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Bioengineering

सजातीय ग्लाइकोकोन्जुगेट संयुक्त अप्राकृतिक अमीनो एसिड निगमन और वैक्सीन प्रयोजनों के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा उत्पादित

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

आनुवंशिक कोड विस्तार एक परिभाषित साइट पर एक वाहक प्रोटीन पर एक biorthogonal कार्यात्मक समूह असर एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड की शुरूआत के लिए लागू किया जाता है । द्वितोथोगोनल फ़ंक्शन का उपयोग एक सजातीय ग्लाइकोकोंजुगेट वैक्सीन प्रदान करने के लिए कार्बोहाइड्रेट एंटीजन की साइट-चयनात्मक युग्मन के लिए किया जाता है।

Abstract

आनुवंशिक कोड विस्तार अपनी विशेषताओं को संशोधित करने, नए प्रोटीन कार्यों का अध्ययन करने या बनाने या प्रोटीन conjugates तक पहुंच रखने के लिए प्रोटीन में अप्राकृतिक अमीनो एसिड (यूएए) पेश करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। बंद करो codon दमन, विशेष रूप से एंबर codon दमन, परिभाषित पदों पर आनुवंशिक रूप से UAAs परिचय के लिए सबसे लोकप्रिय विधि के रूप में उभरा है । यह पद्धति यहां एक वाहक प्रोटीन की तैयारी के लिए लागू होती है जिसमें एक बायोऑर्थोगोनल कार्यात्मक समूह को शरण देने वाला यूएए होता है। इस प्रतिक्रियाशील हैंडल का उपयोग एक सजातीय ग्लाइकोकोंज्जगेट वैक्सीन प्रदान करने के लिए सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड हैप्टन को विशेष रूप से और कुशलता से भ्रष्टाचार करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल 1:1 कार्बोहाइड्रेट हैप्टन/वाहक प्रोटीन अनुपात में ग्लायकोकोंजगेट्स के संश्लेषण तक सीमित है, लेकिन द्वितोथोगोनल कार्यात्मक समूहों के कई जोड़े के लिए उत्तरदायी है। ग्लाइकोकोकोंजुगेट वैक्सीन एकरूपता पूर्ण भौतिक-रासायनिक लक्षण वर्णन सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी है, जिससे अधिक से अधिक मांग करने वाली दवा नियामक एजेंसी की सिफारिशों को संतोषजनक बनाया जा सके, एक ऐसा मापदंड जो शास्त्रीय संयोजण रणनीतियों से अपूर्ण है । इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल वास्तविक संयोजित वैक्सीन की संरचना को बारीकी से ट्यून करना संभव बनाता है, जिससे संरचना-इम्यूनोजेनिसिटी संबंधों को संबोधित करने के लिए उपकरणों को जन्म देता है।

Introduction

ग्लाइकोकोंजुगेट टीके संक्रामक रोगों के रोगनिरोधी उपचार के लिए उपलब्ध वैक्सीन शस्त्रागार के आवश्यक तत्व हैं। वे युवा शिशुओं सहित एक व्यापक आयु वर्ग में सुरक्षित, अच्छी तरह से सहन और कुशल हैं । वे मेनिंगोकोकस, न्यूमोकोकस या हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा टाइप बी1जैसे कैप्सुलेटेड बैक्टीरिया के कारण होने वाले संक्रमणों के खिलाफ इष्टतम रक्षा प्रदान करते हैं। ग्लाइकोकोकोंज्जुगेट टीके शुद्ध बैक्टीरियल पॉलीसैकराइड्स से बने होते हैं जो बैक्टीरिया या सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड्स के कैप्सूल बनाते हैं जो इन सतह-व्यक्त पॉलीसैकराइड्स2की नकल करते हैं, जो सहसंयोजक रूप से वाहक प्रोटीन से जुड़े होते हैं। कार्बोहाइड्रेट एंटीजन3द्वारा व्यक्त किए गए एंटीजेनिक निर्धारक के खिलाफ निर्देशित सुरक्षात्मक विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के लिए वाहक प्रोटीन की उपस्थिति आवश्यक है। कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के सावधानीपूर्वक चयन और उत्पादन के अलावा, ग्लाइकोकोंजुगेट वैक्सीन की प्रभावकारिता पर प्रभाव डालने के लिए जानी जाने वाली विशेषताएं हैं: वाहक प्रोटीन की प्रकृति, संजूगेशन रसायन (यदि उपयोग किया जाता है तो लिंकर की प्रकृति और लंबाई सहित), या सैकराइड/प्रोटीन अनुपात3। जाहिर है, जिन स्थितियों पर सैकराइड को प्रोटीन के साथ-साथ कनेक्टिविटी पॉइंट्स की संख्या इम्यूनोजेनिसिटी के लिए प्रासंगिक है । आज तक, इन दोनों मापदंडों का शायद ही अध्ययन किया गया हो क्योंकि ग्लायकोकोन्जगेट्स की तैयारी काफी हद तक अनुभवजन्य बनी हुई है। उनका संश्लेषण आमतौर पर वाहक प्रोटीन अनुक्रम पर मौजूद लाइसाइन या एस्पार्टिक/एस्पार्टिक एसिड साइड-चेन अवशेषों के क्रमशः माइन या कार्बोक्सिलिक एसिड कार्यों के उपयोग पर निर्भर करता है। यह एक एकल नहीं बल्कि ग्लायकोकोन्जुगेट्स के विषम मिश्रण की ओर जाता है।

प्रोटीन में अमीनो एसिड अवशेषों की प्रतिक्रियाशीलता, पहुंच या वितरण पर बजाना अधिक परिभाषित ग्लाइस्कोकोंजगेट्स को जन्म देता है जो सैकराइड/प्रोटीन कनेक्टिविटी4के प्रभाव को दस्तावेज करने के लिए अधिक विश्वसनीय हैं। इस लक्ष्य की दिशा में एक कदम आगे प्रोटीन ग्लाइकन कपलिंग तकनीक लागू करके प्राप्त किया जा सकता है, एक पुनः संयोजन प्रक्रिया जो कोशिका कारखानों5,6में नियंत्रित ग्लाइकोकोंज्जगेट टीकों के उत्पादन की अनुमति देती है। हालांकि, ग्लाइकोसिलेशन विशेष रूप से डी/EXNYS/T sequons के भीतर एक शतावरी अवशेषों पर होता है (जिससे एक्स 20 प्राकृतिक अमीनो एसिड से बाहर है), वाहक प्रोटीन पर स्वाभाविक रूप से मौजूद नहीं है ।

साइट चयनात्मक म्यूटेनेसिस और विशेष रूप से उनकी अत्यधिक और चयनात्मक प्रतिक्रियाशीलता का दोहन करने के लिए साइस्टीन का समावेश एक वैकल्पिक7,8के रूप में दिखाई देता है । वाहक प्रोटीन का उत्पादन उनके अनुक्रम में यूएए को शामिल करने से सजातीय ग्लाइकोकोजूगेट वैक्सीन तैयार करने के लिए और भी लचीलापन मिल सकता है । 100 से अधिक यूएए विकसित किए गए हैं और इसके अलावा विभिन्न प्रोटीन9,10में शामिल किए गए हैं । उनमें से कई में बायोऑर्थोगोनल कार्य होते हैं जो आमतौर पर पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों को पूरा करने के लिए उपयोग किए जाते हैं11 या बायोफिजिकल जांच12 या दवाओं13 को भ्रष्टाचार करने के लिए लेकिन जो कार्बोहाइड्रेट एंटीजन के साथ आगे के संवर्जन के लिए आदर्श हैंडल हैं। बायोटेक14 द्वारा सेल-फ्री प्रोटीन संश्लेषण15 का उपयोग करके सफल उदाहरणों का दावा किया गया है लेकिन इस रणनीति के अनुसार ग्लायकोकोन्जुगेट टीकों की तैयारी अभी भी लोकप्रिय होने का इंतजार कर रही है।

उत्परिवर्तित वाहक प्रोटीन के उत्पादन के लिए वीवो रणनीति में आवेदन के लिए एक संशोधित ट्रांसलेशनल मशीनरी की आवश्यकता होती है जिसमें एक विशिष्ट कोडन, कोडन को पहचानने वाला एक ट्रान और एक अमीनोसिल-ट्रान संश्लेषण (एएआरएस) शामिल है जो विशेष रूप से टीएनए(चित्रा 1)16पर यूएए के हस्तांतरण को उत्प्रेरित करता है। पाइरोलिसिन एम्बर स्टॉप कोडन दमन यूएए को शामिल करने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक है, विशेष रूप से प्रोपार्गिल-लिसाइन (पीआरके)17। उत्तरार्द्ध पूरी तरह से परिभाषित, सजातीय ग्लाइकोकोजगेट्स प्रदान करने के लिए एजिडो-कार्यात्मक कार्बोहाइड्रेट हैप्टेंस के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। वर्तमान पांडुलिपि में हम वर्णन करते हैं कि प्रोपआर्जिल-एल-लिसाइन को कैसे संश्लेषित किया जाए, एक यूएए एक एल्केन हैंडल ले जाता है, बैक्टीरिया में अपने अनुवाद के दौरान इसे एक लक्षित प्रोटीन में कैसे शामिल किया जाए और अंत में संशोधित प्रोटीन और क्लिक रसायन शास्त्र का उपयोग करके एक एजाइड फ़ंक्शन ले जाने वाले एक हैप्टन के बीच कैसे संवस्तन किया जाए।

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Protocol

1. यूएए का संश्लेषण: प्रोपार्गिल-लाइसिन (पीआरके)

  1. एनαका संश्लेषण-बीओसी-प्रोपार्गिल-लाइसिन18
    1. एक फ्लास्क में जलीय 1 एम नाओह (5 एमएल) और टीएचएफ (5 एमएल) के मिश्रण में 500 मिलीग्राम बीओसी-एल-Lys-OH (2.03 mmol) को भंग करें और एक सिलिकॉन पट के साथ फ्लास्क फिट करें।
    2. एक आइस बाथ में फ्लास्क को ठंडा करें और फिर सरगर्मी करते समय माइक्रोसिरिंग का उपयोग करके प्रोपार्गिल क्लोरोफॉर्मेट (1.62 mmol) ड्रॉपवाइज (2-3 मिनट की अवधि में) के 158 माइक्रोल जोड़ें।
    3. कमरे के तापमान के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण गर्म और 10 घंटे के लिए सरगर्मी जारी है ।
    4. डाईथाइल ईथर के 50 एमएल के घोल को ठंडा करें, 50 एमएल जलीय 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड और आइस बाथ में एथिल एसीटेट के 60 एमएल।
    5. एक आइस बाथ में क्रूड रिएक्शन मिश्रण को ठंडा करें और मिश्रण को एक जुदाई कीप में डालें। इस मिश्रण को 50 एमएल डायथिल ईथर के साथ निकालें। जैविक परत को त्यागें।
    6. अलगाव कीप में जलीय चरण में जलीय 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड को सावधानी से जोड़ें। फिर एथिल एसीटेट के 30 एमएल का उपयोग करके जलीय परत को दो बार निकालें। टीएलसी द्वारा कार्बनिक चरण में एन-बीओसी-प्रोपर्गिल-lysine की उपस्थिति को सत्यापित करें सीएच2 सीएल2-मेथनॉल (9:1) का उपयोग करके एल्यूएंट के रूप में।
    7. एमजीएसओ4पर संयुक्त कार्बनिक परतों को सुखाएं, ठोस चरण को फ़िल्टर करें और रोटरी वाष्पीकरण पर कम दबाव के तहत फिल्ट्रेट को केंद्रित करें।
    8. डियूटरेटेड क्लोरोफॉर्म (सीडीसीएल3)में कच्चे तेल के एन α-बीओसी-प्रोपार्गिल-लिसाइनका एक नमूना भंग करें और 1 एच एनएमआर द्वारा अपनी पहचान को नियंत्रितकरें।
      चेतावनी: निष्कर्षण दबाव का एक buildup में परिणाम हो सकता है। किसी भी दबाव buildup अक्सर जारी करें।
  2. अप्राकृतिक अमीनो एसिड प्रोपआरजील-एल-लाइसिन (पीआरके) का संश्लेषण
    1. एक पट से लैस एक गोल नीचे फ्लास्क में एन α-Boc-प्रोपआर्गाइल-lysineपरिचय ।
    2. एन α-बीओसी-प्रोपर्गिल-लिसाइनको भंग करने के लिए आर्गन के तहत फ्लास्क में निर्जल डिक्लोरोमेथेन (सीएच2सीएल2)के 4 एमएल जोड़ें।
    3. सरगर्मी करते समय सिरिंज का उपयोग करके ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड (टीएफए) ड्रॉपवाइज के 4 एमएल जोड़ें।
    4. आरटी में 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हिलाओ । सीएच2 सीएल 2-मेथनॉल(9:1) का उपयोग करके टीएलसी द्वारा प्रतिक्रिया की निगरानी करें ।
    5. कम दबाव में प्रतिक्रिया मिश्रण को केंद्रित करें।
    6. कच्चे अवशेषों में डाईथाइल ईथर जोड़ें और पीआरके को तेज करने के लिए 1 घंटे के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उच्च पैमाने पर काम करते समय, यदि पीआरके पूरी तरह से उपजी नहीं है, तो इसे तेज करने के लिए ट्रिटरेट करें और जरूरत पड़ने पर इनक्यूबेशन समय का विस्तार करें।
    7. एक फ्रिटेड-ग्लास पर एक सफेद ठोस के रूप में पीआरके को फ़िल्टर करें।
    8. डी2ओ में पीआरके का एक एलिकोट भंग करें। फिर अपनी पहचान और शुद्धता को नियंत्रित करने के लिए एनएमआर विश्लेषण करें।
    9. आगे के उपयोग के लिए, 100 mm की अंतिम एकाग्रता पर आसुत पानी में अप्राकृतिक अमीनो एसिड पीआरके को भंग करें और 1 मिलियन एलिकोट के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. पीआरके द्वारा संशोधित रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन का उत्पादन

  1. प्लाज्मिड तैयारी
    1. एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) का निर्माण करें जिसमें लक्ष्य परिपक्व न्यूमोकोकल सतह चिपकने वाला ए (एमपीएसए) जीन (pET24d-mPsa-WT) के बाद एक तंबाकू Etch वायरस (TEV) protease अनुक्रम के बाद bamHI और XhoI प्रतिबंध साइटों के बीच डालने क्लोनिंग द्वारा pET24d प्लाज्मिड । यह प्रोटीन के सी-टर्मिनस पर उनका6 टैग पेश करेगा। पारंपरिक साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस तकनीक का उपयोग करके लाइसिन-32 के कोडन को एंबर कॉडन (टैग) के साथ बदलें।
    2. एक दूसरी अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (pEVOL-MmPylRS) का निर्माण करें जिसमें मेथानोसोरीना माज़ी (एमएमपीएलआर) से पाइरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण के लिए जीन कोडिंग की दो प्रतियां और संबंधित tRNAPyr के लिए जीन कोडिंग के रूप में पहले19वर्णित है । यूएएएस के कुशल समावेश के लिए इस विशेष रूप से डिजाइन किए गए प्लाज्मिड वेक्टर, पीईओवीवी का उपयोग करें।
      नोट: विस्तृत प्लाज्मिड जानकारी पूरक फ़ाइल 1में वर्णित है ।
  2. अभिव्यक्ति तनाव में प्लाज्मिड का सह-परिवर्तन
    1. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रासायनिक रूप से सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई BL21 (DE3) का एक 100 μL aliquot गल।
    2. कोशिकाओं में प्रत्येक प्लाज्मिड (प्रत्येक के 50-100 एनजी) के 1 μL जोड़ें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    3. 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब को 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में गल सक्षम कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित करें और फिर इसे 2 मिनट के लिए बर्फ में वापस ले जाएं।
    4. एंटीबायोटिक अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मिलाते हुए एलबी माध्यम और इनक्यूबेट के 900 माइक्रोन जोड़ें। फिर एलबी एगर पर बैक्टीरिया को 25 μg/ml kanamycin और 30 μg/mL क्लोराम्फेनिकोल के साथ प्लेट करें । बैक्टीरिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें।
  3. पीआरके के साथ संशोधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति
    1. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी माध्यम के 5 एमएल में एक एकल सह-परिवर्तित कॉलोनी (कानामाइसिन के 25 μg/mL और क्लोराम्फेनिकोल के 30 μg/mL) का टीका लगाएं। मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    2. प्राथमिक संस्कृति (5 एमएल) को ऑटो-इंडक्शन माध्यम के 500 मिलीलन में पतला करें जिसमें एंटीबायोटिक्स, एल-अरेबिनोस का 0.02% और अप्राकृतिक अमीनो एसिड पीआरके का 1 m m और मिलाते हुए 24 घंटे के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। समानांतर में पीआरके के बिना संस्कृति और डब्ल्यूटी प्रोटीन युक्त क्लोन की संस्कृति का प्रदर्शन करके सकारात्मक नियंत्रण करके एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें।
    3. 500 एमएल कल्चर मीडियम में से 5 एमएल और सेंट्रलाइज में से 5,000 एक्स जीपर 10 मिनट के लिए एलिकोट । सुपरनेट को त्यागें और गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। शेष 495 एमएल से 5,000 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा फसल कोशिकाएं। सुपरनेट को त्यागें और गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  4. एसडीएस-पेज और पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा 5 एमएल संस्कृति नमूनों से क्रूड सेल अर्क का विश्लेषण करें
    1. रिस्पन 5 एमएल सेल छर्रों में 250 माइक्रोल लाइसिस बफर (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, पीएच 8, 5 mm imidazole, 0.2 m M PMSF) और इसे 1.5 ml microtube में स्थानांतरित करें।
    2. तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को ठंडा करके, इसे 42 डिग्री सेल्सियस स्नान में गलकर और 30 एस के लिए उच्च गति से भंवर से बाहर निकलता है। इस स्टेप को 3 बार दोहराएं।
    3. सेल मलबे को खत्म करने के लिए 10 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने।
    4. सुपरनेटेंट के 10 माइक्रोल लें और 5 माइक्रोन पानी और 5 माइक्रोल लोडिंग बफर (ब्रोमोफेनॉल ब्लू, एसडीएस, β-मर्केप्टोथेन) जोड़ें। नमूनों को 100 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्म करें और एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस करें।
  5. निकल-एनटीए मोतियों का उपयोग करके गुरुत्वाकर्षण प्रवाह-बेंच आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धि
    1. सेल छर्रों (495 एमएल कल्चर से) को लाइसिस बफर (50 एमएम एनए 2 एचपीओ4/एनएएच 2 पीओ4,150 एमएमएल एनएसीएल, पीएच8,5 एमएम इमिडाजोल, 0.2 एमएम पीएमएसएफ) के 20 एमएल में रीसुस्पेंड करें।
    2. निलंबन में DNase I (1 मिलीग्राम/एमएल) और लाइसोजाइम (50 मिलीग्राम/एमएल) के 500 माइक्रोन जोड़ें और 30 मिनट के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर निलंबन को इनक्यूबेटिंग करके लाइसिस की अनुमति दें।
    3. 5 मिनट के दौरान कोशिकाओं को सोनिकेट करें (5 एस-5 एस के चक्र, आयाम 50%) और फिर 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटा दें और इसके बाद 0.45 माइक्रोन फ़िल्टर पर निस्पंदन करें।
    4. निलंबन (सेल संस्कृति के 500 मिलीएल के लिए 500 माइक्रोन) में नी-एनटीए राल जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे-धीरे मिलाएं।
    5. निलंबन को पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में डालें और अनबाउंड अंश एकत्र करें।
    6. 50 एमएल एनए 2 एचपीओ 4 /एनएएच2पीओ4,150 एमएन एनएसीएल, 10 एमएम इमिडाजोल युक्त वॉशिंग बफर के 10 एमएल के साथ राल धोएं। राल को दूसरी बार वाशिंग बफर (50 mM Na2HPO 4/NaH2PO4,150mM NaCl, 20 mm imidazole) के साथ धोएं। धोने के अंश ों को इकट्ठा करें।
    7. Elute elution बफर के 1 मिलीएल के साथ अपने टैग प्रोटीन (५० mMNa 2HPO4/NaH2पीओ4,१५० mM NaCl, ३०० mm imidazole) । इस चरण को 4 बार दोहराएं और सभी एल्यूशन अंशों को इकट्ठा करें।
    8. 12% एक्रिलामाइड जेल पर एसडीएस-पेज द्वारा क्रूड के साथ-साथ 7 शुद्धिकरण अंशों का विश्लेषण करें।
    9. शुद्ध उसके टैग प्रोटीन युक्त अंशों को मिलाएं और डायलिसिस झिल्ली (कट-ऑफ मेगावाट 6000-8000 डीए) का उपयोग करके रात भर 1 एल तेवी प्रोटीज बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) के खिलाफ इसे डायलाइज़ करें। 37 360 सेमी -1 ∙एम-1और सांसदों के लिए 34.14 केडीए के आणविक वजन के साथ280 एनएम पर प्रोटीन की एकाग्रता को मापें।

3. TEV प्रोटीज पाचन द्वारा हिस्टीडीन टैग को हटाना

  1. प्रोटीन का नमूना 50 एमएल ट्यूब में ले लीजिए और 2 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर 1 एमएल तक टीईवी बफर (50 एमएम ट्राइस एचसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) जोड़ें।
    नोट: एकाग्रता पिछले परिणामों के अनुसार भिन्न हो सकती है। प्रोटीन सांद्रता है कि हम परीक्षण किया है एक ठेठ 2-3 मिलीग्राम/एमएल रेंज में हैं ।
  2. तेईवी प्रोटीज़ के 100 माइक्रोन जोड़ें (पचाने के लिए प्रोटीन के 20 माइक्रोन के लिए तेवी प्रोटीज़ की 10 इकाइयों को जोड़ें)।
  3. 0.1 एम डिइयोथरेटोल (डीटीटी) के 50 माइक्रोल जोड़ें।
  4. 5 एमएल तक टीईवी बफर (50 एमएम ट्रिस एचसीएल, 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 8) के साथ पूरा करें।
  5. धीमी गति से मिलाते हुए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि पाचन पूरा नहीं हो रहा है, तो अधिक TEV प्रोटीज जोड़ें, लंबे समय तक या 30 डिग्री सेल्सियस तक उच्च तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. फॉस्फेट बफर (50 एमएम एनए2एचपीओ 4 /एनएएच2पीओ4,150 mm NaCl, 5 mm imidazole) के खिलाफ डायलिसिस झिल्ली (कट-ऑफ 6000-8000 डीए) का उपयोग करके रात भर4डिग्री सेल्सियस पर EDTA को हटाने के लिए पचा प्रोटीन को डायलाइज करें।
  7. तेव प्रोटीज और अपाच्य प्रोटीन को खत्म करने के लिए, नी-एनटीए मोतियों के साथ मिश्रण को इनक्यूबेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए धीरे से मिलाएं।
  8. निलंबन को पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में डालें। अनबाउंड अंश को इकट्ठा करें और कॉलम को वॉशिंग बफर के 5 एमएल (50 mMNa 2HPO4/NaH2 PO4,150 mM NaCl, 10 mm imidazole) के साथ धोएं
    नोट: ब्याज का प्रोटीन अनबाउंड और धोने के अंशों में बरामद किया जाना चाहिए ।
  9. कॉलम पर एल्यूशन बफर (50 mM Na 2 HPO 4/NaH2PO4,150 mm NaCl, 300 mm इमिडाजोल) के 5 एमएल जोड़कर तेव प्रोटीज और अपाच्येटेड प्रोटीन को एल्यूट किया। 280 एनएम पर प्रोटीन सामग्री के लिए और एसडीएस-पेज विश्लेषण द्वारा अंशों की जांच करें।
  10. एक नियंत्रण के रूप में पचा प्रोटीन के साथ एक एसडीएस पृष्ठ पर पचा नमूने लोड करके पाचन की दक्षता की जांच करें।
  11. क्लिक बफर के 1 एल के खिलाफ पचा प्रोटीन को डायलाइज करें (50 mMNa 2HPO4/NaH2PO4,pH8) 4 डिग्री सेल्सियस रात में एक डायलिसिस झिल्ली (कट-ऑफ 6000-8000 दा) के साथ इमिडाजोल को हटाने के साथ-साथ बफर का आदान-प्रदान करने के लिए, और मोलर विलुप्त होने गुणांक और mPsa के आणविक वजन के साथ २८० एनएम पर प्रोटीन की एकाग्रता को मापने (३७ ३६०सेमी-1∙एम-1 और मेगावाट ३४.१४ केडीए) ।

4. अप्राकृतिक अमीनो एसिड प्रोपआर्गिल-lysine पहुंच और क्लिक रसायन विज्ञान के लिए कार्यक्षमता का आकलन

नोट: क्लिक रसायन विज्ञान केलिए प्रेसोस्की एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 6-हेक्साक्लोरो-फ्लोरोसेइन-अज़ाइड के साथ सांसदों को संयोजित करें।

  1. 2 एमएल माइक्रोट्यूब में 57.8 माइक्रोन की एकाग्रता पर पीआरके-म्यूटेड प्रोटीन का 432.5 माइक्रोन लें।
    नोट: 2 μM एल्किनेन की न्यूनतम एकाग्रता स्वीकार्य है। यदि प्रोटीन एकाग्रता कम है, तो इसे अपकेंद्रित्र सांद्रता के साथ केंद्रित करें या अज़ाइड/एल्किने मोलर अनुपात में वृद्धि करके प्रतिक्रिया के संतुलन के पक्ष में हों।
  2. 5 m 6-हेक्साक्लोरो-फ्लोरोसेइन-एजाइड के 10 माइक्रोन जोड़ें और फिर 20 एमएम (स्टॉकसमाधान सांद्रता) पर 20 एमएम और ट्रिज़ (बेंजिलट्राइजोलमेथिल) माइनमाइन (टीएच पीटीए) के 2.5 माइक्रोन का प्रीमिक्स जोड़ें।
    1. जलीय 100 m m aminoguanidine हाइड्रोक्लोराइड के 25 माइक्रोल जोड़ें।
    2. सोडियम एस्कॉर्शेट का एक आशुलभ तैयार जलीय समाधान 20 मिलीग्राम/एमएल के 25 माइक्रोन जोड़ें ।
    3. ट्यूब को बंद करें, कई बार उलटा करके मिलाएं और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. 0.5 एम EDTA के 50 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    5. रिएक्शन मिश्रण के 15 माइक्रोल लें और इसे माइक्रोट्यूब डालें, 5 माइक्रोल लोडिंग बफर (ब्रोमोफेनॉल ब्लू, एसडीएस, β-मर्केप्टोथेनॉल) डालें, मिश्रण को 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें, और फिर इसे 12% एक्रिलामाइड जेल में लोड करें। माइग्रेशन के बाद, 312 एनएम पर यूवी लाइट के तहत जेल पर फ्लोरोसेंट कंजूगेट की कल्पना करें।

5. क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा एक azido-कार्यात्मक कार्बोहाइड्रेट एंटीजन (Pn14TS-N3)के साथ सांसदों का संजीदा

  1. युग्मन
    1. 2 एमएल माइक्रोट्यूब में 57.8 माइक्रोन में पीआरके-म्यूटेड प्रोटीन का 432.5 माइक्रोन लें।
    2. पानी में 5 एमएम Pn14TS-N3 21के10 माइक्रोन जोड़ें तो 20 एमएम पर CuSO 4 समाधान के2.5 माइक्रोन का प्रीमिक्स और 50 एमएम पर थप्टा के 7.5 माइक्रोन जोड़ें।
      नोट: Pn14TS-N3,एक टेट्रासाक्चराइड का संश्लेषण, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया सेरोटाइप 14 कैप्सुलर पॉलीसैकराइड की नकल करते हुए, संदर्भ 21 में वर्णित किया गया है। सैद्धांतिक रूप से, किसी भी कार्बोहाइड्रेट एंटीजन जिसमें एक अज़ाइड फ़ंक्शन होता है, का उपयोग किया जा सकता है।
    3. 100 m m aminoguanidine हाइड्रोक्लोराइड के 25 माइक्रोल जोड़ें।
    4. सोडियम एस्कॉर्शेट के 20 मिलीग्राम/एमएल के 25 माइक्रोन को आशुल में तैयार जलीय समाधान जोड़ें ।
    5. ट्यूब को बंद करें, कई बार उलटा करके मिलाएं और 2 घंटे के दौरान आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    6. 0.5 एम EDTA के 50 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।
    7. नमूनों के 15 माइक्रोन ले लो और SDS-पेज द्वारा विश्लेषण ।
  2. ग्लायकोकोंजगेट का जेल निस्पंदन शुद्धि
    1. ग्लाइकोकोंज्यूगेट को एक स्टेरिक अपवर्जन एगरेगेट कॉलम (15 x 600 बिस्तर आयाम, 3,000-70,000 अंश सीमा) पर लागू करके शुद्ध करें), 100 एमएएम पीबीएस बफर के साथ समतुल्य, 280 एनएम पर पता लगाने के साथ 0.8 mL/मिनट प्रवाह पर पीएच 7.3।
    2. ग्लाईकोकोंजुगेट वाले अंशों को इकट्ठा करें।
      नोट: लंबे समय तक भंडारण के लिए, 2 घंटे के लिए दो बार एच 2 O के1एल के खिलाफ ग्लाइकोकोजूगेट को डायलाइज करें और फिर डायलिसिस झिल्ली (कट-ऑफ मेगावाट 6000-8000 डीए) का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर, फिर फ्रीज-ड्राई और ग्लाइकोकोन्जुगेट को -80 सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

इस परियोजना में, एक सजातीय ग्लाइकोकोंजगेट वैक्सीन को एक परिभाषित साइट(चित्रा 1)पर यूएए लागू करने के लिए एंबर स्टॉप कॉडन दमन रणनीति का उपयोग करके तैयार किया गया था। न्यूमोकोकल सतह आसंजिन ए वाहक प्रोटीन मोसिटी के रूप में चुना गया था। इस प्रोटीन को अत्यधिक संरक्षित और स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया22के सभी उपभेदों द्वारा व्यक्त किया जाता है । यह अत्यधिक इम्यूनोजेनिक है और पहले न्यूमोकोकल वैक्सीन फॉर्मूलेशन21,23में वाहक के रूप में उपयोग किया जाता था । एक सबूत के रूप में अवधारणा, UAA प्रोपर्गिल-lysine कुशलता से जंगली प्रकार pyrrolysyl-tRNA संश्लेषण (PylRS) /चापारिया मेथेनसीना mazei के tRNA जोड़ी द्वारा चार्ज की जांच की थी । प्रोपर्गिल-लिसाइन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, लेकिन केवल दो सिंथेटिक चरणों(चित्रा 2)में बीओसी-एल-लिसाइन से लाभप्रद रूप से तैयार किया जा सकता है। एक एम्बर कोडन एक pET24d प्लाज्मिड में एक वांछित स्थिति में उत्पन्न किया गया था जिसमें सांसदों का जीन होता था । इस प्लाज्मिड को एक पीईवोल प्लाज्मिड (एडवर्ड लेमके (ईएमबीएल19)से एक तरह का उपहार के साथ सह-रूपांतरित किया गया था जिसमें प्रोपर्गाइल-लिसाइन को शामिल करने के लिए आवश्यक ऑर्थोगोनल उपकरण शामिल थे, सक्षम ई. कोलाई BL21 (DE3) तनाव में। सकारात्मक सह-रूपांतरित क्लोनों का चयन 25 μg/mL kanamycin और 30 μg/एमएल क्लोराम्फेनिकोल का उपयोग करके किया गया था । प्लाज्मिड पेवोल में मूल रूप से प्रोपेगेल-लिसाइन अवशेषों को शामिल करने के लिए एमएमपीआईएलआरएस के लिए जीन कोडिंग की एक नहीं बल्कि दो प्रतियां शामिल हैं: पहली प्रति एक संविलियन प्रमोटर के नियंत्रण में है जबकि दूसरे की अभिव्यक्ति अरबिनोज की उपस्थिति में प्रेरक है। हालांकि, हमने देखा है कि प्रोप्रोजेल-लिसाइन निगमन की कोई नाटकीय कमी नहीं है यदि संविलियन प्रमोटर के नियंत्रण में एमएमपीएलआरएस जीन को दबा दिया जाता है।

प्रोपरेगाइल-लिसाइन को पीएसएए के एन-टर्मिनस के पास एक lysine के प्रतिस्थापन में स्थिति ३२ पर पेश किया गया था । सतह से उजागर साइड-चेन वाले किसी भी अवशेष को आगे की गणना करने के मद्देनजर वस्तुतः आदान-प्रदान किया जा सकता है । उत्परिवर्तित प्रोटीन अपने सी-टर्मिनस में एक क्लीवेबल 6-हिस्टिडीन टैग अनुक्रम को शामिल करने के साथ अपने परिपक्व रूप (mPsaK32PrK)में उत्पादित किया गया था । सांसदों की दक्षताKSA K32PrK उत्पादन की दक्षता एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा एक एंटी-हिस्टिडीन टैग एंटीबॉडी का उपयोग करके जांच की गई थी, जब विकास यूएए प्रोप्रोअरजील-लिसाइन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में किया गया था और जंगली प्रकार के सांसदों के उत्पादन की तुलना में(चित्रा 3)। विज़ुअलाइज़ेशन ने एक अपेक्षित आणविक वजन (लेन 4, चित्रा 3ए और3बी)पर एक प्रोटीन बैंड का पता चला। एक पूर्ण लंबाई प्रोटीन की उपस्थिति दृढ़ता से एमपीएएसए में पीआरके के सफल समावेश को इंगित करती है। हालांकि, तीव्रता जंगली प्रकार के सांसदों (लेन 2, चित्रा 3ए और3बी)के लिए देखी गई तुलना में कम है। रिसाव (यानी, यूएए के समावेश के बिना पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का उत्पादन) और अनुवाद के दौरान रिलीज फैक्टर आरएफ1 द्वारा प्रोटीन की समय से पहले रिहाई इस प्रक्रिया के दौरान अक्सर सामने आने वाली दो मुख्य कमियां हैं। एक तरफ, अपेक्षित आणविक वजन पर कोई बैंड प्रोपार्गिल-लिसाइन की अनुपस्थिति में कल्पना नहीं की जाती है जिसका अर्थ है कि कोई रिसाव नहीं हुआ (लेन 3, चित्रा 3और 3बी)और अप्रत्यक्ष रूप से पुष्टि की गई कि लेन 4 पर मनाया गया बैंड सांसदों काK32PrKसे मेल खाता है। दूसरी ओर, कोई बैंड कम आणविक वजन पर नहीं देखा जा सकता है जो एमपीएसएए (चित्र 3एपर लेन 4) के कटे हुए रूप के अनुरूप हो सकता है। इसके बाद सांसदों काK32PrK आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया गया था, जिसमें 8 मिलीग्राम/एल की विशिष्ट उपज (जंगली प्रकार के प्रोटीन के लिए 12-20 मिलीग्राम/एल की तुलना में) और प्रोपर्गिल-लिसिन अवशेषों के समावेश की पुष्टि अंततः मास स्पेक्ट्रोमेट्री(चित्रा 4)द्वारा की गई थी । तेव प्रोटीज(चित्र 4)का उपयोग करके प्रोटियोलिटिक क्लीवेज पर हिस्टिडीन टैग हटा दिया गया था। इस प्रकार प्राप्त सांसदों की स्थिरता का आकलन परिपत्र डिक्रोमिज्म द्वारा किया गया था, जिससे पता चला कि प्रोटीन की संरचना लिसिन 32 के उत्परिवर्तन से एक प्रोपर्गिल-लिसाइन (डेटा नहीं दिखाए गए) में परेशान नहीं थी।

सांसदों केहोने केबाद, क्लिक रसायन विज्ञान के लिए alkyne की प्रतिक्रियाशीलता एक azido-कार्यात्मक फ्लोरोसेइन का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था और आगे एक सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड एंटीजन β-2-azidoethyl डी-Galp-(1→4) - β-डी-जीएलसीपी- (1→6) - [β-डी-गैलप-(1→4)]-β-डी-जीएलसीपीएनैक (Pn14TS)(चित्रा 5)। यह टेट्रासकैचराइड एस निमोनिया टाइप 14 कैप्सुलर पॉलीसैकराइड से संबंधित है और पहले विभिन्न संयुग्मरसायनों 8,21 ,24का उपयोग करके सांसदों को संयोजित किया गया है । यहां प्रयोग एक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार के सांसदों की तुलना में किया गया । हिस्टिडीन टैग को सबसे पहले तेवी प्रोटीज का उपयोग करके प्रोटियोलिटिक क्लीवेज पर हटा दिया गया था। पचा सांसदोंAK32PrK और mpsa WT तो फ्लोरोप्रोब(चित्रा 6ए)या Pn14TS(चित्रा 6बी)के लिए संयुग्मित किया गया । प्रतिक्रिया का आकलन एसडीएस-पेज द्वारा किया गया था । लेन 6 और 7(चित्रा6बी)के बीच नमूने के आणविक वजन में छोटी वृद्धि टेट्रासकैराइड पीएन14टी के साथ एक सफल संवत् को इंगित करती है। अंत में, ग्लाइकोकोन्जुगेट को जेल निस्पंदन द्वारा शुद्ध किया गया था और इसकी पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री(चित्र 6सी)द्वारा पुष्टि की गई थी। क्लिक करें रसायन विज्ञान द्वारा संयुग्मण में अधिकांश सांसदों काK32PrK Pn14TS-N3 के साथ संयुग्मित किया गया था जैसा कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों(चित्रा 6सी)द्वारा दर्शाया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एक ऑर्थोगोनल पाइरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण/tRNA जोड़ी और टैग कोडन रीअसाइनमेंट25का उपयोग कर अनुवाद के दौरान सांसदों में प्रोपार्गिल-lysine (पीआरके) का समावेश । अनुवाद के दौरान, एंडोजेनस संश्लेषण अमीनो एसिड और इसी ट्रानोस के बीच की कड़ी को उत्प्रेरित करता है। फिर, लोडेड ट्रान्स का उपयोग रिबोसोमल मशीनरी द्वारा नव संश्लेषित पॉलीपेप्टाइड उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। एंबर स्टॉप कॉडन दमन रणनीति के अनुसार, एक ऑर्थोगोनल अमीनोसिल-टर्ना संश्लेषण (एएआरएस) (इसके साथ एम माज़ेईसे एक पायरोलिसिल-टीआरएनए संश्लेषण), अपने कॉग्नेट टर्ना पर एक यूएए (इस्त्नेस पीआरके) लोड करता है जो एंटीकोडन डिजाइन किया गया था, जो एमआरएएनए पर एंबर स्टॉप कॉडन (टैग) पढ़ सकता है। यह विशिष्ट मान्यता लक्ष्य प्रोटीन पर विशिष्ट साइट में यूएए के समावेश का निर्देश देती है। चित्रा वांग एट अल से पुन: पेश किया ।25। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रोपार्गिल-लाइसिन संश्लेषण। (A)प्रोपार्गिल-लाइसिन संश्लेषण के चरण। डालें: बीओसी-एल-लिस (प्रोप-2-ynyloxycarbonyl) के असुरक्षा की निगरानी-ओह मध्यवर्ती: फ्लोरोसेंट इंडिकेटर (GF254) के साथ ०.२५ मिमी सिलिका जेल प्लेटों पर पतली परत क्रोमेटोग्राफी और सल्फ्यूरिक एसिड/इथेनॉल (1.5:95 v/v) में वेनिलिन के साथ चारने से कल्पना की गई । eluent: CH2सीएल2/MeOH(9:1), बाईं लेन: Boc-l-Lys (सहारा-2-ynyloxycarbonyl)-ओह(आरएफ ०.९०), सही लेन: क्रूड प्रोपरजील-lysine,(आरएफ ०.३८) । 400 मेगाहर्ट्ज 1एच(बी)और 13सी एनएमआर स्पेक्ट्रा(सी)प्रोपार्गिल-लिसाइन का डी2ओ में दर्ज किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: कच्चे सेल के नमूनों का विश्लेषण। (ए)एसडीएस-पेज एनालिसिस और(बी)क्रूड सेल नमूनों पर वेस्टर्न ब्लॉट एनालिसिस । लेन 1: अन दाग प्रोटीन मार्कर; लेन 2: जंगली प्रकार के सांसदों के क्रूड सेल निकालने; लेन 3: पीआरके की अनुपस्थिति में उगाए गए mPsaK32TAG के क्रूड सेल अर्क; लेन 4: पीआरके की उपस्थिति में उगाए गए mPsaK32TAG के क्रूड सेल निष्कर्षण की स्थिति: 12% एक्रिलामाइड जेल, १०० वी, 2 घंटे SDS-कूमासी ब्लू द्वारा दाग पृष्ठ पर चल रहा है; पश्चिमी दाग ने एलेक्साफ्लूर680 के साथ मिलकर एंटी-हिस्टिडीन टैग एंटीबॉडी और सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग करके खुलासा किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: हस्टिडीन टैग हटाने और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। (A)SDS-PAGE विश्लेषण। लेन 1: अन दाग प्रोटीन मार्कर; लेन 2: क्रूड सेल निकालने; लेन 3: अनबाउंड अंश; लेन 4: 10 mM इमिडाजोल के साथ अंश धोने; लेन 5: 20 mm इमिडाजोल के साथ अंश धोने; स्थितियां: 12% एक्रिलैमाइड जेल 2 घंटे के लिए 100 वी पर चल रहा है, और कूमासी ब्लू द्वारा दाग; (ख)मालडी-टीईएफ-एमएस स्पेक्ट्रा ऑफ (टॉप) सांसदPsa WT, सैद्धांतिक मेगावाट ३३ १०३ डीए, पाया ३३ १०६ डीए और (नीचे) सांसदPsa K32PrK, सैद्धांतिक ३३ १८४ डीए, ३३ १९२ डीए पाया । पाया जनता की उंमीद मार्जिन त्रुटि के भीतर हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा संयोजित रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक एज़ाइड वाले एक एकल टेट्रासकैचराइड को विशेष रूप से सांसदों के K32PrK (1PSZ पीडीबी फ़ाइल के आधार पर सांसदों का प्रतिनिधित्व, 2.0 Å26)पर अपने पूरक बिओर्टोगोनल एल्किन समूह के साथ जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: Histidine टैग पाचन और (ए) फ्लोरोसेइन-एन3 और (बी) Pn14TS के साथ सांसदों के conjugation । (A)SDS-PAGE लेन 1-3: WT mPsaa; लेन 4-6: mPsaAK32PrK; (ख)लेन 1: अन दाग प्रोटीन मार्कर; लेन 2-4: WT mPsaA; लेन 5-7: mPsaAK32PrK। 2 माइक्रोन प्रोटीन नमूना/लेन, 12% एक्रिलामाइड, १०० वी, 2 घंटे; (C)MALDI-TOF-Pn14TS के एमएस एमएस स्पेक्ट्रा-mPsaK32PrK सैद्धांतिक मेगावाट ३४ ०९१ डीए पाया, ३४ ०८८ डीए पाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

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Discussion

साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस प्रोटीन की एक परिभाषित स्थिति पर विशिष्ट अमीनो एसिड को शामिल करने की एक सीधी रणनीति है जो ग्लाइस्कोकोंजुगेटटीके7, 8, 14तैयार करने के उद्देश्य से बमुश्किल उपयोग कियाजाताहै। 20 प्राकृतिक अमीनो एसिड दृष्टिकोण पर आधारित शास्त्रीय म्यूटेगेनेसिस अत्यधिक कुशल है क्योंकि अनुवाद मशीनरी के कोई संशोधन की आवश्यकता नहीं है। सिस्टीन म्यूटेशन को आमतौर पर सीधे या दो चरणों में अद्वितीय थिओल प्रतिक्रियाशीलता का पता लगाने के लिए लक्षित कियाजाता है (उदाहरण के लिए,एक dehydroalanine मध्यवर्ती में संशोधन के बाद, एक रणनीति जिसे पोस्ट-ट्रांसलेशनल म्यूटेनेसिस कहा जाता है)27,28। आनुवांशिक संहिता का विस्तार शायद और भी आकर्षक और लचीला है क्योंकि यह विविध कार्यक्षमताओं के साथ यूएए की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रत्यक्ष समावेश की अनुमति देता है9,10. जबकि कई यूएए को प्रोटीन29के भीतर एक साथ शामिल किया जा सकता है, म्यूटेशन की संख्या आमतौर पर अधिक सीमित होती है। हमने इसके साथ ही वाहक प्रोटीन में एक ही प्रोपर्गिल-लिसाइन पेश करने के लिए संबंधित एम्बर स्टॉप कोडन रणनीति लागू की। निगमन किसी भी स्थिति में हो सकता है बशर्ते प्रारंभिक अमीनो एसिड का साइडचेन सतह-उजागर हो, एक्स-रे क्रिस्टलीय संरचनाओं से या सिलिको मॉडलिंग में आसानी से निर्धारित एक मापदंड। इसके अलावा, यह प्रोपर्गिल-lysine तक ही सीमित नहीं है, लेकिन एक biorthogonal समारोह के साथ कार्यात्मक किसी भी UAA के लिए बढ़ाया जा सकता है जो बाद में आने वाले कार्बोहाइड्रेट एंटीजन भ्रष्टाचार के लिए एक लंगर के रूप में काम करेगा और जिसके लिए एक ऑर्थोगोनल aaRS/tRNA जोड़ी मौजूद है ।

रणनीति की कमियों में से एक छोटा प्रोटीन का संभावित उत्पादन है, जिसके परिणामस्वरूप एक साइड-उत्पाद के रूप में एंबर स्टॉप कोडन पढ़ते समय पेप्टिडिल साइडचेन की रिहाई होती है। यहां तक कि अगर हमने यहां किसी भी कटे हुए रूप का पालन नहीं किया (शायद बैक्टीरिया द्वारा बहुत छोटे आकार के कारण अवक्रमित), प्रोटीन के सी-टर्मिनस में एक हिस्टिडीन टैग जोड़ा गया है ताकि अशुद्धियों से अपेक्षित पूर्ण लंबाई उत्परिवर्तित प्रोटीन के शुद्धिकरण को सुविधाजनक बनाया जा सके और कटफेटेड प्रोटीन से काफ़ी रूप से छोटा प्रोटीन (जो सार द्वारा हिस्टीडीन टैग अनुक्रम व्यक्त नहीं करता है)। यह आवश्यक हो सकता है यदि यूएए निगमन प्रोटीन सी-टर्मिनस के पास किया जाता है क्योंकि शुद्धिकरण को जेल निस्पंदन जैसी वैकल्पिक क्रोमेटोग्राफी तकनीकों का उपयोग करके प्रयास नहीं किया जा सकता है।

अधिकांश आवेदनों के लिए हिटिडीन टैग को हटाना अनिवार्य नहीं है। हालांकि, यह प्रतिरक्षा प्रणाली के हिस्से के रूप में ग्लाइटोकोंजुगेट वैक्सीन के डिजाइन के बारे में उपयोगी हो सकता है टैग अनुक्रम के खिलाफ मोड़ा जा सकता है। इस प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट के लिए, हमने एक अमीनो एसिड लेंथ सीक्वेंस डाला जो विशेष रूप से तेवी प्रोटीज द्वारा क्लीव किया गया है जो पाचन के बाद वाहक प्रोटीन पर पांच अतिरिक्त अमीनो एसिड छोड़ता है।

प्रेसोल्कल एट अल द्वारा रिपोर्ट किए गए एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रोटोकॉल के अनुसार प्रॉपर्गिल-लिसिन के एल्किने और एक प्रतिनिधि सिंथेटिक ओलिगोसैकराइड Pn4TS के बीच संजीदब कदम और पूरक अजीमाइड का असर एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।20 अगर जरूरी हो, तो रिएक्शन टाइम बढ़ाकर या एल्किन, एजाइड और कॉपर रिएक्टेंट और रिएजेंट्स के बीच के अनुपात को संशोधित करके रिएक्शन को आसानी से पूरा किया जा सकता है। कॉपर साल्ट को अतिरिक्त ईडीटीए के साथ उपचार द्वारा समाप्त किया जाता है जिसके बाद स्टीरिक अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी द्वारा एक छोटी शुद्धि होती है।

वर्तमान काम में वर्णित तकनीक के साथ प्राप्त ग्लाकोकोंजूगेट का उपयोग चूहों को प्रतिरक्षित करने के लिए किया जा सकता है। हाथों में इस तरह के पूरी तरह से परिभाषित और आसानी से संग्राहक ग्लायकोकोंजगेट होने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया8पर हैप्टन/प्रोटीन वाहक कनेक्टिविटी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करता है । चूंकि हैप्टेन/प्रोटीन अनुपात में वृद्धि अक्सर कम हैप्टेंस30का उपयोग करते समय बढ़ी हुई एंटी-हैप्टन ह्यूमरल प्रतिक्रिया के साथ सहसंबद्ध होती है, इसलिए कोई भी कई हैप्टेंस के साथ संयुग्मित परीक्षण में रुचि हो सकती है । कई यूएए के समावेश को हालांकि प्रोटोकॉल के कुछ समायोजनों की आवश्यकता होती है क्योंकि प्रोटीन में यूएए का समावेश आरएफ1 गतिविधि के कारण प्रोटीन उत्पादन की उपज को कम करता है।

निश्चित रूप से, यह विधि सजातीय ग्लाइकोकोजूगेट टीकों तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो उनके भौतिक-रासायनिक लक्षण वर्णन और आगे कार्बोहाइड्रेट एंटीजन/कैरियर कनेक्टिविटी-इम्यूनोजेनिसिटी रिलेशनशिप स्टडीज को सुविधाजनक बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ई.C कृतज्ञता ला रेगियन पेज़ डे ला लॉयर (परी Scientifique कार्यक्रम "BioSynProt"), विशेष रूप से टीवी के लिए एक डॉक्टरेट फैलोशिप से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । हम डॉ रॉबर्ट बी क्वास्ट (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, टूलूज़, फ्रांस) को भी अपनी बहुमूल्य तकनीकी सलाहों के लिए स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

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References

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Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

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