Summary

Visualizzazione dei recettori degli estrogeni nei coloni dei topi con la malattia di Crohn indotta da TNBS utilizzando l'immunofluorescenza

Published: March 12, 2020
doi:

Summary

Il protocollo presenta un modello murino completo convalidato dalla TNBS della malattia di Crohn e metodi per la visualizzazione dei recettori estrogeni mediante immunosofochimica utilizzando l’immunofluorescenza delle sezioni del colon fissato in formalina incorporate nella paraffina.

Abstract

La malattia di Crohn è il tipo più diagnosticato di malattia infiammatoria intestinale. L’infiammazione cronica in via di sviluppo nell’intestino porta al disturbo della peristalsi e al danno della mucosa intestinale e sembra essere associato ad un aumento del rischio di trasformazione neoplastica del colon. Sempre più prove indicano che gli estrogeni e i recettori degli estrogeni influenzano non solo i tessuti ormone-sensibili, ma anche altri tessuti non direttamente correlati agli estrogeni, come i polmoni o il colon. Qui, descriviamo il protocollo per la colorazione dell’immunofluorescenza di successo dei recettori degli estrogeni nel colon ottenuti da un modello murino della malattia di Crohn indotta da TNBS. Viene fornito un protocollo dettagliato per l’induzione della malattia di Crohn nella preparazione di topi e intestini, nonché una procedura immunohistochimica passo-passo utilizzando sezioni intestinali incorporate con paraffina fissata a formalina. I metodi descritti non sono solo utili per il rilevamento del recettore degli estrogeni e l’indagine di segnalazione degli estrogeni in vivo, ma possono anche essere applicati per altre proteine che possono essere coinvolte nello sviluppo della colite.

Introduction

La malattia di Crohn (CD) è una malattia infiammatoria intestinale (IBD) manifestata come infiammazione cronica intestinale. L’eziologia del CD è poco compresa, ma ci sono alcuni fattori principali che sembrano essere responsabili dello sviluppo del CD, tra cui il microbiota intestinale, e fattori genetici e ambientali, come la dieta o lo stress1. Per una migliore comprensione della patogenesi della malattia di Crohn, sono stati utilizzati diversi modelli di infiammazione intestinale2,3,4,5,6,7.7 In questo articolo, presentiamo risultati ottenuti da un modello di murino indotto da 2,4,6 trinitrobenzene (TNBS) di CD.

È stato documentato che gli estrogeni sono in grado di modulare l’infiammazione intestinale cronica8,9,10,11,12. L’attività biologica degli estrogeni è mediata dai recettori cognati, tra cui i recettori degli estrogeni nucleari (ER), cioè l’ER (gene ESR1)e l’ER (gene ESR2),così come il recettore degli estrogeni accoppiato alle proteine G, vale a dire GPER (gene GPER1), indicato come ER13,14. Ci sono diversi metodi per determinare il livello di recettori degli estrogeni, ma solo pochi possono essere utilizzati per visualizzarli nell’intestino.

L’immunohistochimica (IHC) è un metodo ampiamente utilizzato negli studi clinici e di base per la rilevazione di alcuni antigeni nelle cellule o nei tessuti con anticorpi coniugati fluorocro. IHC sembra essere un metodo importante nella visualizzazione della struttura tissutale, così come nell’identificazione e localizzazione di proteine specifiche, che può essere cruciale per comprendere lo sviluppo della colite. Qui, presentiamo un protocollo completo e convalidato per la visualizzazione immunohistochimica dei recettori degli estrogeni nell’intestino utilizzando l’immunofluorescenza.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati condotti con il consenso del Comitato Etico Locale (28/EB29/2016) in conformità con la direttiva 2010/63/EU del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 e raccomandazioni istituzionali. 1. Modello murino indotto dalla TNBS della malattia di Crohn NOTA: Questo protocollo utilizza topi maschi BALB/C di peso di 25-28 g. Gli animali sono alloggiati a una temperatura costante (22-24 gradi centigradi) e, relativa umidità …

Representative Results

Caratteristiche macroscopiche dei colon nei topi con la malattia di Crohn indotta da TNBSLe immagini rappresentative dei due punti presi dal controllo e dei topi trattati con TNBS sono mostrate nella Figura 2. Nei topi con un modello indotto da TNBS della malattia di Crohn, la lunghezza del colon è ridotta mentre la larghezza del colon è aumentata. <img alt="Figure 2" class="x…

Discussion

Ci sono numerosi modelli animali per l’esame di fisiologia IBD, compresi i modelli genetici, immunologici o spontanei, così come i modelli chimicamente indotti15. Tra i diversi tipi di modelli animali di colite, modelli indotti chimicamente come il modello indotto da TNBS descritti in questo protocollo, sono relativamente economici e facili da ottenere. Il modello murino indotto dalla TNBS della colite ha diversi sintomi clinici legati alla base patologica del CD. Gli animali con colite indotta s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato pubblicato grazie al sostegno finanziario delle autorità dell’Università di Lodz: Vice-Rettore per la Ricerca Scientifica, Vice-Rettore per la Cooperazione Nazionale e Internazionale e Preside della Facoltà di Biologia e Protezione Ambientale. Damian Jacenik è stata sostenuta da sovvenzioni (2017/24/T/N’N’5/00045 e 2015/17/N/N/N’N/00336) del Centro Nazionale di Scienze, Polonia.

Materials

Animals
BALB/C mice University of Lodz NA
Equipment
Caliper VWR 62379-531
Cardboard block NA NA
Confocal microscope – TCS SP8 Leica Biosystems NA
Fully automated rotary microtome – RM2255 Leica Biosystems NA
Glass slide Thermo Scientific J1800BMNT
Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H Leica Biosystems NA
Histological box Marfour LN.138747
Hydrophobic pen Sigma-Aldrich Z377821
Laboratory balance Radwag WL-104-0048
LAS X software Leica Biosystems NA
Metal mold Marfour CP.5105
Sterile gauze NA NA
Sterile scissor NA NA
Sterile tweezer NA NA
Tissue processor – TP1020 Leica Biosystems NA
Reagents
2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid Sigma-Aldrich 92822
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3294
DiOC6 (3) Sigma-Aldrich 318426
DyLight 650 secondary antibody Abcam ab96886
ERα primary antibody Abcam ab75635
ERβ primary antibody Abcam ab3576
Ethanol Avantor Performance Materials Poland 396480111
Formaldehyde Avantor Performance Materials Poland 432173111
GPER primary antibody Abcam ab39742
Hydrochloric acid Avantor Performance Materials Poland 575283421
Hydrogen peroxidase Avantor Performance Materials Poland 885193111
isoflurane (forane) Baxter 1001936040
Normal goat serum Gibco 16210064
Paraffin Leica Biosystems 39602012
Petrie dish Nest Scientific 705001
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P3813
Physiological saline Sigma-Aldrich 7982
Primocin (antibiotic) Invitrogen ant-pm-1
ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) Invitrogen P36971
Sodium chloride Chempur WE/231-598-3
Sodium citrate Avantor Performance Materials Poland 795780429
Tris Avantor Performance Materials Poland 853470115
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Xylene Avantor Performance Materials Poland BA0860119

References

  1. Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
  2. Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  3. Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
  4. Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
  5. Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
  6. Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
  7. Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
  8. Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
  9. Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
  10. Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
  11. Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
  12. Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
  13. Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
  14. Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
  15. Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
  16. Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
  17. Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
  18. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).

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Cite This Article
Jacenik, D., Zielińska, M., Michlewska, S., Fichna, J., Krajewska, W. M. Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn’s Disease using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (157), e60813, doi:10.3791/60813 (2020).

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