Summary
이 프로토콜은 파라핀에 내장된 포르말린 고정 결장 섹션의 면역형광을 이용한 면역성 화학에 의한 에스트로겐 수용체의 시각화 방법 및 크론병의 완전한 검증된 TNBS 유도 뮤린 모델을 제시한다.
Abstract
크론병은 가장 진단된 염증성 장 질환입니다. 장에서 발전하는 만성 염증은 연동 무질서 및 장 점막의 손상으로 이끌어 내고 결장 신생물 변환의 증가한 리스크와 연관되는 것처럼 보입니다. 축적 된 증거는 에스트로겐과 에스트로겐 수용체가 호르몬에 민감한 조직뿐만 아니라 폐 또는 결장과 같은 에스트로겐과 직접 관련이없는 다른 조직에도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 여기서, 우리는 TNBS 유도 크론병의 뮤린 모델로부터 수득된 결장에서 에스트로겐 수용체의 성공적인 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 기술한다. 마우스와 장 제제에서 크론 병의 유도에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 포르말린 고정 파라핀 내장 장 절편을 사용하여 단계별 면역 히스토미칼 절차가 제공됩니다. 기술된 방법은 생체 내에서 에스트로겐 수용체 검출 및 에스트로겐 신호 조사뿐만 아니라 대장염의 발달에 관여할 수 있는 다른 단백질에도 적용될 수 있다.
Introduction
크론병(CD)은 만성 장염증으로 나타나는 염증성 장질환(IBD)입니다. CD의 병인은 제대로 이해되지 않지만, 장내 미생물, 식이 또는 스트레스와 같은 유전적 및 환경적 요인을 포함하여 CD 발달을 담당하는 것으로 보이는 몇 가지 주요 요인이있다 1. 크론 병의 병인을 더 잘 이해하기 위해,장 염증의 여러 모델이2,3,43,5,56,7을사용했습니다. 본 문서에서, 우리는 CD의 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉산(TNBS)-유도 된 뮤린 모델으로부터 얻은 결과를 제시한다.
에스트로겐은 만성 장 염증8,,9,10,,11,,12를변조 할 수 있다는 것이 문서화되었습니다.9 에스트로겐의 생물학적 활성은 핵 에스트로겐 수용체(ER), 즉 ERα(유전자 ESR1)및 ERβ(유전자 ESR2),G 단백질 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(유전자 GPER1)로지칭되는 핵 에스트로겐 수용체(ER)에 의해 매개된다.13,14 에스트로겐 수용체의 수준을 결정하는 몇 가지 방법이 있습니다, 하지만 몇 가지만 장에서 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
면역 조직화학(IHC)은 불소-컨쥬게이트 항체를 가진 세포 또는 조직에서 특정 항원검출을 위한 임상 및 기초 연구에서 널리 사용되는 방법이다. IHC는 대장염의 발달을 이해하는 것이 중요할 지도 모르다 특정 단백질의 식별 그리고 현지화에서 조직 구조 시각화에 있는 중요한 방법 일 것 같습니다. 여기에서, 우리는 면역형광을 사용하여 창자에 있는 에스트로겐 수용체의 면역성 화학적 시각화를 위한 완전하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
동물 연구는 유럽 의회 및 2010년 9월 22일 이사회의 지침 2010/63/EU 및 제도적 권고에 따라 지역 윤리위원회(28/ŁB29/2016)의 동의하에 수행되었습니다.
1. 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델
참고 : 이 프로토콜은 25-28 g의 수컷 BALB / C 마우스를 사용합니다. 동물은 일정한 온도 (22-24 ° C)에 보관되고, 상대 습도 55 ± 5 %, 표준 차우 펠릿 및 수돗물 ad libitum에무료로 액세스 할 수있는 12 시간 빛 / 어두운 주기에서 유지됩니다.
- 마우스를 유도 챔버에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 이소플루란(25%2 O2+1.5-2L/min)으로 마우스를 짧게 마취시다.2
참고: 호흡률은 정상보다 리드미컬하고 느리게 유지되어야 하며 유해한 자극에 반응하여 변하지 않아야 합니다. - 0.9% NaCl에서 0.9% NaCl에서 30% 에탄올의 0.1 mL에 TNBS의 4 mg을 주입하거나 0.9% NaCl에서 0.1% 에탄올의 0.1 mL을 카테터를 통해 말단 결장으로 의한 비히클 제어로.
참고 : 카테터는 항문으로 약 3cm 조심스럽게 도입해야합니다. - 체중, 직장 출혈, 대변 일관성 및 사망률을 포함한 임상 매개 변수에 대해 2일째부터 8일까지 매일 마우스를 모니터링합니다.
- 8 일째에 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시하십시오.
그림 1: 크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델에 대한 타임라인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 결장의 분리 및 거시적 평가
참고: 결장 분리 하루 전에 인산완충염수(PBS) 1mL에 100 μL의 항생제를 희석하고 밤새 4°C에서 둡니다.
- 75% 에탄올과 멸균 거즈를 사용하여 복부에 피부를 청소하십시오.
- 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 가슴뼈에서 항문으로 복벽을 자른다.
- 항문과 장모에 가능한 한 가까운 결장절단.
- 페트리 접시에 결장합니다. 항문에서 대장을 장막 끝으로 잘라냅니다. 감기 항생제-PBS 용액으로 결장 2-4회 세척합니다.
- 표 1에따라 캘리퍼스를 사용하여 거시적 평가를 수행합니다.
참고 : 조직 부착* 및 홍반 / 출혈#,대변 혈액# 및 설사# 시각적 평가의 대상이됩니다. * 조직 접착은 3 점 척도를 사용하여 평가 (0 : 조직 접착이없는 결장, 1 : 적당한 조직 접착이있는 결장, 2 : 광범위한 조직 접착이있는 결장); #부재 (0) 또는 존재 (1) 홍반 / 출혈, 대변 혈액과 설사에 따라.
| 접착* | 홍반/ 출혈# | 대변 혈액# | 설사# | 궤양의 길이 | 결장 두께 | 결장 길이 |
| 포인트 (0 – 2) | 포인트 (0 – 1) | 포인트 (0 – 1) | 포인트 (0 – 1) | cm/포인트 | mm/포인트 | cm/포인트 |
| 0 – 결석 | 0 – 결석 | 0 – 결석 | 0 – 결석 | 0.5 cm = 0.5 포인트 | n mm = n 포인트 | 0 – <10% 컨트롤보다 짧아 |
| 1 – 보통 | 1 – 현재 | 1 – 현재 | 0.5 – 약간/느슨한 대변 | 1 – 컨트롤보다 10~20% 더 짧습니다. | ||
| 2 – 현재 | 1 – 현재 | 2 – 컨트롤보다 20% 이상 짧습니다. |
표 1: 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스의 장의 거시적 스코어링.
- 센티미터의 궤양의 길이를 점 척도, 즉 궤양의 0.5 cm마다 0.5 포인트로 계산됩니다. 대장의 두께를 밀리미터 단위로 점 눈금으로 변환합니다( 즉, 모든 nmm은 n포인트에 해당합니다).
- 콜론의 길이를 3점 척도로 센티미터단위로 변환합니다. TNBS-유도 된 크론 병을 가진 각 마우스로부터 얻은 결장의 길이는 대조군에 대한 평균 결장 길이와 관련하여 평가된다(0: lt;10% 대조군보다 짧음, 1: 대조군보다 10~20% 더 짧음, 2: 20% 이상 짧아 제어)를 참조하십시오.
- 방정식에 따라 총 거시 점수 계산: 총 거시 점수 = 접착력 (점) + 홍반/출혈 (점) + 대변 혈중 (점) + 설사 (점) + 궤양의 길이 (포인트) + 결장 두께 (포인트) + 결장 길이 (점).
3. 결장 샘플 준비
- 결장 1-2cm 조각으로 잘라 적절하게 표지 조직 학적 카세트에 스폰지에 각각을 배치합니다.
참고: 조직학적 카세트용 스폰지는 액체 파라핀의 탈수 및 배양 중에 결장 접이식을 방지합니다. - 결장 단편을 포름알데히드 4% 에 놓고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.
- 조직 프로세서를 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 에탄올, 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v) 및 자일렌만, 액체 파라핀에서 3시간 이상 인큐베이션할 때 1시간 동안 준비및 프로그래밍한다.
참고 : 탈수는 에탄올과 자일렌의 농도가 증가함에 따라 수행되어야하지만 에탄올의 농도는 수정 될 수 있습니다. 자일렌/에탄올 혼합물은 권장되지만 필수는 아닙니다. - 결장 단편을 조직학적 상자로 옮기고 미리 프로그래밍된 조직 프로세서에 놓습니다.
- 티슈 프로세서를 실행합니다.
- 배양 단계 후, 결장의 두 끝이 똑바로 놓이게 하고 금형의 3분의 1을 액체 파라핀으로 채우게 되도록 결장 단편을 금속 몰드에 넣습니다.
- 금형을 냉각 영역(-5°C)에 몇 초 동안 둔다음 금형을 온난화 영역(70°C)으로 옮니다. 조직학 상자의 하단 부분에 놓고 전체 결장 조각을 액체 파라핀으로 덮습니다.
- 냉각 영역에서 몇 분 동안 파라핀에 결장 조각과 금속 금형을 둡니다. 파라핀 블록에서 금속 몰드를 제거하고 4°C에서 적어도 24시간 동안 배양한다.
- 블록에서 여분의 파라핀을 제거하고 완전히 자동화 된 회전 마이크로 토메에 삽입합니다.
참고: 파라핀 블록은 이 단계 전에 -20°C에서 몇 분 동안 보관될 수 있다. - 결장 조각을 5 μm 섹션으로 자른다.
- 결장 부분을 40°C로 예열된 수조로 옮김을 옮김.
- 라벨이 부착된 유리 슬라이드를 사용하여 수조에서 결장 부분을 제거합니다.
참고: 결장 섹션은 물에 떠 있습니다. 라벨이 붙은 유리 슬라이드를 결장 섹션 아래에 있는 물에 넣고 유리 슬라이드를 조심스럽게 철회합니다. - 실온에서 24 시간 동안 유리 슬라이드를 둡니다. 장기간 보관을 위해 실온에서 24시간 배양한 후 유리 슬라이드를 4°C로 유지하십시오.
4. 면역형광 염색을 가진 면역성화학
참고: 수술 중 어떤 단계에서도 결장 부분을 건조시키지 마십시오.
- 자일렌에서 유리 슬라이드를 5분 동안 배양하여 파라핀을 제거합니다.
- 유리 슬라이드를 자일렌/100% 에탄올(1:1; v/v)에 5분 동안 놓습니다.
- 결장 부위를 일련의 감소에 따라 수화, 즉 70%, 50%, 30% 및 10% 에탄올을 5분 동안 반복한다.
- 흐르는 물에 유리 슬라이드를 5 분 동안 헹구십시오.
- 예열 항원 회수 완충제(구연산 나트륨 10mM; 0.05% 트웬20, pH 6.0)를 95-98°C로 가열하고 10분 동안 끓는 항원 회수 용액으로 유리 슬라이드를 가열한다.
참고: 항원 검색 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 마스킹 해제 용액은 실험에 사용된 항체에 따라 최적화되어야 한다. - 소수성 펜을 사용하여 콜론 섹션 주위에 원을 그립니다.
참고: 이 단계는 선택 사항이지만 권장됩니다. 소수성 펜은 액체를 원 내부에 작은 부피로 풀링하여 시약 낭비를 방지합니다. - 10 분 동안 수소 과산화효소의 3 % 물 용액으로 섹션을 배양하십시오.
- 세척 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬 20)에서 5 분 동안 세척하십시오.
- 차단 용액에서 배양 (5 % 일반 염소 혈청, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05 % 트리톤 X-100) 실온에서 1 시간 동안.
참고 : 차단 용액에서 정상적인 혈청은 이차 항체와 동일한 종에서 온 것이어야합니다. 배양이 필요한 단계에서 는 과도한 증발을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 습도 챔버에 놓습니다. - 차단 용액을 제거하고 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100으로 1% 소 혈청 알부민으로 희석된 ERα, ERβ 또는 GPER에 대해 20-50 μL의 1차 항체를 첨가한다.
참고: 1차 항체의 권장 희석은 표 2에나와 있다.
| 항체 유형 | 반대 항체 | 복제 | 호스트 종 | 종 반응성 | 희석 |
| 기본 | ERα | Polyclonal | 토끼 | 인간의 | 1:100 |
| 마우스 | |||||
| 거북이 | |||||
| 카피바라 주 | |||||
| ERβ | Polyclonal | 토끼 | 인간의 | ||
| 원숭이 | |||||
| 쥐 | |||||
| 마우스 | |||||
| 양 | |||||
| 돼지 | |||||
| GPER | Polyclonal | 토끼 | 인간의 | ||
| 쥐 | |||||
| 마우스 | |||||
| 보조 | 다이라이트 650 | Polyclonal | 염소 | 토끼 | 1:250 |
표 2: 항체의 특성.
- 어둠 속에서 4 °C에서 하룻밤 1 차 항체와 배양.
- 항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척한다.
- 1% 소 혈청 알부민에 희석된 DyLight 650 이차 항체 20-50 μL을 첨가합니다(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트리톤 X-100 함유). 이차 항체와 배양염료와 결합 1 시간 어둠 속에서 실온에서.
참고: 이차 항체의 권장 희석은 표 2에나타내고 있다. - 항체 용액을 제거하고 세척 액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl에서 희석 한 2 % DiOC6 (3)을 넣고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 용액을 제거하고 세척액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬20)을 5분 동안 세척합니다.
- 콜론 섹션에 DAPI가 있는 글리세롤 기반 액체 몇 방울을 넣고 커버 슬라이드로 조심스럽게 덮습니다. 4 °C에서 적어도 24 시간 동안 결장 섹션을 배양합니다.
참고: 커버 슬라이드로 티슈를 덮을 때기포를 피하십시오. - 전용 소프트웨어를 사용하여 20배 또는 63배 의 목표와 오일 침수를 특징으로 하는 공초점 현미경으로 결장 섹션을 분석합니다.
참고: 표 3은 이 연구에 사용된 불소의 특성을 나열합니다.
| 플루오로홈 타입 | 파장 (nm) | 염료 | |
| 흥분 | 방출 | ||
| DAPI | 405 | 460 – 480 | 블루 |
| 디OC6 (3) | 485 | 538 – 595 | 녹색 |
| 다이라이트 650 | 654 | 660 – 680 | 빨간색 |
표 3: 불소의 특성.
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Representative Results
TNBS 유도 된 크론 병을 가진 마우스에 있는 결장의 거시적 특성
대조군 및 TNBS 처리 마우스로부터 채취한 결장의 대표적인 이미지는 도 2에나타내고 있다. 크론병의 TNBS 유도 모델을 가진 마우스에서, 결장의 길이는 결장의 폭이 증가하는 동안 감소된다.
도 2: 대조군 마우스(대조군) 및 TNBS 처리 마우스(TNBS)로부터 수득된 대표적인 결장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
평가된 거시적 매개 변수는 표 1에제공됩니다. 마우스에 대한 TNBS의 투여는 대조군 마우스에 상대적인 총 대장 거시적점수(도 3A)및 염증 길이(도3B)의증가를 유도한다.
도 3: 대조군 마우스(대조군) 및 TNBS 처리 마우스(TNBS)에서 결장(A) 및 총 대장 염증 길이(B)의 총 거시적 스코어. 그룹당 10마리의 마우스. 통계 분석은 단방향 ANOVA를 사용하여 수행되었고, 그 다음에 뉴먼-쿨스 사후 테스트가 수행되었다. 데이터는 수단으로 제시된다 ±SEM; ***p < 0.001 TNBS 대 제어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에스트로겐 수용체 항체 검증
연구에 사용된 에스트로겐 수용체 항체의 특이성의 유효성검사는 MCF-7 세포를 사용하여 수행하였다. MCF-7 세포는 몇몇 독립적인 연구원이 에스트로겐 수용체가 mRNA 와 단백질 수준에 존재한다는 것을 것을을 발견한 것을 점에서 이전 연구 결과에 근거를 두어 선택되었습니다. 도 4에도시된 바와 같이, 연구에 사용된 항체는 MCF-7 세포에서 핵 에스트로겐 수용체, 즉 ERα(도4A)및 ERβ(도4B)뿐만 아니라 막 결합 에스트로겐 수용체, 즉 GPER(도4C)의검출을 허용한다. 핵 에스트로겐 수용체는 세포질 및 핵에 국한되고, GPER 염색에서 신호는 MCF-7 세포의 세포질에서만 존재한다.
도 4: MCF-7 세포에서 ERα(A), ERβ(B) 및 GPER(C)의 면역형광 염색의 대표적인 이미지. 이미지 맨 위에 있는 자세한 설명입니다. 배율 표시줄: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
양성 대조군 이외에, 음성 대조군도 수행되었고, 이차 항체만 사용되었다. 도 5는 DAPI를 가진 불소및 글리세롤계 액체와 공액으로 결합된 이차 항체로만 염색된 MCF-7 세포의 이미지를 나타낸다.
도 5: MCF-7 세포에서 DyLight 650의 면역형광 염색의 대표적인 이미지. 이미지 위에 추가 설명을 사용할 수 있습니다. 배율 표시줄: 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
크론병의 TNBS 유도 뮤린 모델에서 에스트로겐 수용체 국소화
ERα의 강한 세포질 신호는 TNBS-유도 크론병을 가진 대조군 마우스 및 마우스로부터 수득된 결장 부에서발견되었다(도 6A). 그러나, 대조군 마우스로부터 수득된 장에서만 잔 세포 세포질에 ERα가 국소화된 것으로 나타났다. 공초점 현미경 검사법은 또한 대조군 및 TNBS 처리마우스둘 다의 결장 단면도에서 ERβ의 세포질 국소화를밝혔다(도 6B). 유사하게, GPER의 세포질 국소화는 대조군 마우스 및 TNBS 처리 마우스로부터 수득된 결장 절편에서 문서화되었다(도6C).
도 6: 대조군 마우스(대조군) 및 TNBS 처리 마우스(TNBS)로부터 수득된 결장 섹션에서 ERα(A), ERβ(B) 및 GPER(C)의 면역형광 염색의 대표적인 이미지. 각 이미지 위에 추가 설명을 사용할 수 있습니다. 스케일 바: 50 μm; 확대/축소 늘이줄: 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
IBD 병리생리학 검사를 위한 수많은 동물 모델들이 있는데, 여기에는 유전적, 면역학적 또는 자발적인 모델뿐만 아니라 화학적으로 유도된모델(15)을포함한다. 대장염의 여러 동물 모델 중에서, 이 프로토콜에 기재된 TNBS 유도 모델과 같은 화학적으로 유도된 모델은 비교적 저렴하고 쉽게 얻을 수 있다. 대장염의 TNBS 유도 뮤린 모델은 CD의 병리학적 기초와 관련된 몇 가지 임상 증상을 갖는다. 유도된 대장염을 가진 동물은 일관되지 않은 발판 대형, 피 묻은 설사 및 체중의 손실을 특징으로 합니다. 그러나, 이것은 이 모형이 CD 병인증을 독점적으로 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 의미하지 않습니다. TNBS 유도된 모형은 잠재적인 치료 검열을 위해, 예를 들면, 추천되고 일반적으로 이용됩니다. 화학적으로 유도된 대장염의 경우에 몇몇 중요한 점은 강조될 필요가 있습니다. TNBS는 점막 장벽을 방해하고 TNBS가 장 벽을 관통하고 고분자량 단백질과 상호 작용하도록 허용하는 에탄올에서 희석되어야 하며, 이는 세포2매개 면역 반응2,16,,17로이어집니다. TNBS 투여량과 에탄올 농도는 마우스 변형 및 무게에 대해 최적화되어야 한다. TNBS 용량과 에탄올 농도가 너무 높으면 과도한 사망률이 발생할 수 있으며, 이는 추가 분석을 방지합니다. 한편, TNBS 투여량과 에탄올 농도가 너무 낮으면 반응이 좋지 않아 불필요하게 실험이 연장될 수 있다.
TNBS 유도 대장염을 가진 마우스에게서 얻은 장은 이 프로토콜에 기술된 바와 같이 거시적 수준에서뿐만 아니라 검사될 수 있고, 또한 생화확적인 및 분자 분석을 위해 사용될 수 있습니다. 발현과 국소화를 모두 연구하기위한 유용한 한 가지 접근법은 면역 형광을 사용하는 면역 화학 기술입니다. 그러나, 몇몇 중요한 단계는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 murine 결장 단면도를 위한 IHC의 준비 그리고 구현에 포함되어야 합니다. 첫 번째 중추적 인 단계, 즉 결장의 준비는 결과의 품질을 결정합니다. 조직 두께에 의존하는 고정 시간은 최적화되어야 한다. 또 다른 중요한 단계는 탈수함으로, 에탄올 농도가 증가하는 여러 배양으로 부드럽게 수행해야합니다. 마지막으로, 올바른 단면을 생성하기 위해서는 금형에서 결장의 올바른 위치 가 필수적입니다. 조직 준비는 면역 조직 화학에서 유일한 중요한 문제가 아닙니다. 항원 회수는 선택적 단계이지만, 포르말린 고정 파라핀 내장 섹션에서는 필요한 것으로 보인다. 포름알데히드와 고정하는 동안, 단백질 사이의 메틸렌 브리지가 생성되고 단백질 가교 마스크 항원 부위18. 열-또는 효소 유도(트립신, 펩신 또는 단백질효소 K) 항원 회수에 기초한 두 가지 주요 방법이 있다. 열-유도 항원 회수는 구연산 나트륨 완충제, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 버퍼 또는 트리스-EDTA 완충제에서 수행되며, 세포 형태에 영향을 미치지 않기 때문에 더 널리 사용된다. 항원 섭취량의 종류와 조건은 실험적으로 조정되어야 합니다. 때때로 항원 회수 방법은 실험에 사용되는 항체에 의해 결정된다는 점에 유의해야 한다. 투과는 검사된 항원에 의존하는 상태이며, 특히 세포내 단백질에 필요합니다. 용매 (아세톤 또는 메탄올) 및 가혹한 (트리톤 X-100 또는 NP-40)뿐만 아니라 온화한 (트웬 20 또는 사포닌) 세제를 사용하는 몇 가지 방법이 있습니다. 본 프로토콜에서 2개의 세제는, 즉, 트리톤 X-100 및 트웬 20 단계에 따라 동시에 사용되었다. 사용되는 항체에 따라 투과가 최적화되어야 한다는 점을 강조해야 한다. 비특이적 결합 부위의 차단은 면역성 화학적 분석 중에 특히 중요하다. 차단 솔루션에는 일반 혈청, 소 세럼 알부민 또는 즉시 사용 이용 차단 솔루션이 포함됩니다. 본 프로토콜은 정상 혈청 및 소 혈청 알부민의 사용을 권장합니다. 프로토콜에서 이미 언급했듯이, 차단 용액은 이차 항체와 동일한 종으로부터의 정상 혈청을 함유해야 한다.
마지막으로, 본 프로토콜에 기재된 바와 같이 면역형광에 의한 IHC 검출은 단백질-단백질 상호작용 연구에서 다른 단백질을 염색하기 위해 확장될 수 있다. 선택한 단백질의 동국화를 모색 할 때 특정 조건이 충족되어야합니다. 불소화는 여기 및 방출 스펙트럼에 따라 선택되어야 합니다. 이 단계는 스펙트럼 중복을 제거하는 데 중요하며 실험의 계획 단계에서 수행해야 합니다. 본 프로토콜에서 3개의 플루오로크롬, 즉, DyLight 650 이차 항체, DAPI 및 DiOC6(3)가 사용된다. 표 3에나타낸 바와 같이, 에스트로겐 수용체 검출에 사용되는 DyLight 650은 660-680 nm에서 654 nm 의 여기 및 방출을 가진 적색 염료로서 관찰된다. 세포 핵 및 내부 막을 염색하기 위해, DyLight 650은 DAPI 핵 마커 및 DiOC6(3) 멤브레인 마커와 함께 사용된다. DAPI는 460-480 nm에서 405 nm 여기 및 방출을 가진 청색 염료로서 관찰된다. 차례로, DiOC6(3)는 538-595 nm에서 485 nm 여기 및 방출을 가진 녹색 염료로 관찰된다. 다음 단백질의 염색은 차단 단계부터 시작하여 4.14단계 후에 수행되어야 한다(단계 4.9 참조). 두 단백질의 경우 다른 종의 염색 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 접근법은 이전에 염색된 단백질에 대한 염료 컨쥬게이트 이차 항체의 결합을 배제할 수 있게 한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
작품은 로츠 당국의 재정 지원 덕분에 출판되었다: 과학 연구를위한 부총장, 국가 및 국제 협력을위한 부총장과 생물학 및 환경 보호 학부의 학장. 다미안 제이스닉은 폴란드 국립과학센터의 보조금(2017/24/T/NZ5/00045 및 2015/17/Nz5/00336)을 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
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