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Bioengineering

Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

L'espansione del codice genetico viene applicata per l'introduzione di un amminoacido innaturale che porta un gruppo funzionale biorthogonale su una proteina portante in un sito definito. La funzione biorthogonale viene ulteriormente utilizzata per l'accoppiamento site-selective di un antigene di carboidrati per fornire un vaccino glicoconi coniugato omogeneo.

Abstract

L'espansione del codice genetico è un potente strumento per introdurre amminoacidi innaturali (UAA) nelle proteine per modificarne le caratteristiche, studiare o creare nuove funzioni proteiche o avere accesso ai coniugati proteici. Fermare la soppressione del codone, in particolare la soppressione del codone ambrato, è emerso come il metodo più popolare per introdurre geneticamente gli UAA in posizioni definite. Questa metodologia è applicata alla preparazione di una proteina portante contenente una UAA che ospita un gruppo funzionale bioorthogonale. Questo manico reattivo può essere successivamente utilizzato per innestare in modo specifico ed efficiente un oligosaccaride sintetico hapten per fornire un vaccino omogeneo glicoconi coniugato. Il protocollo è limitato alla sintesi dei glicoconi coniugati in un rapporto 1:1 di carboidrati hapten/proteina portante ma suscettibile a numerose coppie di gruppi funzionali biorthogonali. L'omogeneità del vaccino glicoconi coniugato è un criterio importante per garantire una caratterizzazione fisico-chimica completa, soddisfacendo così sempre più esigenti le raccomandazioni delle agenzie di regolamentazione dei farmaci, un criterio che non è soddisfatto dalle classiche strategie di coniugazione. Inoltre, questo protocollo consente di ottimizzare finemente la struttura dell'attuale vaccino coniugato, dando origine a strumenti per affrontare le relazioni struttura-immunogenicità.

Introduction

I vaccini glicoconi coniugati sono elementi essenziali dell'arsenale vaccinale disponibile per il trattamento profilattico delle malattie infettive. Sono sicuri, ben tollerati ed efficienti in un'ampia fascia d'età, compresi i bambini piccoli. Forniscono la difesa ottimale contro le infezioni causate da batteri capsulati come meningococco, pneumococco o Haemophilus influenzae di tipo b1. I vaccini glicoconi coniugati sono fatti di polisaccaridi batterici purificati che formano le capsule di batteri o oligosaccaridi sintetici che imitano questi polisaccaridi espressi insuperficie 2, che sono covalentemente collegati a una proteina portante. La presenza di una proteina portante è essenziale per promuovere risposte immunitarie umoriche protettive dirette contro il determinante antigenico espresso dagli antigeni dei carboidrati3. Oltre a un'attenta selezione e produzione dell'antigene dei carboidrati, le caratteristiche note per esercitare un'influenza sull'efficacia di un vaccino glicoconi coniugato sono: la natura della proteina portante, la chimica coniugazione (compresa la natura e la lunghezza del linker se usato), o il rapporto saccaride / proteina3. Ovviamente, le posizioni in cui il saccaride è coniugato alla proteina e il numero di punti di connettività sono rilevanti per l'immunogenicità. Ad oggi, questi due parametri sono stati appena studiati perché la preparazione dei glicoconi coniugati rimane in gran parte empirica. La loro sintesi di solito si basa sull'uso di funzioni di ammina o acido carbossilico rispettivamente di lysine o residui della catena laterale dell'acido aspartico / glutammico presenti sulla sequenza proteica portante. Questo porta non a un singolo ma a una miscela eterogenea di glicoconi coniugati.

Giocare sulla reattività, l'accessibilità o la distribuzione dei residui di amminoacidi nella proteina dà origine a glicoconi coniugati più definiti che sono più affidabili per documentare l'effetto della connettività saccharide /proteina 4. Un passo avanti verso questo obiettivo può essere raggiunto applicando la tecnologia di accoppiamento del glico proteico, un processo ricombinante che consente la produzione di vaccini glicoconi coniugati controllati nelle fabbriche dicellule 5,6. Tuttavia, la glicosilazione avviene esclusivamente con un residuo di asparagina all'interno dei sequoni D/EXNYS/T (per cui X è uno dei 20 amminoacidi naturali), non naturalmente presente sulle proteine portanti.

La mutagenesi selettiva del sito e in particolare l'incorporazione delle cisteine per sfruttarne la reattività altamente e selettiva appare comealternativa 7,8. La produzione di proteine portanti che incorporano UAA nella loro sequenza può offrire ancora più flessibilità per la preparazione omogenea del vaccino glicoconi coniugato. Più di 100 UAA sono stati sviluppati e ulteriormente incorporati in varie proteine9,10. Molti di essi contengono funzioni bioorthogonali solitamente utilizzate per effettuare modifiche post trasizionali11 o per innestare sonde biofisiche12 o farmaci13, ma che sono maniglie ideali per un'ulteriore coniugazione con antigeni di carboidrati. Esempi di successo sono stati rivendicati da Biotech14 utilizzando la sintesi proteica priva di cellule15, ma la preparazione di vaccini glicoconi coniugati secondo questa strategia aspetta ancora di diventare popolare.

L'applicazione della strategia in vivo per la produzione di proteine portanti mutate necessita di un macchinario traslazionale modificato che includa un codone specifico, un tRNA che riconosca il codone e un amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS) che catalizza specificamente il trasferimento dell'UAA sul tRNA (Figura 1)16. La soppressione del codone di arresto dell'ambra pirrolisina è uno dei metodi più utilizzati per incorporare la UAA, in particolare la propargil-llysina (PrK)17. Quest'ultimo può a sua volta reagire con haptens di carboidrati funzionalizzati all'azido per fornire glicoconi coniugati completamente definiti e omogenei. Nel presente manoscritto descriviamo come sintetizzare la propargyl-L-lisina, una UAA che porta una maniglia di alchine, come incorporarla in una proteina bersaglio durante la sua traduzione in un batterio e infine come eseguire la coniugazione tra la proteina modificata e un hapten che porta una funzione di azide usando la chimica dei clic.

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Protocol

1. Sintesi della UAA: propargil-llysina (PrK)

  1. Sintesi di Nα-Boc-propargil-llysina18
    1. Sciogliere 500 mg di Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) in una miscela acquosa 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) in un pallone e montare il pallone con un setto di silicio.
    2. Raffreddare il pallone in un bagno di ghiaccio e quindi aggiungere 158 μL di propargil cloroformato (1,62 mmol) dropwise (per un periodo di 2-3 minuti) utilizzando una microsiringa durante l'agitazione.
    3. Riscaldare la miscela di reazione a temperatura ambiente e continuare a mescolare per 10 ore.
    4. Raffreddare soluzioni di 50 mL di etere dietile, 50 mL di acido cloridrico acquoso da 1 M e 60 mL di acetato di etile in un bagno di ghiaccio.
    5. Raffreddare la miscela di reazione grezza in un bagno di ghiaccio e versare la miscela in un imbuto di separazione. Estrarre la miscela con 50 mL di etere dietile. Scartare lo strato organico.
    6. Aggiungere cautamente acido cloridrico acquoso da 1 M alla fase acquosa nell'imbuto di separazione. Quindi estrarre lo strato acquoso due volte usando 30 mL di acetato di etile. Verificare la presenza di N-Boc-propargil-lisina in fase organica tramite TLC usando CH2Cl2-metanolo (9:1) come eluente.
    7. Asciugare gli strati organici combinati su MgSO4,filtrare la fase solida e concentrare il filtrato sotto pressione ridotta su un evaporatore rotante.
    8. Sciogliere un campione del petroliogreggio N α -Boc-propargil-lisina in cloroformio deuterato (CDCl3)e controllarne l'identità di 1H NMR.
      ATTENZIONE: L'estrazione può comportare un accumulo di pressione. Rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione.
  2. Sintesi dell'amminoacido innaturale propargil-L-lisina (PrK)
    1. Introdurre Nα-Boc-propargyl-lysine in un pallone inferiore rotondo dotato di setto.
    2. Aggiungere 4 ml di diclorometano anidro (CH2Cl2) al pallone sotto argon per sciogliere la Nα-Boc-propargil-lisina.
    3. Aggiungere 4 ml di acido trifluoroacetico (TFA) dropwise usando una siringa durante l'agitazione.
    4. Mescolare la miscela di reazione per 1 h a RT. Monitorare la reazione con TLC usando CH2Cl2-metanolo (9:1) come eluente.
    5. Concentrare la miscela di reazione sotto pressione ridotta.
    6. Aggiungere l'etere dietile al residuo grezzo e incubarlo a 4 °C per 1 h per far precipitare il PrK. Quando si lavora su scala più elevata, se il PrK non è completamente precipitato, triturato per precipitarlo e prolungare il tempo di incubazione se necessario.
    7. Filtrare il PrK sotto forma di un solido bianco su un vetro fritte.
    8. Sciogliere un'aliquota del PrK in D2O. Quindi effettuare analisi NMR per controllarne l'identità e la purezza.
    9. Per un ulteriore utilizzo, sciogliere l'amminoacido innaturale PrK in acqua distillata ad una concentrazione finale di 100 mM e conservare a -20 °C come aliquote da 1 mL.

2. Produzione della proteina ricombinante modificata da PrK

  1. Preparazione plasmide
    1. Costruire un'espressione plasmide (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHH) che contiene l'adessina superficiale Pneumococcica matura bersaglio A (mPsaA) gene (pET24d-mPsaA-WT) seguita da una sequenza di proteasi del virus dell'incisione sul tabacco (TEV) clonando l'inserto tra i siti di restrizione BamHI e XhoI del plasmide pET24d. Questo introdurrà un tag His6 al C-terminale della proteina. Sostituire il codone della lisina-32 con il codone ambrato (TAG), usando la tecnica convenzionale di mutagenesi site-directed.
    2. Costruire una seconda espressione plasmide (pEVOL-MmPylRS) contenente due copie del gene codificante per la pirrolisil-tRNA sintetasi da Methanosarcina mazei (MmPylRS) e la codifica genica per il corrispondente tRNAPyr come precedentementedescritto 19. Utilizzare questo vettore plasmide appositamente progettato, pEVOL, per un'efficiente incorporazione di UAA.
      NOTA: Le informazioni dettagliate sui plasmidi sono descritte nel file supplementare 1.
  2. Co-trasformazione dei plasmidi nel ceppo di espressione
    1. Scongelare un'aliquota di 100 μL di Escherichia coli BL21(DE3) chimicamente competente sul ghiaccio per 5 minuti.
    2. Aggiungere 1 μL di ogni plasmide (50-100 ng di ciascuno) nelle cellule e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.
    3. Trasferire il microtubo da 1,5 mL con le celle competenti scongelate in un incubatore a 42 °C per 45 s e quindi spostarlo di nuovo sul ghiaccio per 2 minuti.
    4. Aggiungere 900 μL di mezzo LB e incubare sotto scuotimento per 1 h a 37 °C per consentire l'espressione antibiotica. Quindi placcare i batteri sull'agar LB con 25 μg/mL di kanamicina e 30 μg/mL di cloramfenicolo. Consentire la crescita dei batteri durante la notte a 37 °C.
  3. Espressione di proteine modificate con PrK
    1. Inoculare una singola colonia co-trasformata in 5 mL di mezzo LB con antibiotici (25 μg/mL di kanamicina e 30 μg/mL di cloramfenicolo). Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione.
    2. Diluire la coltura primaria (5 mL) in 500 mL di mezzo auto-induzione contenente antibiotici, 0,02% di L-arabinosi e 1 mM dell'amminoacido innaturale PrK e incubarlo a 37 °C per 24 ore con scuotimento. Includere un controllo negativo eseguendo la coltura senza PrK in parallelo e un controllo positivo eseguendo la coltura di un clone contenente la proteina wt.
    3. Aliquota 5 mL del mezzo di coltura da 500 mL e centrifuga per 10 min a 5.000 x g. Scartare il supernatante e congelare il pellet a -20 °C. Cellule di raccolta dai restanti 495 mL per centrifugazione per 10 min a 5.000 x g. Scartare il supernatante e congelare il pellet a -20 °C.
  4. Analizzare gli estratti di cellule grezze dai campioni di coltura da 5 mL mediante SDS-PAGE e l'analisi western Blot
    1. Resuspend 5 mL cell pellets in 250 μL di tampone dilisi (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF) e trasferirlo in un microtubo da 1,5 mL.
    2. Le cellule lyse congelando i tubi in azoto liquido, scongelandosi in un bagno di 42 °C e vortice ad alta velocità per 30 s. Ripetere questo passaggio 3 volte.
    3. Centrifugare campioni a 17.000 x g per 10 minuti per eliminare i detriti cellulari.
    4. Prendere 10 μL del supernatante e aggiungere 5 μL di acqua e 5 μL di tampone di carico (blu bromofenolo, SDS, β-mercaptoetanolo). Riscaldare i campioni per 5 minuti a 100 °C ed effettuare analisi SDS-PAGE e western Blot.
  5. Purificazione proteica mediante cromatografia di affinità del banco di flusso gravitazionale con perline Nickel-NTA
    1. Rimescolare il pellet di cellule (dalla coltura di 495 mL) in 20 mL di tampone di lysis (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazolo, 0,2 mM PMSF).
    2. Aggiungere 5 μL di DNasi I (1 mg/mL) e 500 μL di lisozima (50 mg/mL) nella sospensione e consentire la lisi incubando la sospensione a 37 °C durante 30 min.
    3. Sonicare le cellule durante 5 min (cicli di 5 s-5 s, ampiezza 50%) quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a 20.000 x g per 30 minuti seguita da filtrazione su filtro da 0,45 μm.
    4. Aggiungere la resina Ni-NTA alla sospensione (500 μL per 500 mL di coltura cellulare) e mescolare delicatamente a 4 °C per 1 h.
    5. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene e raccogliere la frazione non vincolata.
    6. Lavare la resina con 10 mL di tampone di lavaggio contenente 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazolo. Lavare la resina una seconda volta con 5 mL di tampone di lavaggio (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazolo). Raccogliere le frazioni di lavaggio.
    7. Eluire la proteina contrassegnata con 1 mL di tampone di eluizione (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolo). Ripetere questo passaggio 4 volte e raccogliere tutte le frazioni di eluizione.
    8. Analizzare il lisato grezzo e le 7 frazioni di purificazione di SDS-PAGE su un gel di acrilammide al 12%.
    9. Unire le frazioni contenenti pura proteina his-tagged e dializzarla contro 1 L di tampone di proteasi TEV (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) durante la notte utilizzando una membrana di dialisi (cut-off MW 6000-8000 Da). Misurare la concentrazione della proteina a 280 nm con un coefficiente di estinzione molare di 37 360 cm-1-M-1 e un peso molecolare di 34,14 kDa per mPsaA.

3. Rimozione dell'etichetta di istidina mediante digestione della proteasi TEV

  1. Raccogliere il campione proteico in un tubo da 50 ml e aggiungere tampone TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) fino a 1 mL ad una concentrazione di 2 mg/mL.
    NOTA: La concentrazione può variare in base ai risultati precedenti. Le concentrazioni proteiche che abbiamo testato sono in una tipica gamma di 2-3 mg/mL.
  2. Aggiungere 100 μL di proteasi TEV (aggiungere 1 μL contenente 10 unità di proteasi TEV per 20 μg di proteine da digerire).
  3. Aggiungere 50 μL di 0,1 M ditiothiothreitol (DTT).
  4. Completo di tampone TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) fino a 5 mL.
  5. Incubare durante la notte a 4 °C con scuotimenti lenti.
    NOTA: Se la digestione non è completa, aggiungere più proteasi TEV, incubare più a lungo o a temperatura più alta fino a 30 °C.
  6. Dializzare la proteina digerita per rimuovere l'EDTA a 4 °C durante la notte utilizzando una membrana di dialisi (cut-off 6000-8000 Da) contro tampone fosfato (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazolo).
  7. Per eliminare la proteasi TEV e la proteina non digerita, incubare il mix con perline Ni-NTA e mescolare delicatamente per 1 h a 4 °C.
  8. Versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Raccogliere la frazione non vincolata e lavare la colonna con 5 mL di tampone di lavaggio (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazolo)
    NOTA: La proteina di interesse deve essere recuperata nelle frazioni non vincolate e di lavaggio.
  9. Elute la proteasi TEV e la proteina non digerita aggiungendo 5 mL di tampone di eluizione (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazolo) sulla colonna. Controllare le frazioni per il contenuto proteico a 280 nm e mediante analisi SDS-PAGE.
  10. Controllare l'efficienza della digestione caricando campioni digeriti su una PAGINA SDS con la proteina non digerita come controllo.
  11. Dializzare la proteina digerita contro 1 L di click buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) a 4 °C durante la notte con una membrana di dialisi (cut-off 6000-8000 Da) per rimuovere l'imidazolo e scambiare il tampone, e misurare la concentrazione della proteina a 280 nm con coefficiente di estinzione molare e peso molecolare di mPsaA (37 360 cm-1-M-1 e MW 34,14 kDa).

4. Valutazione dell'accessibilità e della funzionalità innaturale dell'amminoacido propargil-licosina per la chimica dei clic

NOTA: Coniugare la mPsaA con 6-esacloro-fluoresceina-azide utilizzando il protocollo descritto da Presolski etal.

  1. Assumere 432,5 μL di proteine mutate con PrK ad una concentrazione di 57,8 μM in un microtubo da 2 mL.
    NOTA: È accettabile una concentrazione minima di 2 μM di alchine. Se la concentrazione proteica è inferiore, concentrarla con un concentratore centrifugo o favorire l'equilibrio della reazione aumentando il rapporto molare azide/alchine.
  2. Aggiungere 10 μL di 5 mM 6-esacloro-fluoresceina-azide e quindi aggiungere una premiscele di 2,5 μL di soluzione di CuSO4 a 20 mM e 7,5 μL di Tris(benziltriazolilmetil)ammina (THPTA) a 50 mM (concentrazioni di soluzioni stock).
    1. Aggiungere 25 μL di cloridrato acquoso di 100 mM di aminoguanidina.
    2. Aggiungere 25 μL di 20 mg/mL una soluzione acquosa estemporaneamente preparata di ascorbato di sodio.
    3. Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
    4. Interrompere la reazione aggiungendo 50 μL di 0,5 M EDTA.
    5. Prendere 15 μL della miscela di reazione e metterla in un microtubo, aggiungere 5 μL di tampone di carico (blu bromofenolo, SDS, β-mercaptoetanolo), riscaldare la miscela a 100 °C per 5 minuti, quindi caricarla in un gel di acrilammide al 12%. Dopo la migrazione, visualizzare il coniugato fluorescente sul gel sotto la luce UV a 312 nm.

5. Coniugazione di mPsaA con un antigene di carboidrati funzionalizzato all'azido (Pn14TS-N3) mediante la chimica dei clic

  1. Accoppiamento
    1. Assumere 432,5 μL di proteine mutate con PrK a 57,8 μM in un microtubo da 2 mL.
    2. Aggiungere 10 μL di 5 mM Pn14TS-N321 in acqua, quindi aggiungere una premiscela di 2,5 μLdi soluzione CuSO 4 a 20 mM e 7,5 μL di THPTA a 50 mM.
      NOTA: Sintesi di Pn14TS-N3, un tetrasaccaride che imita il polisaccaride capsulare Streptococcus pneumoniae sierotipo 14, è stato descritto nel riferimento 21. Teoricamente, può essere utilizzato qualsiasi antigene di carboidrati contenente una funzione di azide.
    3. Aggiungere 25 μL di cloridrato di aminoguanidina da 100 mM.
    4. Aggiungere 25 μL di 20 mg/mL di soluzione acquosa estemporanea di ascorbato di sodio.
    5. Chiudere il tubo, mescolare invertendo più volte e incubare a RT durante 2 h.
    6. Interrompere la reazione aggiungendo 50 μL di 0,5 M EDTA.
    7. Prelevare 15 μL di campioni e analizzare tramite SDS-PAGE.
  2. Purificazione del gel di filtrazione del glicoconi coniugato
    1. Purificare il glicoconi coniugato applicandolo a una colonna di agarosio ad esclusione sterica (dimensioni del letto 15 x 600, intervallo di frazionamento 3.000-70.000), equilibrata con tampone PBS da 100 mM, pH 7,3 a un flusso di 0,8 mL/min con rilevamento a 280 nm.
    2. Raccogliere le frazioni contenenti il glicoconi coniugato.
      NOTA: Per una conservazione prolungata, dializzare il glicoconi coniugato contro 1 L di H2O due volte per 2 ore e poi durante la notte a 4 °C utilizzando la membrana di dialisi (cut-off Mw 6000-8000 Da), quindi congelare e conservare il glicoconi coniugato a -80 °C.

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Representative Results

In questo progetto è stato preparato un vaccino omogeneo glicoconi coniugato utilizzando la strategia di soppressione del codone amber stop per introdurre un UAA in un sito definito (Figura 1). L'adessina superficiale pneumoccocale A è stata selezionata come proteina portante. Questa proteina è altamente conservata ed espressa da tutti i ceppi di Streptococcus pneumoniae22. È altamente immunogenico e precedentemente utilizzato come vettore nelle formulazioni del vaccino pneumococcico21,23. Come prova di concetto, è stata studiata la propargyl-llysina UAA caricata in modo efficiente dalla coppia pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS)/tRNA dell'archea Methanosarcina mazei. La propargil-lisina è disponibile in commercio, ma può essere preparata in modo vantaggioso da Boc-L-lisina in soli due fasi sintetiche(figura 2). Un codone ambrato è stato generato in una posizione desiderata in un plasmide pET24d contenente il gene mPsaA. Questo plasmide è stato co-trasformato con un pEVOL plasmide (un dono gentile di Edward Lemke (EMBL19)contenente strumenti ortogonali necessari per incorporare la propargil-lisina, nel ceppo competente E. coli BL21(DE3). I cloni co-trasformati positivi sono stati selezionati utilizzando 25 μg/mL di kanamicina e 30 μg/mL di cloramfenicolo. Il pEVOL plasmide contiene originariamente non una ma due copie del gene codificante per MmPylRS per incorporare il residuo di propargil-lisina: la prima copia è sotto il controllo di un promotore costitutivo mentre l'espressione dell'altra è inducibile in presenza di arabinosi. Tuttavia, non abbiamo notato alcuna drastica diminuzione dell'incorporazione di propargil-lisina se il gene MmPylRS sotto il controllo del promotore costitutivo viene soppresso.

La propargil-llysina fu introdotta nella posizione 32 in sostituzione di una lsina vicino al N-terminale del PsaA. Qualsiasi residuo con una catena laterale esposta alla superficie può essere praticamente scambiato al fine di effettuare un'ulteriore coniugazione. La proteina mutata è stata prodotta nella sua forma matura (mPsaAK32PrK) con l'inclusione di una sequenza di tag cleavable a 6 istidina al suo C-terminale. L'efficienza della produzione di mPsaAK32PrK è stata controllata dall'analisi SDS-PAGE e Western Blot utilizzando un anticorpo a tag anti-istidina, quando la crescita è stata eseguita in presenza o in assenza della propargil-lisina UAA e rispetto alla produzione del tipo selvatico mPsaA (Figura 3). La visualizzazione ha rivelato una banda proteica ad un peso molecolare previsto (Corsie 4, Figura 3A e 3B). La presenza di una proteina a figura intera indica fortemente il successo dell'incorporazione del PrK in mPsaA. L'intensità è tuttavia inferiore a quella osservata per i mPsaA di tipo selvaggio (Corsie 2, Figura 3A e 3B). La perdita (cioè la produzione della proteina a figura intera senza incorporazione della UAA) e il rilascio prematuro della proteina da parte del fattore di rilascio RF1 durante la traduzione sono due principali inconvenienti frequentemente incontrati durante questo processo. Da un lato, nessuna banda al peso molecolare previsto viene visualizzato in assenza di propargil-llysina, il che significa che non si è verificata alcuna perdita (Corsie 3, Figura 3A e 3B)e ha indirettamente confermato che la banda osservata sulle corsie 4 corrisponde a mPsaAK32PrK. D'altra parte, nessuna banda può essere vista a basso peso molecolare che potrebbe corrispondere alla forma troncata di mPsaA (Corsia 4 sulla figura 3A). Il mPsaAK32PrK è stato poi purificato dalla cromatografia di affinità, con una resa tipica di 8 mg/L (rispetto a 12-20 mg/L per la proteina di tipo selvatico) e l'incorporazione del residuo di propargil-lisina è stata infine confermata dalla spettrometria di massa(figura 4). L'etichetta istidina è stata rimossa con scissione proteolitica utilizzando la proteasi TEV (Figura 4). La stabilità della mPsaAK32PrK così ottenuta è stata valutata mediante dicroismo circolare, che ha dimostrato che la struttura della proteina non era disturbata dalla mutazione della lsina 32 in una propargil-llysina (dati non mostrati).

Avendo il mPsaAK32PrK, la reattività dell'alchine per la chimica dei clic è stata valutata utilizzando una fluoresceina funzionalizzata all'azido e ulteriormente utilizzata per coniugare un antigene oligosaccaride sintetico β-2-azidoetile d-Galp-(1→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (Figura 5). Questo tetrasaccaride è correlato al polisaccaride capsulare S. pneumoniae di tipo 14 ed è stato precedentemente coniugato a mPsaA usando diverse chimiche di coniugazione8,21,24. Gli esperimenti qui sono stati fatti rispetto a mPsaA di tipo selvaggio come controllo. L'etichetta istidina è stata rimossa per la prima volta con scissione proteolitica usando la proteasi TEV. I mPsaAK32PrK e mPsaA WT digeriti sono stati quindi coniugati alla fluoroprobe (Figura 6A) o al Pn14TS ( Figura6B). La reazione è stata valutata da SDS-PAGE. Il piccolo aumento del peso molecolare del campione tra la corsia 6 e la 7 (figura 6B) indica una coniugazione riuscita con il tetrasaccaride Pn14TS. Infine, il glicoconi coniugato è stato purificato dalla filtrazione del gel e la sua identità è confermata dalla spettrometria di massa (Figura 6C). La coniugazione con la chimica dei clic è quantitativa, la maggior parte del mPsaAK32PrK è stata coniugata con il Pn14TS-N3 come illustrato dai risultati della spettrometria di massa (Figura 6C).

Figure 1
Figura 1: Incorporazione della propargil-lisina (PrK) in mPsaA durante la traduzione utilizzando una coppia pirrolisil-tRNA sintetasi/tRNA ortogonale e la riassegnazione del codone TAG25. Durante la traduzione, le sintetasi endogene catalizzano il legame tra amminoacidi e tRNA corrispondenti. Quindi, i tRNA caricati vengono utilizzati dai macchinari ribosomiali per generare il polipeptide neo-sintetizzato. Secondo la strategia di soppressione del codone di arresto ambrato, un amminoacil-tRNA sintetasi ortogonale (aaRS) (qui un pirrolisil-tRNA sintetasi da M. mazei), carica un UAA (qui PrK) sul suo tRNA imparentato che ha progettato anticodon può leggere il codone di arresto ambrato (TAG) sull'mRNA. Questo specifico riconoscimento indirizza l'incorporazione della UAA nel sito specifico sulla proteina bersaglio. Figura riprodotta da Wang etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Sintesi propargil-lsina. (A) Fasi della sintesi propargil-lsina. Inserto: Monitoraggio della deprotezione di Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH intermedio: cromatografia a strato sottile su piastre in gel di silice da 0,25 mm con indicatore fluorescente (GF254) e visualizzato mediante carbonizzazione con vanillina in acido solforico/etanolo (1,5:95 v/v); eluente: CH2Cl2/MeOH (9:1), corsia di sinistra: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH(Rf 0,90), corsia destra: propargil-lisina grezza,(Rf 0,38). 400 MHz 1H (B) e 13C NMR spettri(C) di propargil-llysina registrati in D2O. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3: Analisi dei campioni di cellule grezze. (A) Analisi SDS-PAGE e (B) Analisi western blot su campioni di cellule grezze. Corsia 1: marcatore proteico non macchiato; Corsia 2: estratto grezzo di cellule grezze di tipo selvatico mPsaA; Corsia 3: estratto di cellule grezze di mPsaAK32TAG coltivato in assenza di PrK; Corsia 4: estrazione di cellule grezze di mPsaAK32TAG coltivata in presenza di PrK. Condizioni: 12% gel di acrilammide, funzionante a 100 V, 2 h. SDS-PAGE macchiato da blu Coomassie; Western Blot ha rivelato l'uso di anticorpi anti-istidina tag e anticorpo secondario accoppiato con AlexaFluor680. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rimozione dell'etichetta di istidina e analisi della spettrometria di massa. (A) Analisi SDS-PAGE. Corsia 1: marcatore proteico non macchiato; Corsia 2: estratto di celle grezze; Corsia 3: frazione non vincolata; Corsia 4: frazione di lavaggio con imidazolo da 10 mM; Corsia 5: frazione di lavaggio con imidazolo da 20 mM; Condizioni: gel di acrilammide al 12% che funziona a 100 V per 2 ore e macchiato dal blu Coomassie; (B) Gli spettri MALDI-TOF-MS di mPsaA WT (superiore), teorico MW 33 103 Da, hanno trovato 33 106 Da e (in basso) mPsaA K32PrK, teorico 33 184 Da, trovato 33 192 Da. Le masse trovate rientrano nell'errore di margine previsto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Rappresentazione schematica della strategia di coniugazione mediante la chimica dei clic. Un singolo tetrasaccaride recante un azide è specificamente accoppiato al suo gruppo alchinico biorthogonale complementare su mPsaA K32PrK (rappresentazione mPsaA basata sul file 1PSZ PDB, con una risoluzione di 2.0 Å26). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Digestione a tag istidina e coniugazione di mPsaA con (A) fluoresceina-N3 e con (B) Pn14TS. (A) Corsie SDS-PAGE 1-3: WT mPsaA; Corsia 4-6: mPsaAK32PrK; (B) Corsia 1: marcatore proteico non macchiato; Corsia 2-4: WT mPsaA; Corsia 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg di campione/corsia proteica, 12% acrilammide, 100 V, 2 h; (C) Spettri MALDI-TOF-MS del Pn14TS-mPsaAK32PrK teorico MW 34 091 Da, trovati 34 088 Da. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra.

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Discussion

La mutagenesi site-directed è una strategia semplice per incorporare aminoacidi specifici in una posizione definita di una proteina che rimane a malapena utilizzata con l'obiettivo di preparare vaccini glicoconi coniugati7,8,14. La mutagenesi classica basata sull'approccio dei 20 amminoacidi naturali è altamente efficiente poiché non è richiesta alcuna modifica della macchina di traslazione. Le mutazioni della cisteina sono solitamente mirate ad esplorare ulteriormente la reattività tiolo unicadirettamente oin due fasi ( ad esempio , dopo la sua modifica in un intermedio della deidroalanina, una strategia chiamata mutagenesi post-traslazionale)27,28. L'espansione del codice genetico è forse ancora più attraente e flessibile poiché consente l'incorporazione diretta di una vasta gamma di UAA con diverse funzionalità9,10. Mentre diverse UAA possono essere incorporate simultaneamente all'interno di unaproteina 29, il numero di mutazioni è solitamente più limitato. Nel presente documento abbiamo applicato la relativa strategia amber stop codon per introdurre una singola propargil-lisina in una proteina portante. L'incorporazione può avvenire in qualsiasi posizione a condizione che la catena laterale dell'amminoacido iniziale sia stata esposta in superficie, un criterio facilmente determinato dalle strutture cristallografiche a raggi X o nella modellazione del silico. Inoltre, non si limita alla propargil-lisina ma può essere esteso a qualsiasi UAA funzionalizzato con una funzione biorthogonale che in seguito servirà come ancora per innestare l'antigene di carboidrati in ingresso e per il quale esiste una coppia ortogonale aaRS / tRNA.

Uno degli svantaggi della strategia è la possibile produzione di proteine troncate, risultante dal rilascio della sidechain peptidyl durante la lettura del codone di arresto ambrato, come prodotto collaterale. Anche se non abbiamo osservato alcuna forma troncata qui (probabilmente degradata dai batteri a causa delle sue dimensioni molto piccole), è stata aggiunta una etichetta di istidina a C-terminale della proteina per facilitare la purificazione della proteina mutata a figura intera prevista dalle impurità e notevolmente dalla proteina troncata (che per essenza non esprime la sequenza di tag istidina). Questo può diventare essenziale se l'incorporazione della UAA viene effettuata vicino al c-terminale proteico poiché la purificazione non può essere tentata utilizzando tecniche cromatografiche alternative come la filtrazione del gel.

Per la maggior parte delle applicazioni la rimozione del tag istidina non è obbligatoria. Tuttavia, può essere utile per quanto riguarda la progettazione del vaccino glicoconi coniugato come parte del sistema immunitario può essere deviato contro la sequenza di tag. Per questa prova di concetto, abbiamo inserito una sequenza di lunghezza degli amminoacidi specificamente scisso dalla proteasi TEV che lascia cinque amminoacidi extra sulla proteina portante dopo la digestione.

Il passaggio di coniugazione tra l'alchine della propargil-lissesina e un oligosaccaride sintetico rappresentativo Pn14TS relativo a una capsula pneumococcica e recante un azide complementare è stato effettuato secondo un protocollo di chimica dei clic riportato da Presolski et al.20 Se necessario, il completamento della reazione può essere facilmente raggiunto aumentando il tempo di reazione o modificando il rapporto tra i reagenti e i reagenti di alchine, azide e rame. I sali di rame vengono eliminati mediante trattamento con EDTA in eccesso seguito da una breve purificazione mediante cromatografia ad esclusione sterica.

Il glicoconi coniugato ottenuto con la tecnica descritta nel presente lavoro può quindi essere utilizzato per immunizzare i topi. Avere un glicoconi coniugato così completamente definito e facilmente modulato nelle mani fornisce strumenti inestimabili per valutare l'impatto della connettività portante hapten / proteina sulla risposta immunitaria8. Poiché l'aumento del rapporto hapten /proteina è spesso correlato con una maggiore risposta umoristica anti-hapten quando si utilizzano haptensbrevi 30, si potrebbe essere interessati a testare coniugati con più haptens. L'incorporazione di più UAA ha tuttavia bisogno di alcune regolazioni del protocollo in quanto l'incorporazione di una UAA nella proteina tende a diminuire la resa della produzione proteica a causa dell'attività RF1.

In definitiva, questo metodo è un potente strumento per ottenere l'accesso a vaccini omogenei glicoconi coniugati facilitandone la caratterizzazione fisico-chimica e ulteriori studi sulla relazione idrogeno/connettività portante-immunogenicità.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

E.C. riconosce con gratitudine il sostegno finanziario di La Région Pays de la Loire (Programma Pari Scientifique "BioSynProt"), in particolare una borsa di dottorato a T.V. Riconosciamo anche il Dott. Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Tolosa, Francia) per i suoi preziosi consigli tecnici.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

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Bioingegneria Numero 166 biologia sintetica glicoconi coniugato omogeneo bioconiogazione site-selective amminoacido innaturale espansione del codice genetico click-chemistry propargyl-l-lisina carboidrati
Glicoconi coniugato omogeneo prodotto dall'incorporazione combinata di aminoacidi innaturali e dalla click-chemistry a scopo vaccinale
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Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

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