Summary
Genetisk kodexpansion tillämpas för införande av en onaturlig aminosyra som bär en biortsfunktionell grupp på ett bärarprotein på ett definierat ställe. Biorthogonalfunktionen används vidare för den platsselektiva kopplingen av ett kolhydratantigen för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin.
Abstract
Genetisk kodexpansion är ett kraftfullt verktyg för att introducera onaturliga aminosyror (UAA) i proteiner för att ändra sina egenskaper, att studera eller skapa nya proteinfunktioner eller för att få tillgång till proteinkonjuger. Stoppa kodondämpning, i synnerhet bärnstensfärgad kodondämpning, har dykt upp som den mest populära metoden för att genetiskt introducera UAAs vid definierade positioner. Denna metod är häri tillämpas på framställning av en bärare protein som innehåller en UAA hyser en bioorthogonal funktionell grupp. Detta reaktiva handtag kan nästa användas för att specifikt och effektivt ympa en syntetisk oligosackarid hapten för att ge ett homogent glykokonjugatvaccin. Protokollet är begränsad till syntesen av glykokonjugat i en 1:1 kolhydrater hapten/carrier protein förhållandet men mottagliga för ett flertal par av biorthogonal funktionella grupper. Glycococonjugate vaccin homogenitet är ett viktigt kriterium för att säkerställa fullständig fysikalisk-kemisk karakterisering, därmed uppfyller fler och mer krävande läkemedel tillsynsmyndigheten rekommendationer, ett kriterium som inte uppfylls av klassisk konjugation strategier. Dessutom gör detta protokoll det möjligt att finjustera strukturen på det faktiska konjugatvaccinet, vilket ger upphov till verktyg för att ta itu med struktur-immunogenicitetsrelationer.
Introduction
Glykokonjugatvaccin är väsentliga delar av vaccinarsenalen som finns för profylaktisk behandling av infektionssjukdomar. De är säkra, väl tolererade och effektiva i en bred åldersgrupp inklusive unga spädbarn. De ger det optimala försvaret mot infektioner orsakade av capsulated bakterier som meningokocker, pneumococcus eller Haemophilus influenzae typ b1. Glykokonjugatvaccin är tillverkade av renat bakteriella polysackarider som bildar kapslarna av bakterier eller syntetiska oligosackarider som efterliknar dessa yttexade polysackarider2, som är kovalent kopplade till ett bärarprotein. Förekomsten av ett bärare protein är avgörande för att främja skyddande humorala immunsvar riktade mot den antigena determinanten uttryckt av kolhydratanterna3. Bortsett från ett noggrant urval och produktion av kolhydratantigenen, är de funktioner som är kända för att utöva ett inflytande på effekten av ett glykopkonjugatvaccin: arten av bärarproteinet, konjugationskemin (inklusive arten och längden på länkaren om den används), eller saccharid-/proteinförhållandet3. Uppenbarligen är de positioner där sackarden är konjugerad till proteinet samt antalet anslutningspunkter relevanta för immunogenicitet. Hittills har dessa två parametrar knappast studerats eftersom beredningen av glykokonjugaterna förblir till stor del empirisk. Deras syntes bygger vanligtvis på användning av amin eller karboxylsyra funktioner av, respektive, lysin eller apartic / glutaminsyra side-chain rester som finns på bärare proteinsekvens. Detta leder inte till en enda utan till en heterogen blandning av glykokonjugat.
Att spela på reaktiviteten, tillgängligheten eller fördelningen av aminosyraresterna i proteinet ger upphov till mer definierade glykkonjugat som är mer tillförlitliga för att dokumentera effekten av saccharid/proteinanslutning4. Ett steg framåt mot detta mål kan uppnås genom att tillämpa protein glycan kopplingsteknik, en rekombinant process som möjliggör produktion av kontrollerade glykokonjugat vacciner i cell fabriker5,6. Glykosylering sker dock uteslutande vid en asparaginrester inom D/EXNYS/T sequons (varvid X är någon av de 20 naturliga aminosyrorna), inte naturligt närvarande på bärarproteinerna.
Site selektiv mutagenes och i synnerhet införlivande av cysteiner att utnyttja deras mycket och selektiv reaktivitet visas som ett alternativ7,8. Produktion av bärarproteiner som innehåller UAAs i deras sekvens kan erbjuda ännu mer flexibilitet för homogen glykolkonjugat vaccinpreparation. Mer än 100 UAAs har utvecklats och ytterligare införlivas i olika proteiner9,10. Många av dem innehåller bioorthogonal funktioner som vanligtvis används för att utföra efter translationella ändringar11 eller att ympa biofysiska sonder12 eller läkemedel13 men som är idealiska handtag för ytterligare konjugation med kolhydrater antigener. Framgångsrika exempel har hävdats av Biotech14 med hjälp av cellfriproteinsyntes 15 men beredning av glykokonjugat vacciner enligt denna strategi väntar fortfarande på att bli populariserade.
Tillämpning av in vivo-strategin för framställning av muterat bärarprotein behöver en modifierad translationell maskinpark som innefattar ett specifikt kodon, ett tRNA som känner igen kodon och en aminoacyl-tRNA-synthetase (aaRS) som specifikt katalyserar överföringen av UAA på tRNA (Figur 1)16. Den pyrrolysin bärnsten stop kodon dämpning är en av de mest använda metoderna för att införliva UAA, i synnerhet propargyl-lysin (PrK)17. Den senare kan i sin tur reagera med azido-functionalized kolhydrater haptens att ge fullt definierade, homogena glykokonjugat. I det föreliggande manuskriptet beskriver vi hur man syntetisera propargyl-L-lysin, en UAA som bär ett alkynehandtag, hur man införlivar det i ett målprotein under dess översättning i en bakterie och slutligen hur man utför konjugation mellan det modifierade proteinet och en hapten som bär en azidefunktion med hjälp av klickkemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av UAAEN: propargyl-lysin (PrK)
- Syntes av Nα-Boc-propargyl-lysin18
- Lös 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) i en blandning av vattenhaltig 1 M NaOH (5 mL) och THF (5 mL) i en kolv och passa kolven med ett kiselsepum.
- Kyl kolven i ett isbad och tillsätt sedan 158 μL propargylkloroformat (1,62 mmol) droppvis (under en 2-3 min period) med hjälp av en mikrosyring under omrörning.
- Värm reaktionsblandningen till rumstemperatur och fortsätt omrörningen i 10 h.
- Kyl ner lösningar på 50 mL av diethyleter, 50 mL vattenhaltig 1 M saltsyra och 60 mL etylacetat i ett isbad.
- Kyl den råa reaktionsblandningen i ett isbad och häll blandningen i en separationstratt. Extrahera blandningen med 50 mL av diethyleter. Kassera det organiska lagret.
- Försiktigt tillsätt vattenhaltig 1 M saltsyra till vattenfasen i separationstratten. Extrahera sedan vattenskiktet två gånger med 30 mL etylacetat. Verifiera förekomsten av N-Boc-propargyl-lysin i den organiska fasen genom TLC med hjälp av CH2Cl2-metanol (9:1) som eluent.
- Torka de kombinerade organiska lagren över MgSO4, filtrera bort den fasta fasen och koncentrera filtratet under minskat tryck på en roterande förångare.
- Lös upp ett prov av den råoljeolja Nα-Boc-propargyl-lysin i deutererad kloroform (CDCl3) och kontrollera dess identitet med 1H NMR.
FÖRSIKTIGHET: Utvinning kan resultera i en ansamling av tryck. Släpp ut eventuellt tryckuppbyggnad ofta.
- Syntes av den onaturliga aminosyran propargyl-L-lysin (PrK)
- Introducera Nα-Boc-propargyl-lysin i en rund bottenkolv utrustad med ett septum.
- Tillsätt 4 mL vattenfri diklormetan (CH2Cl2) till kolven under argon för att lösa upp Nα-Boc-propargyl-lysin.
- Tillsätt 4 mL trifluoroättiksyra (TFA) droppvis med hjälp av en spruta under omrörning.
- Rör om reaktionsblandningen i 1 h vid RT. Övervaka reaktionen genom TLC med hjälp av CH2Cl2-metanol (9:1) som eluent.
- Koncentrera reaktionsblandningen under minskat tryck.
- Tillsätt diethyleter till råresterna och inkubera den vid 4 °C i 1 h för att fälla ut PrK. Vid arbete i högre skala, om PrK inte är helt utfälld, triturtera till fällning det och förlänga inkubationstiden om det behövs.
- Filtrera PrK i form av en vit fast på en fritted-glas.
- Lös upp en alikvot av PrK i D2O. Sedan utföra NMR analyser för att kontrollera dess identitet och renhet.
- För vidare användning, lös den onaturliga aminosyran PrK i destillerat vatten vid en slutkoncentration på 100 mM och förvara vid -20 °C som 1 mL alikvoter.
2. Produktion av det rekombinanta proteinet som modifierats av PrK
- Plasmid beredning
- Konstruera ett uttryck plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) som innehåller målet mogna Pneumokock yta adhesin A (mPsaA) gen (pET24d-mPsaA-WT) följt av en TEV-proteassekvens (Tobacco Etch Virus) genom kloning av skäret mellan bamhi- och Xhoi-begränsningsställena för pET24d plasmid. Detta kommer att införa enHans 6 tag på C-ändstationen av proteinet. Ersätt kodon av lysin-32 med bärnstensfärgad kodon (TAG), med konventionell plats-riktad mutagenesis teknik.
- Konstruera ett andra uttryck plasmid (pEVOL-MmPylRS) som innehåller två kopior av genen kodning för pyrrolysyl-tRNA synthetase från Methanosarcina mazei (MmPylRS) och den gen som kodar för motsvarande tRNAPyr som tidigarebeskrivits 19. Använd denna specialdesignade plasmidvektor, pEVOL, för effektiv införlivande av UAAs.
OBS: Den detaljerade plasmids informationen beskrivs i Supplemental File 1.
- Co-transformation av plasmider till uttrycket stam
- Tina en 100 μL alikvot av kemiskt kompetent Escherichia coli BL21(DE3) på is i 5 min.
- Tillsätt 1 μL av varje plasmid (50-100 ng av varje) i cellerna och inkubera i 30 min på is.
- Överför mikroröret på 1,5 mL med de tinade kompetenta cellerna i en inkubator vid 42 °C i 45 s och flytta sedan tillbaka det till is i 2 min.
- Tillsätt 900 μL LB-medium och inkubera under skakning i 1 h vid 37 °C för att tillåta antibiotikauttryck. Platta sedan bakterierna på LB-agar med 25 μg/mL kanamycin och 30 μg/mL kloramfenikol. Tillåt bakterietillväxt över natten vid 37 °C.
- Uttryck av proteiner som modifieras med PrK
- Inokulera en enda co-transformed koloni i 5 mL lb medium med antibiotika (25 μg/mL av kanamycin och 30 μg/mL av kloramfenikol). Inkubera över natten vid 37 °C med skakningar.
- Späd primärkulturen (5 mL) till 500 mL av autoinktionsmedium innehållande antibiotika, 0,02% av L-arabinos och 1 mM av den onaturliga aminosyran PrK och inkubera den vid 37 °C i 24 h med skakningar. Inkludera en negativ kontroll genom att utföra kulturen utan PrK parallellt och en positiv kontroll genom att utföra kulturen hos en klon som innehåller wt-proteinet.
- Aliquot 5 mL av 500 mL odlingsmedium och centrifug i 10 min vid 5 000 x g. Kassera supernatanten och frys pelleten vid -20 °C. Skörda celler från resterande 495 mL genom centrifugering under 10 min vid 5 000 x g. Kassera supernatanten och frys pelleten vid -20 °C.
- Analysera råcellsextrakt från 5 mL-odlingsproverna genom SDS-PAGE och western Blot-analys
- Resuspend 5 mL cell pellets till 250 μL av lysbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) och överföra den till en 1,5 mL microtube.
- Lyseceller genom att frysa rören i flytande kväve, tina upp det i ett 42 °C-bad och vortexa i hög hastighet under 30 s. Upprepa detta steg 3 gånger.
- Centrifugera prover på 17,000 x g i 10 min för att eliminera cellskräp.
- Ta 10 μL av supernatanten och tillsätt 5 μL vatten och 5 μL lastbuffert (bromophenolblått, SDS, β-merkaptoetanol). Värm proverna i 5 min vid 100 °C och utför SDS-PAGE och västra Blot-analyser.
- Proteinrening genom gravitationsflödes-bänk affinitetskromatografi med hjälp av Nickel-NTA-pärlor
- Resuspend cellen pellets (från 495 mL kultur) till 20 mL av lys buffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF).
- Tillsätt 5 μL DNase I (1 mg/mL) och 500 μL lysozym (50 mg/mL) i suspensionen och låt lys genom inkubering av suspensionen vid 37 °C under 30 min.
- Sonikera cellerna under 5 min (cykler av 5 s-5 s, amplitud 50%) och ta sedan bort cellskräpet genom centrifugeringen vid 20 000 x g i 30 min följt av filtrering på 0,45 μm-filter.
- Tillsätt Ni-NTA-harts till suspensionen (500 μL för 500 mL cellodling) och blanda försiktigt vid 4 °C i 1 h.
- Häll suspensionen i en polypropenkolonn och samla upp den obundna fraktionen.
- Tvätta hartset med 10 mL tvättbuffert innehållande 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol. Tvätta hartset en andra gång med 5 mL tvättbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole). Samla tvättfraktionerna.
- Elute det hans-taggade proteinet med 1 mL elueringsbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole). Upprepa detta steg 4 gånger och samla alla elution fraktioner.
- Analysera rå lysate samt 7 rening fraktioner av SDS-PAGE på en 12% akrylamid gel.
- Kombinera de fraktioner som innehåller rent His-taggat protein och dialysera det mot 1 L av TEV proteasbuffert (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) över natten genom att använda ett dialysmembran (cut-off MW 6000-8000 Da). Mät proteinkoncentrationen vid 280 nm med en molarutdöendekoefficient på 37 360 cm-1∙M-1 och en molekylvikt på 34,14 kDa för mPsaA.
3. Avlägsnande av histidin taggen genom TEV proteas matsmältning
- Samla in proteinprovet i ett 50 mL-rör och tillsätt TEV-buffert (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) upp till 1 mL vid en koncentration av 2 mg/mL.
OBS: Koncentrationen kan variera enligt tidigare resultat. Proteinkoncentrationer som vi har testat är i ett typiskt 2-3 mg/mL-intervall. - Tillsätt 100 μL TEV proteas (tillsätt 1 μL innehållande 10 enheter TEV proteas för 20 μg protein att smälta).
- Tillsätt 50 μL på 0,1 M dithiothreitol (DTT).
- Komplett med TEV buffert (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) upp till 5 mL.
- Inkubera över natten vid 4 °C med långsam skakning.
OBS: Om matsmältningen inte är fullständig, tillsätt mer TEV-proteas, inkubera längre tid eller vid högre temperatur upp till 30 °C. - Dialys det rötade proteinet för att avlägsna EDTA vid 4 °C över natten genom att använda ett dialysmembran (cut-off 6000-8000 Da) mot fosfatbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
- För att eliminera TEV-proteasen och det osmälta proteinet, inkubera blandningen med Ni-NTA-pärlor och blanda försiktigt i 1 h vid 4 °C.
- Häll suspensionen i en polypropenkolonn. Samla upp den obundna fraktionen och tvätta kolonnen med 5 mL av tvättbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
OBS: Proteinet av intresse bör återvinnas i de obundna och tvättfraktioner. - Elute TEV-proteasen och det osmälta proteinet genom att tillsätta 5 mL elueringsbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) på kolonnen. Kontrollera bråken för proteininnehåll vid 280 nm och genom SDS-PAGE analys.
- Kontrollera effektiviteten i matsmältningen genom att ladda uppssmälta prover på en SDS-SIDA med det osmälta proteinet som kontroll.
- Dialys det rötade proteinet mot 1 L av klickbuffert (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) vid 4 °C över natten med dialysmembran (cut-off 6000-8000 Da) för att ta bort imidazol samt för att utbyta bufferten, och mät proteinkoncentrationen vid 280 nm med molarutdöende koefficient och molekylvikt av mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 och MW 34,14 kDa).
4. Bedömning av den onaturliga aminosyran propargyl-lysin tillgänglighet och funktionalitet för klickkemi
OBS: Konjugera mPsaA med 6-hexaklore-fluorescein-azid med hjälp av protokollet som beskrivs av Presolski et al.20 för klickkemi.
- Ta 432,5 μL PrK-muterat protein vid en koncentration på 57,8 μM till en 2 mL mikrorör.
OBS: En minsta koncentration på 2 μM av alkyne är acceptabel. Om proteinkoncentrationen är lägre, koncentrerar det med en centrifugal koncentrator eller gynnar balansera av reaktionen, genom ökande azide/alkyne molar förhållande. - Tillsätt 10 μL på 5 mM 6-hexaklore-fluorescein-azid och tillsätt sedan en premix på 2,5 μL av CuSO4-lösning vid 20 mM och 7,5 μL triser(benzyltriazolylmethyl)amin (THPTA) vid 50 mM (lagerlösningar koncentrationer).
- Tillsätt 25 μL vattenhaltig 100 mM aminoguanidinhydroklorid.
- Tillsätt 25 μL på 20 mg/mL en extemporeberedda vattenlösning av natriumaskorbat.
- Stäng röret, blanda genom att invertera flera gånger och inkubera i rumstemperatur i 2 h.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 μL på 0,5 M EDTA.
- Ta 15 μL av reaktionsblandningen och lägg den en mikrorör, tillsätt 5 μL lastningsbuffert (bromophenolblått, SDS, β-merkaptoetanol), värm blandningen vid 100 °C i 5 min, och ladda den sedan till en 12% akrylamidgel. Efter migreringen visualiserar du den fluorescerande konjugaten på gelen i UV-belysning vid 312 nm.
5. Konjugering av mPsaA med ett aziido-funktionaliserat kolhydratantigen (Pn14TS-N3) genom att klicka på kemi
- Koppling
- Ta 432,5 μL PrK-muterat protein vid 57,8 μM till en 2 mL mikrorör.
- Tillsätt 10 μL på 5 mM Pn14TS-N321 i vatten och tillsätt sedan en premix på 2,5 μL av CuSO4-lösning vid 20 mM och 7,5 μL THPTA vid 50 mM.
OBS: Syntes av Pn14TS-N3, en tetrasackarid härma Streptococcus pneumoniae serotyp 14 capsular polysackarid, har beskrivits i referens 21. Teoretiskt kan alla kolhydrater antigen som innehåller en azide funktion användas. - Tillsätt 25 μL av 100 mM aminoguanidinhydroklorid.
- Tillsätt 25 μL på 20 mg/mL extemporeberedda vattenlösning av natriumaskorbat.
- Stäng röret, blanda genom att invertera flera gånger och inkubera vid RT under 2 h.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 μL på 0,5 M EDTA.
- Ta 15 μL av prover och analysera genom SDS-PAGE.
- Gel filtrering rening av glykokonjugate
- Rena glykokonjugen genom att applicera den på en sterisk utslagnings-agaroskolonne (15 x 600 sängmått, 3 000-70 000 fraktioneringsområde), ekviliraterad med 100 mM PBS-buffert, pH 7,3 vid ett 0,8 mL/min flöde med detektion vid 280 nm.
- Samla in de fraktioner som innehåller glykokonjugaten.
OBS: För långvarig lagring, dialysa glykokonjugat mot 1 L av H2O två gånger för 2 h och sedan över natten vid 4 °C genom att använda dialysmembran (cut-off Mw 6000-8000 Da), frys-torr och förvara glykokonjugat vid -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta projekt utarbetades ett homogent glykokonjugatvaccin med hjälp av strategin för amber stop kodon suppression för att införa en UAA på ett definierat ställe (Figur 1). Pneumoccocal yta adhesin A valdes som bäraren protein moiety. Detta protein är mycket bevaras och uttrycks av alla stammar av Streptococcus pneumoniae22. Det är mycket immunogena och tidigare använts som bärare i pneumokockvaccin formuleringar21,23. Som ett proof-of-concept undersöktes UAA propargyl-lysin effektivt av vildtypen pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNA par av archaea Methanosarcina mazei. Propargyl-lysin är kommersiellt tillgänglig men kan med fördel förberedas från Boc-L-lysin i endast två syntetiska steg (Bild 2). En bärnstensfärgad kodon genererades på en önskad position i en pET24d plasmid som innehåller mPsaA genen. Detta plasmid var co-transformeras med en pEVOL plasmid (en snäll gåva från Edward Lemke (EMBL19) som innehåller ortogonala verktyg som krävs för att införliva propargyl-lysin, i behöriga E. coli BL21(DE3) stam. Positiva co-transformed kloner valdes med hjälp av 25 μg/mL kanamycin och 30 μg/mL kloramfenikol. Plasmid pEVOL innehåller ursprungligen inte en utan två kopior av den gen som kodar för MmPylRS att införliva propargyl-lysin rest: den första kopian är under kontroll av en konstituerande promotorn medan uttrycket av den andra är inducerbar i närvaro av arabinose. Vi har dock märkt någon dramatisk minskning av propargyl-lysin införlivande om MmPylRS genen under kontroll av konstituerande promotorn undertrycks.
Propargyl-lysin infördes vid position 32 i ersättning av ett lysin nära N-ändstationen i PsaA. Eventuella rester med en ytexponerad sidokedja kan praktiskt taget utbytas med tanke på att genomföra ytterligare konjugering. Muterade proteinet producerades i sin mogna form (mPsaAK32PrK) med införande av en cleavable 6-histidin tag sekvens vid sin C-ändstation. Effektiviteten i mPsaAK32PrK produktionen kontrollerades av SDS-PAGE och Västra Blot analys med hjälp av en anti-Histidin tag antikropp, när tillväxten utfördes i närvaro eller frånvaron av UAA propargyl-lysin och i jämförelse med produktionen av den vilda typen mPsaA (Figur 3). Visualisering visade ett proteinband vid en förväntad molekylvikt (Lanes 4, Figur 3A & 3B). Förekomsten av ett fulllängdsprotein indikerar starkt den framgångsrika införlivandet av PrK i mPsaA. Intensiteten är dock lägre än den som observerats för vild typ mPsaA (Lanes 2, Figur 3A & 3B). Läckage (dvs. produktion av fulllängdsproteinet utan införlivande av UAA) och för tidig frisättning av proteinet av Frisättningsfaktorn RF1 under översättning är två huvudsakliga nackdelar som ofta påträffas under denna process. Å ena sidan visualiseras inget band vid den förväntade molekylvikten i avsaknad av propargyl-lysin vilket innebär att inget läckage uppstod (Lanes 3, Figur 3A & 3B) och bekräftade indirekt att bandet som observerats på Lanes 4 motsvarar mPsaAK32PrK. Å andra sidan kan inget band ses vid låg molekylvikt som skulle kunna motsvara den stympada form av mPsaA (Lane 4 på figur 3A). MPsaAK32PrK renades sedan genom affinitetskromatografi, med en typisk avkastning på 8 mg/L (i jämförelse med 12-20 mg/L för vildtypsproteinet) och införlivandet av propargyl-lysinrester bekräftades slutligen genom masspektrometri (figur 4). Histidin taggen togs bort på proteolytisk klyvning med hjälp av TEV proteas (Bild 4). Stabiliteten i den mPsaAK32PrK som sålunda erhållits bedömdes genom cirkulär dikroism, som visade att strukturen av proteinet inte stördes av mutationen av Lysin 32 till en propargyl-lysin (data som inte visas).
Med mPsaAK32PrK, reaktiviteten av alkyne för klickkemi bedömdes med hjälp av en azido-functionalized fluorescein och vidare används för att konjugera en syntetisk oligosackarid antigen β-2-azidoethyl d-Galp-(11→4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (bild 5). Denna tetrasackarid är relaterad till S. pneumoniae typ 14 capsular polysackarid och har tidigare konjugerade till mPsaA med hjälp av olika konjugation chemistries8,21,24. Experiment här gjordes i jämförelse med vild typ mPsaA som en kontroll. Histidin taggen togs först bort på proteolytic klyvning med hjälp av TEV proteas. Den smälta mPsaAK32PrK och mPsaA WT var sedan konjugerade till fluoroprobe (Figur 6A) eller Pn14TS ( Figur6B). Reaktionen bedömdes av SDS-PAGE. Den lilla ökningen av provets molekylvikt mellan körfält 6 och 7 (Figur 6B) indikerar en lyckad konjugation med tetrasackariden Pn14TS. Slutligen, den glycoconjugate renades genom gel filtrering och dess identitet bekräftas av masspektrometri (Figur 6C). Konjugationen genom att klicka på kemin är kvantitativ huvuddelen av mPsaAK32PrK konjugerades med Pn14TS-N3 som illustreras av masspektrometriresultaten (Figur 6C).
Figur 1: Införlivande av propargyl-lysin (PrK) till mPsaA under översättning med hjälp av en ortogonal pyrrolysyl-tRNA-synthetase/tRNA-par och TAG-kodon omtilldelning25. Under översättningen katalyserar endogena synthetases sambandet mellan aminosyror och motsvarande tRNAs. Därefter används lastade tRNAs av den ribosomala maskineriet för att generera den neosyntetiserade polypeptiden. Enligt den bärnsten stopp kodondämpning strategi, en ortogonal aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) (häri en pyrrolysyl-tRNA synthetase från M. mazei), laddar en UAA (häri PrK) på dess cognate tRNA som planlade anticodon kan läsa det bärnsten stopp codonen (MÄRKA) på mRNAEN. Denna specifika erkännande riktar införlivandet av UAA i den specifika platsen på målproteinet. Figur som återges från Wang et al.25. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Propargyl-lysinsyntes. (A) Steg av propargyl-lysinsyntes. Insats: Övervakning av avskydd av Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxykarbonyl)-OH mellanliggande: tunnskiktskromatografi på 0,25 mm kiselgelplattor med fluorescerande indikator (GF254) och visualiseras genom förkolning med vanillin i svavelsyra/etanol (1.5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), vänster körfält: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH (Rf 0.90), höger körfält: rå propargyl-lysin, (Rf 0.38). 400 MHz 1H (B) och 13C NMR spectra (C) av propargyl-lysin som registrerats i D2O. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Analys av råcellsprover. (A) SDS-PAGE analys och (B) Western blot analys på rå cell prover. Körfält 1: obefläckad proteinmarkör; Körfält 2: råcellsextrakt av vildtyp mPsaA; Lane 3: rå cell extrakt av mPsaAK32TAG odlas i avsaknad av PrK; Lane 4: rå cell utvinning av mPsaAK32TAG odlas i närvaro av PrK. Villkor: 12% akrylamid gel, kör på 100 V, 2 h. SDS-PAGE färgas av Coomassie blå; Western Blot avslöjade med hjälp av anti-histidin tag antikroppar och sekundära antikroppar tillsammans med AlexaFluor680. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Histidin tagg borttagning och massa spektrometri analys. (A) SDS-PAGE-analys. Körfält 1: obefläckad proteinmarkör; Körfält 2: råcellextrakt; Körfält 3: obunden fraktion; Lane 4: tvätta fraktion med 10 mM imidazole; Lane 5: tvätta fraktion med 20 mM imidazol; Villkor: 12% akrylamid gel körs på 100 V för 2 h, och färgas av Coomassie blå; (B) MALDI-TOF-MS spektra av (överst) mPsaA WT, teoretisk MW 33 103 Da, hittades 33 106 Da och (botten) mPsaA K32PrK, teoretisk 33 184 Da, hittades 33 192 Da. De funna massorna ligger inom det förväntade marginalfelet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Schematisk representation av konjugationsstrategin genom klickkemi. En enda tetrasackarid som bär en azide är specifikt kopplade till dess kompletterande biorthogonal alkyne grupp på mPsaA K32PrK (mPsaA representation baserad på 1PSZ PDB fil, med en upplösning på 2,0 Å26). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 6: Histidin-tag-rötning och konjugering av mPsaA med (A) fluorescein-N3 och med (B) Pn14TS. (A) SDS-PAGE Körfält 1-3: WT mPsaA; Körfält 4-6: mPsaAK32PrK; (B)Körfält 1: obefläckad proteinmarkör. Lane 2-4: WT mPsaA; Körfält 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg proteinprov/körfält, 12% akrylamid, 100 V, 2 h; (C) MALDI-TOF-MS spektra av Pn14TS-mPsaAK32PrK teoretiskA MW 34 091 Da, hittade 34 088 Da. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plats-riktad mutagenes är en enkel strategi för att införliva specifika aminosyror vid en definierad position av ett protein som förblir knappt används med syfte att förbereda glykokonjugat vacciner7,8,14. Klassisk mutagenes baserad på de 20 naturliga aminosyror strategi är mycket effektiv eftersom ingen ändring av översättningen maskiner krävs. Cystein mutationer är oftast riktade att ytterligare utforska den unika thiol reaktivitet antingen direkt eller i två steg (t.ex., efter dess ändring i en dehydroalanin mellanliggande, en strategi som kallas post-translational mutagenesis)27,28. Genetisk kod expansion är kanske ännu mer attraktiv och flexibel eftersom det möjliggör direkt införlivande av ett brett spektrum av UAAs med olikafunktionaliteter 9,10. Medan flera UAAs kan införlivas samtidigt inom ett protein29,antalet mutationer är oftast mer begränsad. Vi häri tillämpas den relaterade bärnsten stopp kodon strategi att införa en enda propargyl-lysin i en bärare protein. Inkorporering kan ske på något läge förutsatt att sidechain av den initiala amino syran var ytexponerad, ett kriterium som lätt bestäms från röntgenkristallografiska strukturer eller i silico modellering. Dessutom är det inte begränsat till propargyl-lysin men kan utvidgas till någon UAA funktionaliserad med en biorthogonal funktion som senare kommer att fungera som ett ankare för att ympa den inkommande kolhydratantigenen och för vilka en ortogonal aaRS / tRNA-par finns.
En av nackdelarna med strategin är en eventuell produktion av trunkerat protein, som följer av frisättningen av peptidyl sidechain när du läser den gula stop-kodon, som en sida-produkt. Även om vi inte observerade någon trunkerad form här (förmodligen försämras av bakterierna på grund av det mycket liten storlek), en histidin tagg har tillsatts vid C-ändstation av proteinet för att underlätta rening av den förväntade fullängds muterade protein från föroreningar och märkbart från den trunkerade protein (som genom essens inte uttrycker histidin tag sekvens). Detta kan bli viktigt om UAA införlivandet utförs nära proteinet C-ändstationen eftersom rening inte kan försökas med hjälp av alternativa kromatografi tekniker som gel filtrering.
För de flesta tillämpningar borttagning av histidin taggen är inte obligatoriskt. Det kan dock vara användbart när det gäller utformningen av glykopkonjugatvaccin som en del av immunsystemet kan avledas mot taggen sekvens. För detta proof-of-concept, vi in en aminosyra längd sekvens specifikt klyvts av TEV proteas som lämnar fem extra aminosyror på bäraren protein efter matsmältningen.
Den konjugation steg mellan alkyne av propargyl-lysin och en representativ syntetiska oligosackarid Pn14TS relaterade till en pneumokock kapsel och bär en kompletterande azide genomfördes enligt ett klick kemi protokoll rapporteras av Presolski et al.20 Om så är nödvändigt kan man lätt nå fullbordandet av reaktionen genom att öka reaktionstiden eller genom att ändra förhållandet mellan alkyne-, azid- och kopparreaktanterna och reagenserna. Kopparsalter elimineras genom behandling med överskott EDTA följt av en kort rening av steric uteslutning kromatografi.
Den glykokonjugat som erhålls med den teknik som beskrivs i det föreliggande arbetet kan sedan användas för att immunisera möss. Med en sådan fullt definierad och lätt modulerad glykoskonjugat i händerna ger ovärderliga verktyg för att utvärdera effekterna av hapten/proteinbäraranslutningen påimmunsvaret 8. Eftersom öka hapten/protein förhållandet är ofta korrelerade med förbättrad anti-hapten humoral svar när du använder korta haptens30, kan man vara intresserad av att testa konjugater med flera haptens. Införlivandet av flera UAAs behöver dock några justeringar av protokollet som införlivandet av en UAA i proteinet tenderar att minska avkastningen av proteinproduktion på grund av RF1-aktiviteten.
I definitiva, denna metod är ett kraftfullt verktyg för att få tillgång till homogena glykokonjugat vacciner underlätta deras fysikalisk-kemiska karakterisering och ytterligare kolhydrater antigen/bärare anslutning-immunogenicitet relation studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
E.C. erkänner tacksamt det ekonomiska stödet från La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique-programmet "BioSynProt"), i synnerhet ett doktorandstipendium till T.V. Vi erkänner också Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrike) för hans dyrbara tekniska råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AIM (autoinductif medium) | Formedium | AIMLB0210 | Solid powder |
| Boc-Lys-OH | Alfa-Aesar | H63859 | Solid powder |
| BL21(DE3) | Merck Novagen | 69450 | E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS) |
| Dialysis membrane | |||
| DNAseI | |||
| Filter 0.45 µm | |||
| L-arabinose | |||
| lysozyme | |||
| Ni-NTA resin | Machery Nagel | Protino | Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol |
| Pall centrifugal device | |||
| pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH | this study | same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene | |
| pET24d-mPsaA-WT | this study | pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene | |
| pEVOL plasmid | gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) | plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene | |
| Propargyl chloroformate | Sigma-Aldrich | 460923 | Liquid |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB120-220 |
References
- Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
- Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
- Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
- Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
- Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
- Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
- Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
- Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
- Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
- Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
- Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
- Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
- WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
- Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
- Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
- Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
- Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
- Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
- Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
- Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
- Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
- Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
- Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
- Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
- Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
- Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
- Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).
