650 dilué dans 1% albumin de sérum bovin (contenant 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubate avec anticorps secondaires conjugués avec colorant pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
REMARQUE : La dilution recommandée de l’anticorps secondaire est indiquée dans le tableau 2. - Retirez la solution d’anticorps et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
- Ajouter 2% DiOC6(3) dilué en 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl et incubate pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
- Retirez la solution et lavez-vous dans la solution de lavage (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
- Ajouter quelques gouttes de liquide à base de glycérol avec DAPI directement sur la section du côlon et couvrir soigneusement avec une glissière de couverture. Incuber la section du côlon pour au moins 24 h à 4 oC.
REMARQUE : Évitez les bulles d’air lorsque vous recouvrez le tissu avec la glissière de couverture. - Analyser la section du côlon sous microscope confocal avec des objectifs 20x ou 63x et l’immersion d’huile à l’aide de logiciels dédiés.
REMARQUE : Le tableau 3 énumère les caractéristiques des fluorochromes utilisés dans cette étude.
| Type fluorochome | Longueur d’onde (nm) | Colorant | |
| L’excitation | Émission | ||
| Dapi | 405 | 460 – 480 | Bleu |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Vert |
| DyLight 650 Annonces | 654 | 660 – 680 | Rouge |
Tableau 3 : Caractéristiques des fluorochromes.
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Representative Results
Caractéristiques macroscopiques des colons chez les souris atteintes de la maladie de Crohn induite par TNBS
Des images représentatives des colons prélevés sur le contrôle et des souris traitées par TNBS sont montrées dans la figure 2. Chez les souris avec un modèle TNBS-induit de la maladie de Crohn, la longueur du côlon est réduite tandis que la largeur du côlon est augmentée.
Figure 2 : Le côlon représentatif obtenu des souris témoins (contrôle) et des souris TNBS-traitées (TNBS). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les paramètres macroscopiques évalués sont donnés dans le tableau 1. L’administration de TNBS aux souris entraîne une augmentation du score macroscopique colonial total(figure 3A) et de la longueur de l’inflammation(figure 3B) par rapport aux souris témoins.
Figure 3 : Score macroscopique total du côlon (A) et de la longueur totale de l’inflammation du côlon (B) chez les souris témoins (contrôle) et les souris traitées par TNBS (TNBS). Dix souris par groupe. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un ANOVA à sens unique suivi du test post-hoc de Newman-Keuls. Les données sont présentées comme des moyens et des SEM; Pp 'lt; 0.001 TNBS vs contrôle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Validation des anticorps récepteurs d’oestrogène
La validation de la spécificité des anticorps récepteurs d’oestrogène utilisés dans l’étude a été effectuée à l’aide de cellules MCF-7. Les cellules MCF-7 ont été choisies sur la base d’études antérieures dans lesquelles plusieurs chercheurs indépendants ont constaté que les récepteurs d’oestrogène sont présents aux niveaux d’ARNm et de protéine. Comme le montre la figure 4, les anticorps utilisés dans l’étude permettent la détection des deux récepteurs d’oestrogène nucléaire, c’est-à-dire ERMD(figure 4A) et ERMD(figure 4B), ainsi que du récepteur d’oestrogène lié à la membrane, c’est-à-dire GPER(figure 4C) dans les cellules MCF-7. Les récepteurs d’oestrogène nucléaire sont localisés dans le cytoplasme et les noyaux, et le signal de la coloration de GPER est seulement présent dans le cytoplasme des cellules mcF-7.
Figure 4 : Images représentatives de la coloration d’immunofluorescence d’ERMD (A), D.ERÔ (B) et GPER (C) dans les cellules MCF-7. Description détaillée en haut des images. Barres d’échelle: 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
En plus du contrôle positif, un contrôle négatif a également été effectué, dans lequel seul l’anticorps secondaire a été utilisé. La figure 5 montre une image des cellules MCF-7 tachées uniquement avec des anticorps secondaires conjugués avec du fluorochrome et du liquide à base de glycérol avec DAPI.
Figure 5 : Image représentative de la coloration d’immunofluorescence de DyLight 650 dans les cellules MCF-7. Une description supplémentaire est disponible au-dessus de l’image. Barres d’échelle: 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Localisation des récepteurs d’oestrogène dans le modèle murin induit par TNBS de la maladie de Crohn
Un signal cytoplasmique fort d’ERMD a été trouvé dans la section du côlon obtenue des souris et des souris témoins avec la maladie de Crohn induite par TNBS(figure 6A). Cependant, il semble que seulement dans l’intestin obtenu des souris témoins avait ERmd localisé dans le cytoplasme de cellules de gobelet. La microscopie confocale a également révélé la localisation cytoplasmique d’ERMD dans la section du côlon des souris témoins et TNBS -traitées(figure 6B). De même, la localisation cytoplasmique du GPER a été documentée dans la section du côlon obtenue à partir de souris témoins et de souris traitées par TNBS(figure 6C).
Figure 6 : Images représentatives de la coloration de l’immunofluorescence d’ERMD (A), d’ERMD (B) et de GPER (C) dans la section du côlon obtenues à partir de souris témoins (contrôle) et de souris traitées par TNBS (TNBS). Une description supplémentaire est disponible au-dessus de chaque image. Barres d’échelle: 50 m; barres d’échelle de zoom: 25 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il existe de nombreux modèles animaux pour l’examen de pathophysiologie des MII, y compris les modèles génétiques, immunologiques ou spontanés, ainsi que les modèles chimiquement induits15. Parmi les plusieurs types de modèles animaux de colite, les modèles induits chimiquement tels que le modèle induit par TNBS décrit dans ce protocole, sont relativement peu coûteux et faciles à obtenir. Le modèle murine TNBS-induit de la colite a plusieurs symptômes cliniques liés à la base pathologique de CD. Les animaux atteints de colite induite sont caractérisés par une formation incohérente de selles, une diarrhée sanglante et une perte de poids corporel. Cependant, cela ne signifie pas que ce modèle peut être utilisé pour étudier l’étigénogenèse CD exclusivement. Le modèle induit par le TNBS est recommandé et couramment utilisé, par exemple, pour un dépistage thérapeutique potentiel. Dans le cas de la colite chimiquement induite, certains points critiques doivent être mis en évidence. Le TNBS doit être dilué dans l’éthanol, ce qui perturbe la barrière muqueuse et permet à TNBS de pénétrer à travers la paroi intestinale et d’interagir avec des protéines de poids moléculaire élevé, conduisant à une réponse immunitaire médiation cellulaire2,16,17. La dose de TNBS et la concentration d’éthanol doivent être optimisées pour la souche et le poids de la souris. Une dose de TNBS trop élevée et une concentration d’éthanol peuvent causer une mortalité excessive, ce qui empêche une analyse plus approfondie. D’autre part, une dose trop faible de TNBS et la concentration d’éthanol peuvent causer une mauvaise réponse et prolonger inutilement l’expérience.
L’intestin obtenu des souris avec la colite induite par TNBS peut être examiné non seulement au niveau macroscopique, tel que décrit dans ce protocole, mais peut également être employé pour l’analyse biochimique et moléculaire. Une approche utile pour étudier à la fois l’expression et la localisation est une technique immunohistochimique avec l’utilisation de l’immunofluorescence. Cependant, certaines étapes critiques doivent être incluses dans la préparation et la mise en œuvre de l’IHC pour les sections de colons murines formalines-fixées. La première étape charnière, c’est-à-dire la préparation du côlon détermine la qualité des résultats. Le temps de fixation, qui dépend de l’épaisseur du tissu doit être optimisé. Une autre étape cruciale est la déshydratation, qui devrait être effectuée doucement par de multiples incubations dans l’augmentation des concentrations d’éthanol. Enfin, le positionnement correct du côlon dans le moule est essentiel pour générer les sections transversales correctes. La préparation des tissus n’est pas la seule question importante dans l’immunohistochimie. Bien que la récupération d’antigène soit une étape facultative, dans les sections formellement fixées de paraffine, elle semble nécessaire. Pendant la fixation avec le formaldéhyde, des ponts de méthylène entre les protéines sont générés et des masques de liaison croisée de protéines sont des sites antigènes18. Il existe deux méthodes principales, basées sur la récupération d’antigène induite par la chaleur ou l’enzymatique (trypsine, pepsine ou proteinase K). La récupération d’antigène induite par la chaleur, effectuée dans le tampon de citrate de sodium, le tampon d’acide éthylènediaminettraacetic (EDTA) ou le tampon Tris-EDTA, est plus largement utilisée parce qu’elle n’affecte pas la morphologie cellulaire. Le type d’absorption d’antigène et les conditions doivent être ajustées expérimentalement. Il convient de noter que parfois la méthode de récupération d’antigène est déterminée par l’anticorps utilisé dans les expériences. La perméabilisation est une condition dépendante de l’antigène examiné, et est exigée particulièrement pour des protéines intracellulaires. Il existe plusieurs approches qui utilisent des solvants (acétone ou méthanol) et des détergents durs (Triton X-100 ou NP-40) ainsi que des détergents doux (Tween 20 ou saponin). Dans le protocole actuel, deux détergents ont été utilisés simultanément, c’est-à-dire Triton X-100 et Tween 20 selon l’étape. Il convient de souligner que la perméabilisation doit être optimisée en fonction de l’anticorps utilisé. Le blocage des sites de liaison non spécifiques est particulièrement important pendant l’analyse immunohistochimique. Les solutions de blocage comprennent le sérum normal, l’albumine de sérum bovine ou même des solutions de blocage prêtes à l’emploi. Le protocole actuel recommande l’utilisation de sérum normal et d’albumine de sérum bovin. Comme déjà mentionné dans le protocole, la solution de blocage devrait contenir le sérum normal de la même espèce que l’anticorps secondaire.
Enfin, la détection de l’IHC par immunofluorescence telle que décrite dans ce protocole peut être étendue à la coloration d’autres protéines dans des études d’interaction protéine-protéine. Lorsque vous cherchez la colocalisation de protéines sélectionnées, certaines conditions doivent être remplies. Les fluorochromes doivent être sélectionnés en fonction des spectres d’excitation et d’émission. Cette étape est cruciale pour éliminer les chevauchements spectrals et doit être accomplie au stade de planification de l’expérience. Dans ce protocole, trois fluorochromes, c’est-à-dire les anticorps secondaires DyLight 650, DAPI et DiOC6(3) sont utilisés. Comme le montre le tableau 3, DyLight 650 utilisé pour la détection des récepteurs d’oestrogène est observé comme colorant rouge avec 654 nm excitation et émission à 660-680 nm. Pour tacher les noyaux cellulaires et la membrane interne, DyLight 650 est utilisé avec le marqueur nucléaire DAPI et le marqueur de membrane DiOC6 (3). DAPI est observé comme un colorant bleu avec 405 nm excitation et l’émission à 460-480 nm. À son tour, DiOC6(3) est observé comme un colorant vert avec 485 nm excitation et l’émission à 538-595 nm. La coloration de la protéine suivante doit être effectuée après l’étape 4.14., commençant par l’étape de blocage (voir étape 4.9.). Pour deux protéines, il est recommandé d’utiliser des anticorps de coloration de différentes espèces. Cette approche permet d’exclure la liaison de l’anticorps secondaire conjugué à la teinture à la protéine précédemment tachée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les travaux ont été publiés grâce au soutien financier des autorités de l’Université de Lodz : vice-recteur à la recherche scientifique, vice-recteur à la coopération nationale et internationale et doyen de la Faculté de biologie et de protection de l’environnement. Damian Jacenik a été soutenu par des subventions (2017/24/T/NZ5/00045 et 2015/17/N/NZ5/00336) du Centre national des sciences, en Pologne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
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