Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Homogen glycoconjugate produceret af kombineret unaturlig aminosyre inkorporering og klikkemi til vaccineformål

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

Genetisk kode ekspansion anvendes til indførelse af en unaturlig aminosyre forsynet med en biorthogonal funktionel gruppe på et bæreprotein på et defineret sted. Den biorthogonale funktion anvendes yderligere til den stedselektive kobling af et kulhydratantigen for at give en homogen glykokonjugavaccine.

Abstract

Genetisk kode ekspansion er et kraftfuldt værktøj til at indføre unaturlige aminosyrer (UAAs) i proteiner til at ændre deres egenskaber, til at studere eller skabe nye protein funktioner eller at få adgang til protein konjugater. Stop codon undertrykkelse, især rav codon undertrykkelse, har vist sig som den mest populære metode til genetisk indføre UAAs på definerede positioner. Denne metode anvendes heri til fremstilling af et bærerprotein, der indeholder et ULA, der huser en bioorthogonal funktionel gruppe. Dette reaktive håndtag kan derefter bruges til specifikt og effektivt at pode en syntetisk oligosaccharid hapten at give en homogen glycoconjuga vaccine. Protokollen er begrænset til syntesen af glycoconjugates i en 1:1 kulhydrat hapten / luftfartsselskab protein forhold, men modtagelig for mange par biorthogonal funktionelle grupper. Glycoconjugate vaccine homogenitet er et vigtigt kriterium for at sikre fuldstændig fysisk-kemisk karakterisering, og dermed opfylder flere og mere krævende narkotika regulering agentur anbefalinger, et kriterium, som er uopfyldt af klassiske bøjning strategier. Desuden gør denne protokol det muligt at finjustere strukturen af den faktiske konjugatvaccine, hvilket giver anledning til værktøjer til at løse struktur-immunogenicitet relationer.

Introduction

Glycoconjuga vacciner er væsentlige elementer i vaccinen arsenal til rådighed for profylaktisk behandling af smitsomme sygdomme. De er sikre, veltolererede og effektive i en bred aldersgruppe, herunder små børn. De giver det optimale forsvar mod infektioner forårsaget af kapsulerede bakterier som meningococcus, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b1. Glycoconjuga vacciner er lavet af renset bakterielle polysaccharider, der danner kapsler af bakterier eller syntetiske oligosaccharider, der efterligner disse overflade-udtrykt polysaccharider2, som er kovalent knyttet til et luftfartsselskab protein. Tilstedeværelsen af et bærerprotein er afgørende for at fremme beskyttende humoral immunrespons rettet mod den antigene determinant udtrykt af kulhydratantigener3. Bortset fra en omhyggelig udvælgelse og produktion af kulhydratantigenet er de funktioner, der vides at påvirke effekten af en glycoconjuga-vaccine: luftfartsselskabets proteins art, bøjningskemien (herunder linkerens art og længde, hvis den anvendes), eller saccharid/proteinforhold3. Det er klart, at de positioner, hvor saccharid er konjugeret til proteinet samt antallet af forbindelsespunkter, er relevante for immunogenicitet. Til dato er disse to parametre næppe blevet undersøgt, fordi præparatet af glykokonjugates stadig i vid udstrækning er empirisk. Deres syntese normalt er afhængig af brugen af amin eller carboxylsyre funktioner af henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekæde rester til stede på luftfartsselskabet protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding af glycoconjugates.

Afspilning på reaktivitet, tilgængelighed eller fordeling af aminosyrerester i proteinet giver anledning til mere definerede glycoconjugates, der er mere pålidelige til at dokumentere effekten af saccharid/proteinforbindelse4. Et skridt fremad mod dette mål kan opnås ved at anvende protein glycan kobling teknologi, en rekombinant proces, der gør det muligt at producere kontrollerede glycoconjuga vacciner i celle fabrikker5,6. Glycosylationen finder dog udelukkende sted ved en asparagin rest i D/EXNYS/T sequons (hvor X er en ud af de 20 naturlige aminosyrer), ikke naturligt forekommer på bæreproteinerne.

Selektiv mutagenese på stedet og navnlig inkorporering af cystein for at udnytte deres stærkt og selektive reaktivitet fremstår som et alternativ7,8. Produktion af bæreproteiner, der inkorporerer UAA'er i deres rækkefølge, kan give endnu mere fleksibilitet til homogent glykokonjugatvaccinepræparat. Der er udviklet og inkorporeret mere end 100 AUA'er i forskellige proteiner9,10. Mange af dem indeholder bioorthogonale funktioner, der normalt anvendes til at udføre post translationellemodifikationer 11 eller til at pode biofysiskesonder 12 eller narkotika13, men som er ideelle håndtag til yderligere bøjning med kulhydratantigener. Vellykkede eksempler er blevet hævdet af Biotech14 ved hjælp af celle-fri proteinsyntese15, men forberedelse af glycoconjuga vacciner i henhold til denne strategi stadig venter på at blive populariseret.

Anvendelse af in vivo-strategien for produktion af muteret bæreprotein kræver en modificeret translationel maskine, der omfatter en specifik codon, et tRNA, der anerkender codon og en aminoacyl-tRNA-syntetase (aaRS), som specifikt katalyser overførsel af ULA på tRNA (Figur 1)16. Den pyrrolysin rav stop codon undertrykkelse er en af de mest udbredte metoder til at indarbejde ULA, især propargyl-lysin (PrK)17. Sidstnævnte kan til gengæld reagere med azido-funktionaliserede kulhydrat haptens at give fuldt definerede, homogene glycoconjugates. I det foreliggende manuskript beskriver vi, hvordan vi syntetiserer propargyl-L-lysin, en UAA med et alkynehåndtag, hvordan det indarbejdes i et målprotein under oversættelsen i en bakterie, og endelig hvordan man udfører bøjning mellem det modificerede protein og en hapten, der bærer en azide-funktion ved hjælp af klikkemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese af ULA: propargyl-lysin (PrK)

  1. Syntese afN α-Boc-propargyl-lysin18
    1. 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) opløses i en blanding af vandige 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monteres kolben med et siliciumskvæg.
    2. Kolben afkøles i et isbad, og der tilsættes derefter 158 μL propargylchloroformat (1,62 mmol) dråbevis (over en periode på 2-3 minutter) ved hjælp af en mikrosyring under omrøring.
    3. Reaktionsblandingen opvarmes til stuetemperatur og fortsætte omrøringen i 10 timer.
    4. Nedkøles opløsninger af 50 ml diethylether, 50 ml vandig 1 M saltsyre og 60 ml ethylacetat i et isbad.
    5. Afkøl den rå reaktionsblanding i et isbad og hæld blandingen i en separationstragt. Blandingen udvindes med 50 ml diethylether. Kassér det organiske lag.
    6. Tilsæt forsigtigt vandig 1 M saltsyre til den vandige fase i separationstragten. Derefter udtrækkes det vandige lag to gange ved hjælp af 30 ml ethylacetat. Kontroller tilstedeværelsen af N-Boc-propargyl-lysin i den organiske fase ved hjælp af CH2Cl2-methanol (9:1) som elueringssted.
    7. De kombinerede organiske lag tørres over MgSO4, og filtratet skal filtreres af og koncentreres under reduceret tryk på en roterende fordamper.
    8. En prøve af den rå fedtede Nα-Boc-propargyl-lysin opløses i deutereret chloroform (CDCl3), og dens identitet kontrolleres ved 1H NMR.
      FORSIGTIG: Ekstraktion kan resultere i ophobning af tryk. Slip enhver trykoprustning ofte.
  2. Syntese af den unaturlige aminosyre propargyl-L-lysin (PrK)
    1. Der indføres α-Boc-propargyl-lysin i en rund bundkolbe udstyret med en skillevæg.
    2. Der tilsættes 4 ml vandfri dichlormethan (CH2Cl2) til kolben under argon for at opløse Nα-Boc-propargyl-lysin.
    3. Tilsæt 4 ml trifluorsyre (TFA) dråbevis ved hjælp af en sprøjte under omrøring.
    4. Reaktionsblandingen omrøres i 1 time ved RT. Reaktionen ved hjælp af CH2Cl2-methanol (9:1) som elueringsret.
    5. Reaktionsblandingen koncentreres under reduceret tryk.
    6. Der tilsættes diethylether til råresterne, og det inkuberes ved 4 °C i 1 time for at udfælde prk'en. Når der arbejdes på højere skala, hvis PrK ikke er helt udfældet, triturate at fremskynde det og forlænge inkubationstiden, hvis det er nødvendigt.
    7. Filter prk i form af et hvidt fast stof på et fritted glas.
    8. Opløs en prøve af prk i D2O. Derefter udføre NMR analyser til at kontrollere sin identitet og renhed.
    9. Til videre brug opløses den unaturlige aminosyre PrK i destilleret vand ved en endelig koncentration på 100 mM og opbevares ved -20 °C som 1 ml aliquots.

2. Produktion af rekombinant protein modificeret af PrK

  1. Plasmid forberedelse
    1. Konstruere et udtryk plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHHH), der indeholder målet modne Pneumokok overflade adhesin A (mPsaA) genet (pET24d-mPsaA-WT) efterfulgt af en tobaksætasesekvens (TEV) ved kloning af indsatsen mellem BamHI- og XhoI-begrænsningsstederne for pET24d plasmid. Dette vil indføre enHans 6 tag på C-terminus af proteinet. Udskift codon af lysin-32 med den gule codon (TAG), ved hjælp af konventionelle site-rettet mutagenesis teknik.
    2. Konstruere et andet udtryk plasmid (pEVOL-MmPylRS), der indeholder to kopier af genet kodning for pyrrolysyl-tRNA syntetase fra Methanosarcina mazei (MmPylRS) og genet kodning for den tilsvarende tRNAPyr som tidligere beskrevet19. Brug denne specielt designet plasmid vektor, pEVOL, for effektiv inkorporering af UAAs.
      BEMÆRK: De detaljerede plasmider oplysninger er beskrevet i Supplerende Fil 1.
  2. Co-transformation af plasmider til udtrykket stamme
    1. Tø en 100 μL aliquot af kemisk kompetent Escherichia coli BL21(DE3) på is i 5 min.
    2. Der tilsættes 1 μL af hver plasmid (50-100 ng af hver) i cellerne og inkuberes i 30 minutter på is.
    3. Mikrorøret på 1,5 ml overføres med de optøede kompetente celler i en inkubator ved 42 °C i 45 s, hvorved den flyttes tilbage til is i 2 min.
    4. Der tilsættes 900 μL LB-medium og inkuberes under omrystning i 1 time ved 37 °C for at tillade ekspression af antibiotika. Derefter plade bakterierne på LB agar med 25 μg/ml kanamycin og 30 μg/ml chloramphenicol. Tillad bakterievækst natten over ved 37 °C.
  3. Ekspression af proteiner modificeret med PrK
    1. Inokuler en enkelt co-transformeret koloni i 5 ml LB-medium med antibiotika (25 μg/ml kanamycin og 30 μg/ml chloramphenicol). Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning.
    2. Den primære kultur (5 ml) fortyndes til 500 ml autoinduktionsmedium indeholdende antibiotika, 0,02 % L-arabinose og 1 ml af den unaturlige aminosyre PrK og inkuberes ved 37 °C i 24 timer ved omrystning. Medtag en negativ kontrol ved at udføre kulturen uden PrK parallelt og en positiv kontrol ved at udføre kulturen i en klon, der indeholder wt protein.
    3. Aliquot 5 ml ud af 500 ml kulturmediet og centrifuge i 10 min. ved 5.000 x g. Supernatanten kasseres, og pelleten fryses ved -20 °C. Høstceller fra de resterende 495 ml ved centrifugering i 10 min. ved 5.000 x g. Supernatanten kasseres, og pelleten fryses ved -20 °C.
  4. Analysér råcelleekstrakter fra de 5 ml kulturprøver efter SDS-PAGE og western blot-analyse
    1. Resuspend 5 ml cellepiller i 250 μL lysis buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF) og overføre det til en 1,5 mL mikrorør.
    2. Lyse celler ved at fryse rørene i flydende nitrogen, optøning det i en 42 °C bad og vortexing ved høj hastighed i 30 s. Gentag dette trin 3 gange.
    3. Centrifuge prøver på 17.000 x g i 10 minutter for at fjerne cellerester.
    4. Tag 10 μL af supernatanten og tilsæt 5 μL vand og 5 μL læssepude (bromophenolblå, SDS, β-mercaptoethanol). Prøverne opvarmes i 5 minutter ved 100 °C og udfør SDS-PAGE- og western blot-analyser.
  5. Protein rensning ved tyngdekraft flow-bænk affinitetkromatografi ved hjælp af Nikkel-NTA perler
    1. Resuspend cell pellets (fra 495 ml kultur) i 20 ml lysis buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF).
    2. Der tilsættes 5 μL DNase I (1 mg/ml) og 500 μL lysozym (50 mg/ml) i suspensionen, og lysis ved inkubation af suspensionen ved 37 °C i løbet af 30 min.
    3. Sonikere cellerne i løbet af 5 min (cyklusser på 5 s-5 s, amplitude 50%) og derefter fjernes cellerester ved centrifugering ved 20.000 x g i 30 min. efterfulgt af filtrering på 0,45 μm filter.
    4. Der tilsættes Ni-NTA harpiks til suspensionen (500 μL til 500 ml cellekultur) og blandes forsigtigt ved 4 °C i 1 time.
    5. Hæld suspensionen i en polypropylen kolonne og indsamle den ubundne fraktion.
    6. Harpiksen vaskes med 10 ml vaskebuffer indeholdende 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol. Harpiksen vaskes igen med 5 ml vaskepude (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazol). Saml vaskefraktionerne.
    7. Elute hans-mærkede protein med 1 ml elution buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol). Gentag dette trin 4 gange og indsamle alle elution fraktioner.
    8. Analysér det rå lysat samt de 7 rensefraktioner ved SDS-PAGE på en 12% acrylamidgel.
    9. Kombiner fraktioner, der indeholder ren Hans-mærkede protein og dialysere det mod 1 L af TEV protease buffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) natten over ved hjælp af en dialyse membran (cut-off MW 6000-8000 Da). Proteinets koncentration måles ved 280 nm med en molære udryddelseskoefficient på 37 360 cm-1∙M-1 og en molekylvægt på 34,14 kDa for mPsaA.

3. Fjernelse af histidin tag ved TEV protease fordøjelse

  1. Proteinprøven opsamls i et 50 ml rør, og TEV-bufferen (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) op til 1 ml i en koncentration på 2 mg/ml.
    BEMÆRK: Koncentrationen kan variere alt efter tidligere resultater. Proteinkoncentrationer, som vi har testet, er i et typisk 2-3 mg/ml-område.
  2. Der tilsættes 100 μL TEV-protease (tilsættes 1 μL indeholdende 10 enheder TEV-protease i 20 μg protein til fordøje).
  3. Der tilsættes 50 μL 0,1 M dithiothreitol (DTT).
  4. Komplet med TEV buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) op til 5 ml.
  5. Inkuber natten over ved 4 °C med langsom omrystning.
    BEMÆRK: Hvis fordøjelsen ikke er fuldstændig, tilsættes mere TEV-protease, inkuberes i længere tid eller ved højere temperatur op til 30 °C.
  6. Dialyse det fordøjede protein til at fjerne EDTA ved 4 °C natten over ved hjælp af en dialysemembran (cut-off 6000-8000 Da) mod fosfat buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 5 mMmidazole).
  7. For at fjerne TEV-protease og det ufordøjede protein inkuberes blandingen med Ni-NTA perler og blandes forsigtigt i 1 time ved 4 °C.
  8. Hæld suspensionen i en polypropylen kolonne. Opsaml den ubundne brøk, og kolonnen vaskes med 5 ml vaskebuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol)
    BEMÆRK: Det protein af interesse bør inddrives i ubundet og vask fraktioner.
  9. Elute TEV protease og det ufordøjede protein ved at tilsætte 5 ml elution buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) på kolonnen. Kontroller fraktionerne for proteinindhold ved 280 nm og ved SDS-PAGE analyse.
  10. Kontroller effektiviteten af fordøjelsen ved at indlæse fordøjede prøver på en SDS-side med det ufordøjede protein som kontrol.
  11. Dialysere det fordøjede protein mod 1 L klikbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) ved 4 °C natten over med en dialysemembran (afskæring 6000-8000 Da) for at fjerne imidazole samt at udskifte bufferen og måle koncentrationen af proteinet ved 280 nm med molære udryddelseskoefficient og molekylvægt af mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 og MW 34,14 kDa).

4. Vurdering af den unaturlige aminosyre propargyl-lysin tilgængelighed og funktionalitet til klikkemi

BEMÆRK: Konjuger mPsaA med 6-hexachloro-fluorescein-azide ved hjælp af den protokol, der er beskrevet af Presolski et al.20 for klikkemi.

  1. Der tages 432,5 μL PrK-muteret protein i en koncentration på 57,8 μM i et 2 ml mikrorør.
    BEMÆRK: En koncentration på mindst 2 μM alkyne er acceptabel. Hvis proteinkoncentrationen er lavere, koncentrere det med en centrifugal koncentrator eller favorisere balancen i reaktionen ved at øge azide / alkyne kindtand forholdet.
  2. Der tilsættes 10 μL 5 mM 6-hexachlor-fluorescein-azid, og der tilsættes derefter en forblanding på 2,5 μL CuSO4-opløsning ved 20 mM og 7,5 μL Tris (benzyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ved 50 mM (lageropløsningskoncentrationer).
    1. Der tilsættes 25 μL vandig 100 mM aminoguanidinhydrochlorid.
    2. Der tilsættes 25 μL på 20 mg/ml en extemporaneously forberedt vandig opløsning af natrium ascorbat.
    3. Rør, bland ved at vende flere gange og inkubere ved stuetemperatur i 2 timer.
    4. Stop reaktionen ved at tilsætte 50 μL 0,5 M EDTA.
    5. Tag 15 μL af reaktionsblandingen og sætte det en mikrorør, tilsæt 5 μL af lastning buffer (bromophenol blå, SDS, β-mercaptoethanol), varme blandingen ved 100 °C i 5 min, og derefter indlæse den i en 12% acrylamid gel. Efter migration, visualisere fluorescerende konjugat på gelen under UV-lys ved 312 nm.

5. Bøjning af mPsaA med et azido-funktionaliseret kulhydratantigen (Pn14TS-N3)ved at klikke kemi

  1. Kobling
    1. Tag 432,5 μL PrK-muteret protein ved 57,8 μM i en 2 ml mikrorør.
    2. Der tilsættes 10 μL 5 mM Pn14TS-N321 i vand, hvortil der tilsættes en forblanding af 2,5 μL CuSO4-opløsning ved 20 mM og 7,5 μL THPTA ved 50 mM.
      BEMÆRK: Syntese af Pn14TS-N3, en tetrasaccharid efterligne Streptococcus pneumoniae serotype 14 capsular polysaccharid, er blevet beskrevet i reference 21. Teoretisk set kan ethvert kulhydratantigen, der indeholder en azidefunktion, anvendes.
    3. Der tilsættes 25 μL 100 mM aminoguanidinhydrochlorid.
    4. Der tilsættes 25 μL 20 mg/ml extemporaneously-fremstillet vandig opløsning af natrium ascorbat.
    5. Rør, bland røret ved at vende flere gange og inkubere ved RT i løbet af 2 timer.
    6. Stop reaktionen ved at tilsætte 50 μL 0,5 M EDTA.
    7. Der udtages 15 μL prøver, og analysér efter SDS-PAGE.
  2. Gelfiltrering rensning af glycoconjugate
    1. Rengør glycoconjugaten ved at anvende den på en sterisk eksklusionsal kolonne (15 x 600 sengedimensioner, 3.000-70.000 fraktioneringsområde), ligevægt med 100 mM PBS-buffer, pH 7,3 ved en 0,8 ml/min-flow med detektion ved 280 nm.
    2. Opsaml de brøker, der indeholder glycoconjugaten.
      BEMÆRK: Ved længerevarende opbevaring skal glykokonjugaten dialykoge mod 1 L H2O to gange i 2 timer og derefter natten over ved 4 °C ved hjælp af dialysemembran (cut-off Mw 6000-8000 Da), derefter frysetørres og glycokonjugaten opbevares ved -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette projekt blev der fremstillet en homogen glykokonjugavaccine ved hjælp af den gule codon-undertrykkelsesstrategi for at indføre en ULA på et defineret sted (figur 1). Pneumoccocal overflade adhæsin A blev valgt som bærer protein moiety. Dette protein er stærkt bevaret og udtrykt af alle stammer af Streptococcus pneumoniae22. Det er meget immunogent og tidligere anvendt som bærer i pneumokokvaccineformuleringer21,23. Som en proof-of-concept, uaa propargyl-lysin effektivt opkrævet af den vilde type pyrrolysyl-tRNA syntetase (PylRS) / tRNA par af archaea Methanosarcina mazei blev undersøgt. Den propargyl-lysin er kommercielt tilgængelige, men kan med fordel fremstilles af Boc-L-lysin i kun to syntetiske trin (Figur 2). En rav codon blev genereret på en ønsket position i en pET24d plasmid indeholdende mPsaA genet. Denne plasmid blev co-omdannet med en pEVOL plasmid (en slags gave fra Edward Lemke (EMBL19),der indeholder ortogonale værktøjer er nødvendige for at indarbejde propargyl-lysin, i kompetente E. coli BL21 (DE3) stamme. Positive co-transformerede kloner blev udvalgt ved hjælp af 25 μg/mL kanamycin og 30 μg/mL chloramphenicol. Plasmid pEVOL indeholder oprindeligt ikke én, men to kopier af genet kodning for MmPylRS at indarbejde propargyl-lysin rester: den første kopi er under kontrol af en konstituerende promotor, mens udtrykket af den anden er induceret i overværelse af arabinose. Men, Vi har bemærket nogen dramatisk fald i propargyl-lysin inkorporering, hvis MmPylRS genet under kontrol af konstituerende promotor er undertrykt.

Den propargyl-lysin blev indført på position 32 i erstatning af en lysin nær N-endinus af PsaA. Enhver rest med en overflade-eksponeret sidekæde kan næsten udskiftes med henblik på at foretage yderligere bøjning. Det muterede protein blev produceret i sin modne form (mPsaAK32PrK) med inddragelse af en kløvet 6-histidin tag sekvens på sin C-endestation. Effektiviteten af mPsaAK32PrK produktionen blev kontrolleret af SDS-PAGE og Western Blot analyse ved hjælp af en anti-Histidine tag antistof, når væksten blev udført i nærvær eller fravær af UAA propargyl-lysin og i sammenligning med produktionen af den vilde type mPsaA (Figur 3). Visualisering afslørede et proteinbånd med forventet molekylvægt (Vognbane 4, Figur 3A & 3B). Tilstedeværelsen af et protein i fuld længde indikerer stærkt den vellykkede inkorporering af PrK i mPsaA. Intensiteten er dog lavere end den, der er observeret for vildtype mPsaA (Vognbane 2, Figur 3A & 3B). Lækage (dvs. produktion af protein i fuld længde uden inkorporering af ULA) og for tidlig frigivelse af proteinet ved Release Factor RF1 under oversættelsen er to hoved ulemper, der ofte opstår under denne proces. På den ene side visualiseres der ingen bånd ved den forventede molekylvægt, hvis der ikke er propargyl-lysin, hvilket betyder, at der ikke er sket lækage (Vognbane 3,Figur 3A & 3B) og indirekte bekræftet, at det bånd, der er observeret på bane 4, svarer til mPsaAK32PrK. På den anden side kan der ikke ses noget bånd ved lav molekylvægt, der kan svare til den afkortede form af parPsaA (Bane 4 på figur 3A). MPsaK32PrK blev derefter renset ved affinitetskromatografi med et typisk udbytte på 8 mg/l (i forhold til 12-20 mg/l for det vilde typeprotein), og inkorporering af propargyl-lysinrester blev endeligt bekræftet ved massespektrometri (figur 4). Den histidine tag blev fjernet på proteolytisk spaltning ved hjælp af TEV protease (Figur 4). Stabiliteten af den således opnåede mPsaAK32PrK blev vurderet ved cirkulær dichroisme, som viste, at proteinets struktur ikke blev forstyrret af lysin 32's mutation til en propargyl-lysin (data ikke vist).

Under mPsaAK32PrK, reaktivitet af alkynen for klik kemi blev vurderet ved hjælp af en azido-funktionaliseret fluorescein og yderligere bruges til at konjugere en syntetisk oligosaccharid antigen β-2-azidoethyl d-Galp-(01→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Figur 5). Denne tetrasaccharid er relateret til S. pneumoniae type 14 capsular polysaccharid og er tidligere blevet konjugeret til mPsaA ved hjælp af forskellige bøjningskemier8,21,24. Eksperimenter her blev udført i sammenligning med vilde type parPsaA som en kontrol. Den histidine tag blev først fjernet på proteolytisk spaltning ved hjælp af TEV protease. Den fordøjede mPsaAK32PrK og mPsaA WT blev derefter konjugeret til fluoroprobe (figur 6A) eller Pn14TS ( Figur6B). Reaktionen blev vurderet af SDS-PAGE. Den lille forøgelse af prøvens molekylvægt mellem vognbane 6 og 7 (figur 6B) indikerer en vellykket bøjning med tetrasaccharid Pn14TS. Endelig blev glycoconjugatet renset ved gelfiltrering, og dens identitet blev bekræftet ved massespektrometri (figur 6C). Bøjningen ved klikkemi er kvantitativ størstedelen af mPsaAK32PrK blev konjugeret med Pn14TS-N3 som illustreret ved massespektrometri resultater (Figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Inkorporering af propargyl-lysin (PrK) i mPsaA under oversættelse ved hjælp af en ortogonal pyrrolysyl-tRNA syntetase/tRNA par og TAG codon omplacering25. Under oversættelsen katalyser endogene syntetaseer forbindelsen mellem aminosyrer og tilsvarende tRNA'er. Derefter er indlæst tRNA'er bruges af ribosomal maskiner til at generere neo-syntetiseret polypeptid. Ifølge den gule stop codon suppression strategi, en ortogonal aminoacyl-tRNA syntetase (aaRS) (heri en pyrrolysyl-tRNA syntetase fra M. mazei), belastninger en UAA (heri PrK) på sin cognate tRNA som designet anticodon kan læse rav stop codon (TAG) på mRNA. Denne specifikke anerkendelse dirigerer inkorporeringen af ULA i det specifikke sted på målproteinet. Figur gengivet fra Wang et al.25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Propargyl-lysin syntese. (A)Trin af propargyl-lysin syntese. Indsats: Overvågning af deprotection af Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH-mellemprodukt: tyndtlagskromatografi på 0,25 mm silicagelplader med fluorescerende indikator (GF254) og visualiseret ved forkulning med vanillin i svovlsyre/ethanol (1.5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), venstre vognbane: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH (Rf 0.90), højre vognbane: rå propargyl-lysin (Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) og 13C NMR spektre (C) af propargyl-lysin registreret i D2O. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Analyse af råcelleprøver. a) SDS-PAGE-analyse ogb) western blot-analyse af råcelleprøver. Vognbane 1: uhæmmet proteinmarkør; Vognbane 2: rå celleekstrakt af vild type mPsaA; Vognbane 3: rå celleekstrakt af mPsaAK32TAG dyrket i mangel af PrK; Vognbane 4: rå celleudvinding af mPsaAK32TAG dyrket i nærvær af PrK. Betingelser: 12% acrylamid gel, der kører på 100 V, 2 h. SDS-SIDE plettet af Coomassie blå; Western Blot afsløret ved hjælp af anti-histidin tag antistof og sekundært antistof kombineret med AlexaFluor680. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Fjernelse af histidemærke og massespektrometrianalyse. (A) SDS-PAGE analyse. Vognbane 1: uhæmmet proteinmarkør; Vognbane 2: rå celleekstrakt; Vognbane 3: ubundet brøk; Vognbane 4: vask fraktion med 10 mM imidazol; Vognbane 5: vask brøk med 20 mM imidazol; Betingelser: 12% acrylamid gel kører på 100 V for 2 h, og farves af Coomassie blå; (B) MALDI-TOF-MS spektre af (top) parPsaA WT, teoretisk MW 33 103 Da, fundet 33 106 Da og (nederst) parPsaA K32PrK, teoretisk 33 184 Da, fundet 33 192 Da. De fundne masser er inden for den forventede marginfejl. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Skematisk repræsentation af bøjningsstrategien ved klikke kemi. En enkelt tetrasaccharid med en azide er specifikt koblet til sin komplementære biorthogonal alkyne gruppe på mPsaA K32PrK (mPsaA repræsentation baseret på 1PSZ PDB fil, med en opløsning på 2,0 Å26). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Histidin-tag fordøjelse og bøjning af mPsaA med (A) fluorescein-N3 og med (B) Pn14TS. a) SDS-PAGE Lanes 1-3: WT mPsaA; Vognbane 4-6: mPsaAK32PrK; b) Vognbane 1: uhæmmet proteinmarkør; Bane 2-4: WT mPsaA; Lane 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg proteinprøve/bane, 12% acrylamid, 100 V, 2 timer; (C ) MALDI-TOF-MS spektre af Pn14TS-mPsaAK32PrK teoretisk MW 34 091 Da, fundet 34 088 Da. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1. Klik her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Site-rettet mutagenesis er en enkel strategi for at indarbejde specifikke aminosyrer på en defineret position af et protein, som stadig næppe anvendes med det formål at forberede glycoconjuga vacciner7,8,14. Klassisk mutagenese baseret på 20 naturlige aminosyrer tilgang er yderst effektiv, da ingen ændring af oversættelsen maskiner er påkrævet. Cysteine mutationer er normalt målrettet til yderligere at udforske den unikke thiol reaktivitet enten direkte eller i to trin (f.eks.efter dens ændring i et dehydroalaninprodukt, en strategi kaldet post-translationel mutagenese)27,28. Genetisk kode ekspansion er måske endnu mere attraktiv og fleksibel, da det giver mulighed for direkte inkorporering af en bred vifte af UAAs med forskelligefunktionaliteter 9,10. Mens flere UAAs kan indarbejdes samtidigt i et protein29, er antallet af mutationer normalt mere begrænset. Vi heri anvendt den relaterede rav stop codon strategi for at indføre en enkelt propargyl-lysin i et luftfartsselskab protein. Inkorporeringen kan finde sted i enhver position, forudsat at sideringen af den oprindelige aminosyre var overfladeeksponeret, et kriterium, der let kan bestemmes ud fra røntgenkrystykografiske strukturer eller i silicomodellering. Desuden er det ikke begrænset til propargyl-lysin, men kan udvides til enhver UAA funktionaliseret med en biorthogonal funktion, som senere vil tjene som et anker til podning af indgående kulhydrat antigen, og for hvilke en ortogonale aaRS / tRNA par eksisterer.

En af ulemperne ved strategien er den mulige produktion af afkortet protein, som følge af frigivelsen af peptidyl sidechain, når du læser den gule stop codon, som et sideprodukt. Selv om vi ikke observere nogen afkortet form her (sandsynligvis forringet af bakterier på grund af det meget lille størrelse), en histidin tag er blevet tilføjet på C-terminus af proteinet for at lette rensningen af den forventede fuld længde muterede protein fra urenheder og mærkbart fra det afkortede protein (som i det væsentlige ikke udtrykker histidin tag sekvens). Dette kan blive afgørende, hvis UAA-inkorporeringen udføres i nærheden af proteinet C-endestation, da rensning ikke kan forsøges ved hjælp af alternative kromatografiteknikker som gelfiltrering.

For de fleste applikationer fjernelse af histidin tag er ikke obligatorisk. Det kan dog være nyttigt med hensyn til udformningen af glycoconjugavaccine som en del af immunsystemet kan blive omdirigeret mod tagsekvensen. Til dette proof-of-concept indsatte vi en aminosyrelængdesekvens, der specifikt er kløvet af TEV-protease, som efterlader fem ekstra aminosyrer på bærerproteinet efter fordøjelsen.

Konjugationen skridt mellem alkynen af propargyl-lysin og en repræsentativ syntetisk oligosaccharid Pn14TS relateret til en pneumokok kapsel og forsynet med en supplerende azide blev udført i henhold til et klik kemi protokol rapporteret af Presolski et al.20 Om nødvendigt kan reaktionen fuldføres ved at øge reaktionstiden eller ved at ændre forholdet mellem azine, azide og kobberreaktanter og reagenser. Kobbersalte elimineres ved behandling med overskydende EDTA efterfulgt af en kort rensning ved sterisk eksklusionskromatografi.

Glycoconjugaten, der er opnået med den teknik, der er beskrevet i det nuværende arbejde, kan derefter bruges til at immunisere mus. At have en sådan fuldt defineret og let moduleret glykokonjugate i hænderne giver uvurderlige værktøjer til at vurdere virkningen af hapten/proteinbærerkonnektivitet på immunrespons8. Da en forøgelse af hapten/protein-forholdet ofte korreleres med forbedret anti-hapten humoral respons, når man bruger korte haptens30, kan man være interesseret i at teste konjugater med flere haptens. Indarbejdelsen af flere UAAs har dog brug for nogle justeringer af protokollen, da inkorporering af en ULA i proteinet har tendens til at reducere proteinproduktionens udbytte på grund af RF1-aktiviteten.

I endelig, denne metode er et effektivt værktøj til at få adgang til homogene glycoconjugate vacciner lette deres fysisk-kemiske karakterisering og yderligere kulhydrat antigen / luftfartsselskab tilslutningsforbindelse-immunogenicity forholdet undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

E.C. anerkender taknemmeligt den finansielle støtte fra La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), især et ph.d.-stipendium til TV Vi anerkender også Dr. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrig) for hans dyrebare tekniske råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Tags

Bioengineering syntetisk biologi homogen glycoconjugate site-selektiv biokonjugation unaturlig aminosyre genetisk kode ekspansion klik-kemi propargyl-l-lysin kulhydrat
Homogen glycoconjugate produceret af kombineret unaturlig aminosyre inkorporering og klikkemi til vaccineformål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter