Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Homogen glykokonjugat produsert av kombinert unaturlig aminosyre inkorporering og klikk-kjemi for vaksineformål

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/60821
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Université de Nantes, CNRS, Unité Fonctionnalité et Ingénierie des Protéines (UFIP), UMR 6286

Summary

Genetisk kodeutvidelse brukes for innføring av en unaturlig aminosyre som bærer en biorthogonal funksjonell gruppe på et bærerprotein på et definert sted. Biorthogonalfunksjonen brukes videre til den stedselektive koblingen av et karbohydratantigen for å gi en homogen glykokonjugatvaksine.

Abstract

Genetisk kodeutvidelse er et kraftig verktøy for å introdusere unaturlige aminosyrer (UAAer) i proteiner for å endre sine egenskaper, for å studere eller skape nye proteinfunksjoner eller å ha tilgang til proteinkonjugater. Stopp codon undertrykkelse, spesielt amber codon undertrykkelse, har dukket opp som den mest populære metoden for å genetisk introdusere UAAs på definerte stillinger. Denne metodikken brukes her på utarbeidelsen av et bærerprotein som inneholder en UAA som huser en bioorthogonal funksjonell gruppe. Dette reaktive håndtaket kan deretter brukes til å spesifikt og effektivt transplantere en syntetisk oligosakkarid hapten for å gi en homogen glykoconjugate vaksine. Protokollen er begrenset til syntesen av glykokonjugater i et 1:1 karbohydrat hapten / bærer proteinforhold, men mottagelig for mange par biorthogonale funksjonelle grupper. Glykokonjutere vaksine homogenitet er et viktig kriterium for å sikre fullstendig fysikalisk-kjemisk karakterisering, og dermed tilfredsstille flere og flere krevende narkotika regulatoriske byrå anbefalinger, et kriterium som er udekket av klassiske bøyningsstrategier. Videre gjør denne protokollen det mulig å finjustere strukturen til den faktiske konjugatvaksinen, noe som gir opphav til verktøy for å håndtere struktur-immunogenitetsrelasjoner.

Introduction

Glycoconjugate vaksiner er viktige elementer i vaksinearsenalet tilgjengelig for profylaktisk behandling av smittsomme sykdommer. De er trygge, godt tolerert og effektive i en bred aldersgruppe, inkludert små spedbarn. De gir optimalt forsvar mot infeksjoner forårsaket av kapsulerte bakterier som meningokokker, pneumokokker eller Haemophilus influenzae type b1. Glykokonjutere vaksiner er laget av rensede bakterielle polysakkarider som danner kapslene av bakterier eller syntetiske oligosakkarider som etterligner disse overflateutpressede polysakkarider2, som er kovalent knyttet til et bærerprotein. Tilstedeværelsen av et bærerprotein er viktig for å fremme beskyttende humorale immunresponser rettet mot den antigene determinanten uttrykt av karbohydratantigenene3. Bortsett fra et nøye utvalg og produksjon av karbohydratantigenet, er funksjonene som er kjent for å utøve innflytelse på effekten av en glykoconjugate vaksine: arten av bærerproteinet, bøyningkjemien (inkludert arten og lengden på linkeren hvis den brukes), eller sakkarid /proteinforholdet 3. Selvfølgelig er posisjonene der sakkaridet er konjugert til proteinet, samt antall tilkoblingspunkter relevante for immunogenitet. Til dags dato har disse to parametrene knapt blitt studert fordi utarbeidelsen av glykokonjugatene forblir i stor grad empiriske. Deres syntese er vanligvis avhengig av bruk av amin eller karboksylsyre funksjoner av henholdsvis lysin eller aspartic / glutaminsyre sidekjede rester som finnes på bærer protein sekvens. Dette fører ikke til en enkelt, men til en heterogen blanding av glykokonjugater.

Å spille på reaktivitet, tilgjengelighet eller distribusjon av aminosyrerester i proteinet gir opphav til mer definerte glykokonjugater som er mer pålitelige for å dokumentere effekten av sakkarid / proteintilkobling4. Et skritt fremover mot dette målet kan oppnås ved å bruke proteinglykotankoblingsteknologi, en rekombinant prosess som gjør det mulig å lage kontrollerte glykokonjuterevaksiner i cellefabrikker 5,6. Glykosyleringen foregår imidlertid utelukkende ved en asparaginrester i D/EXNYS/T-sequons (der X er noen av de 20 naturlige aminosyrene), som ikke er naturlig tilstede på bærerproteinene.

Nettstedet selektiv mutagenesis og spesielt inkorporering av cysteiner for å utnytte sin svært og selektiv reaktivitet vises som et alternativ7,8. Produksjon av bærerproteiner som omfatter UAAer i deres sekvens kan gi enda mer fleksibilitet for homogen glykokonjugering av vaksinepreparat. Mer enn 100 UAAs har blitt utviklet og videre innlemmet i ulikeproteiner 9,10. Mange av dem inneholder bioorthogonale funksjoner som vanligvis brukes til å utføre post translasjonellemodifikasjoner 11 eller for å pode biofysiske sonder12 eller narkotika13, men som er ideelle håndtak for videre bøyning med karbohydratantigener. Vellykkede eksempler har blitt hevdet av Biotech14 ved hjelp av cellefri proteinsyntese15, men utarbeidelse av glykokonjugatvaksiner i henhold til denne strategien venter fortsatt på å bli popularisert.

Anvendelse av in vivo strategi for produksjon av mutert bærer protein trenger en modifisert translasjonell maskineri som inkluderer en bestemt kodon, en tRNA gjenkjenne kodon og en aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) som spesielt katalyserer overføringen av UAA på tRNA (Figur 1)16. Pyrrolysin amber stop codon undertrykkelse er en av de mest brukte metodene for å innlemme UAA, spesielt propargyl-lysin (PrK)17. Sistnevnte kan igjen reagere med aziido-funksjonaliserte karbohydrat haptens å gi fullt definerte, homogene glykokonjugater. I det nåværende manuskriptet beskriver vi hvordan man syntetiserer propargyl-L-lysinen, en UAA som bærer et alkynehåndtak, hvordan man innlemmer det i et målprotein under oversettelsen i en bakterie og til slutt hvordan man utfører bøyning mellom det modifiserte proteinet og en hapten som bærer en azidefunksjon ved hjelp av klikkkjemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese av UAA: propargyl-lysin (PrK)

  1. Syntese av Nα-Boc-propargyl-lysin18
    1. Oppløs 500 mg Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) i en blanding av vandig 1 M NaOH (5 ml) og THF (5 ml) i en kolbe og monter kolben med silisiumsepum.
    2. Avkjøl kolben i et isbad og tilsett deretter 158 μL propargylklorformat (1,62 mmol) dropwise (over en 2-3 min periode) ved hjelp av en mikrosyring under omrøring.
    3. Varm reaksjonsblandingen til romtemperatur og fortsett å røre i 10 timer.
    4. Avkjølingsløsninger av 50 ml dietyleter, 50 ml vandig 1 M saltsyre og 60 ml etylacetat i et isbad.
    5. Avkjøl den grove reaksjonsblandingen i et isbad og hell blandingen i en separasjonstrakte. Trekk ut blandingen med 50 ml dietyleter. Kast det organiske laget.
    6. Legg forsiktig vandig 1 M saltsyre til den vandige fasen i separasjonstrakten. Trekk deretter ut vandig lag to ganger ved hjelp av 30 ml etylacetat. Kontroller tilstedeværelsen av N-Boc-propargyllysin i organisk fase av TLC ved hjelp av CH2Cl2-metanol (9:1) som eluent.
    7. Tørk de kombinerte organiske lagene over MgSO4,filtrer av den faste fasen og konsentrat filtratet under redusert trykk på en roterende fordamper.
    8. Oppløs en prøve av den oljeholdige Nα-Boc-propargyl-lysin i deuterated kloroform (CDCl3) og kontrollere sin identitet med 1H NMR.
      FORSIKTIG: Ekstraksjon kan føre til trykkoppbygging. Slipp ut eventuell trykkoppbygging ofte.
  2. Syntese av unaturlig aminosyre propargyl-L-lysin (PrK)
    1. Introdder N α-Boc-propargyl-lysin i en rund bunnkolbe utstyrt med septum.
    2. Tilsett 4 ml vannfri diklormetan (CH2Cl2) i kolben under argon for å oppløse Nα-Boc-propargyllysin.
    3. Tilsett 4 ml trifluorotaktisk syre (TFA) dråpevis ved hjelp av en sprøyte under omrøring.
    4. Rør reaksjonsblandingen i 1 t ved RT. Overvåk reaksjonen ved TLC ved hjelp av CH2Cl2-metanol (9:1) som eluent.
    5. Konsentrer reaksjonsblandingen under redusert trykk.
    6. Tilsett dietyleter til rårester og inkuber den ved 4 °C i 1 time for å utløse PrK. Når du arbeider på høyere skala, hvis PrK ikke er helt utfelt, triturate å utløse det og forlenge inkubasjonstiden om nødvendig.
    7. Filtrer PrK i form av en hvit fast på et fritted-glass.
    8. Oppløs en aliquot av PrK i D2O. Deretter utfører du NMR-analyser for å kontrollere sin identitet og renhet.
    9. For videre bruk, oppløs den unaturlige aminosyren PrK i destillert vann ved en endelig konsentrasjon på 100 mM og oppbevar ved -20 °C som 1 ml aliquots.

2. Produksjon av rekombinantprotein modifisert av PrK

  1. Plasmid forberedelse
    1. Konstruere et uttrykk plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) som inneholder målet modne Pneumokokk overflate adhesin A (mPsaA) genet (pET24d-mPsaA-WT) etterfulgt av en tobakk etch virus (TEV) protease sekvens ved kloning innsatsen mellom BamHI og XhoI begrensning steder av pET24d plasmid. Dette vil introdusere en Hans6 tag på C-terminus av proteinet. Erstatt codon av lysin-32 med rav codon (TAG), ved hjelp av konvensjonell site-rettet mutagenese teknikk.
    2. Konstruer et andre uttrykk plasmid (pEVOL-MmPylRS) som inneholder to kopier av genkodingen for pyrrolysyl-tRNA-syntetase fra Methanosarcina mazei (MmPylRS) og genkodingen for tilsvarende tRNAPyr som tidligere beskrevet19. Bruk denne spesialdesignede plasmidvektoren, pEVOL, for effektiv inkorporering av UAAer.
      MERK: Den detaljerte plasmidsinformasjonen er beskrevet i tilleggsfil 1.
  2. Samtidig transformasjon av plasmider til uttrykket belastning
    1. Tin en 100 μL aliquot av kjemisk kompetent Escherichia coli BL21 (DE3) på is i 5 min.
    2. Tilsett 1 μL av hver plasmid (50-100 ng av hver) i cellene og inkuber i 30 min på is.
    3. Overfør 1,5 ml mikrorør med de tinte kompetente cellene i en inkubator ved 42 °C i 45 s og flytt det deretter tilbake til is i 2 min.
    4. Tilsett 900 μL LB medium og inkuber under risting i 1 time ved 37 °C for å tillate antibiotikauttrykk. Deretter plate bakteriene på LB agar med 25 μg / ml kanamycin og 30 μg / ml kloramfenikol. La bakterier vekst over natten ved 37 °C.
  3. Uttrykk for proteiner modifisert med PrK
    1. Inokuler en enkelt samtidig forvandlet koloni i 5 ml LB medium med antibiotika (25 μg / ml kanamycin og 30 μg / ml kloramfenikol). Inkuber over natten ved 37 °C med risting.
    2. Fortynn den primære kulturen (5 ml) i 500 ml autoinduksjonsmedium som inneholder antibiotika, 0,02% av L-arabinose og 1 mM av den unaturlige aminosyren PrK og inkuber den ved 37 ° C for 24 h med risting. Inkluder en negativ kontroll ved å utføre kulturen uten PrK parallelt og en positiv kontroll ved å utføre kulturen til en klone som inneholder wt-proteinet.
    3. Aliquot 5 ml ut av 500 ml kultur medium og sentrifuge i 10 min ved 5000 x g. Kast det overnaturlige og frys pellet ved -20 °C. Høst celler fra de resterende 495 ml ved sentrifugering i 10 min ved 5000 x g. Kast det overnaturlige og frys pellet ved -20 °C.
  4. Analyser råoljecelleekstrakter fra 5 ml kulturprøver av SDS-PAGE og western Blot-analyse
    1. Resuspend 5 ml celle pellets i 250 μL lysis buffer (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF) og overføre den til en 1,5 ml mikrotube.
    2. Lyse celler ved å fryse rørene i flytende nitrogen, tine den i en 42 ° C bad og virvler i høy hastighet i 30 s. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
    3. Sentrifugeprøver ved 17 000 x g i 10 min for å eliminere celleavfall.
    4. Ta 10 μL av supernatant og tilsett 5 μL vann og 5 μL lastbuffer (bromofenolblå, SDS, β-mercaptoetanol). Varm prøvene i 5 min ved 100 °C og utfør SDS-PAGE- og western Blot-analyser.
  5. Proteinrensing ved tyngdekraftstrømningsbenkaffinitet kromatografi ved hjelp av Nikkel-NTA perler
    1. Resuspend cellepellets (fra 495 ml kultur) til 20 ml lysis buffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF).
    2. Tilsett 5 μL DNase I (1 mg/ml) og 500 μL lysozym (50 mg/ml) i suspensjonen og la lysis ved å inkubere suspensjonen ved 37 °C i løpet av 30 min.
    3. Sonicate cellene under 5 min (sykluser på 5 s-5 s, amplitude 50%) og fjern deretter celleavfallet ved sentrifugering ved 20 000 x g i 30 min etterfulgt av filtrering på 0,45 μm filter.
    4. Tilsett Ni-NTA harpiks i suspensjonen (500 μL for 500 ml cellekultur) og bland forsiktig ved 4 °C i 1 time.
    5. Hell suspensjonen i en polypropylenkolonne og samle den ubundne fraksjonen.
    6. Vask harpiksen med 10 ml vaskebuffer som inneholder 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol. Vask harpiksen en gang til med 5 ml vaskebuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazol). Samle vaskefraksjonene.
    7. Elute det his-merkede proteinet med 1 ml elutionbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 300 mM imidazol). Gjenta dette trinnet 4 ganger og samle alle elution brøker.
    8. Analyser rålyst samt 7 rensefraksjoner av SDS-PAGE på en 12% akrylamidgel.
    9. Kombiner fraksjonene som inneholder rent hans-merkede protein og dialyser det mot 1 L TEV proteasebuffer (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) over natten ved hjelp av en dialysemembran (cut-off MW 6000-8000 Da). Mål konsentrasjonen av proteinet ved 280 nm med en molar utryddelseskoeffisient på 37 360 cm-1∙M-1 og en molekylvekt på 34,14 kDa for mPsaA.

3. Fjerning av histidin tag av TEV protease fordøyelsen

  1. Samle proteinprøven i et 50 ml rør og tilsett TEV-buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) opptil 1 ml i en konsentrasjon på 2 mg/ml.
    MERK: Konsentrasjonen kan variere i henhold til tidligere resultater. Proteinkonsentrasjoner som vi har testet er i et typisk 2-3 mg/ml-område.
  2. Tilsett 100 μL TEV protease (tilsett 1 μL som inneholder 10 enheter TEV protease for 20 μg protein å fordøye).
  3. Tilsett 50 μL på 0,1 M dithiothreitol (DTT).
  4. Komplett med TEV buffer (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) opptil 5 ml.
  5. Inkuber over natten ved 4 °C med langsom risting.
    MERK: Hvis fordøyelsen ikke er fullført, tilsett mer TEV protease, inkubere i lengre tid eller ved høyere temperatur opp til 30 °C.
  6. Dialyser det fordøyde proteinet for å fjerne EDTA ved 4 °C over natten ved hjelp av dialysemembran (cut-off 6000-8000 Da) mot fosfatbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 5 mM imidazol).
  7. For å eliminere TEV protease og ufordøyd protein, inkuber blandingen med Ni-NTA perler og bland forsiktig i 1 time ved 4 °C.
  8. Hell suspensjonen i en polypropylenkolonne. Samle den ubundne fraksjonen og vask kolonnen med 5 ml vaskebuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazol)
    MERK: Proteinet av interesse bør gjenvinnes i de ubundne og vaskefraksjonene.
  9. Elute TEV protease og ufordøyd protein ved å legge til 5 ml elution buffer (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 300 mM imidazol) på kolonnen. Kontroller brøkene for proteininnhold ved 280 nm og ved SDS-PAGE-analyse.
  10. Kontroller effektiviteten av fordøyelsen ved å laste fordøyde prøver på en SDS-side med det ufordøyde proteinet som en kontroll.
  11. Dialyser det fordøyde proteinet mot 1 L klikkbuffer (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH8) ved 4 °C over natten med en dialysemembran (cut-off 6000-8000 Da) for å fjerne imidazol samt bytte bufferen, og måle konsentrasjonen av proteinet ved 280 nm med molar utryddelseskoeffisient og molekylvekt av mPsaA (37 360 cm-1∙M-1 og MW 34,14 kDa).

4. Vurdering av unaturlig aminosyre propargyl-lysin tilgjengelighet og funksjonalitet for klikk kjemi

MERK: Konjuger mPsaA med 6-heksaklor-fluorescein-azid ved hjelp av protokollen beskrevet av Presolski et al.20 for klikkkjemi.

  1. Ta 432,5 μL PrK-mutert protein med en konsentrasjon på 57,8 μM i et 2 ml mikrorør.
    MERK: En minimumskonsentrasjon på 2 μM alkyn er akseptabelt. Hvis proteinkonsentrasjonen er lavere, konsentrat den med en sentrifugalkonsentrator eller favoriserer reaksjonens balanse ved å øke ashaid/alkyne molarforhold.
  2. Tilsett 10 μL av 5 mM 6-heksaklor-fluorescein-azid og tilsett deretter en premiks på 2,5 μL CuSO4-oppløsning ved 20 mM og 7,5 μL Tris(benzyltriazolylmetylmetyl)amin (THPTA) ved 50 mM (lagerløsninger konsentrasjoner).
    1. Tilsett 25 μL vandig 100 mM aminoguanidhydroklorid.
    2. Tilsett 25 μL μL 20 mg/ml en ekstemporaneously forberedt vandig løsning av natriumaskorbat.
    3. Lukk røret, bland ved å invertere flere ganger og inkuber ved romtemperatur i 2 timer.
    4. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 μL på 0,5 M EDTA.
    5. Ta 15 μL av reaksjonsblandingen og sett den et mikrorør, tilsett 5 μL lastbuffer (bromofenolblå, SDS, β-mercaptoetanol), varm blandingen ved 100 ° C i 5 min, og last den deretter inn i en 12% akrylamidgel. Etter migrering visualiser du den fluorescerende konjugaten på gelen under UV-lys ved 312 nm.

5. Bøyning av mPsaA med et azeridfunksjonalisert karbohydratantigen (Pn14TS-N3) ved å klikke kjemi

  1. Kobling
    1. Ta 432,5 μL PrK-mutert protein ved 57,8 μM i et 2 ml mikrorør.
    2. Tilsett 10 μL på 5 mM Pn14TS-N321 i vann, og tilsett deretter en premiks på 2,5 μL CuSO4-oppløsning ved 20 mM og 7,5 μL THPTA ved 50 mM.
      MERK: Syntese av Pn14TS-N3, et tetrasakkarid som etterligner Streptococcus pneumoniae serotype 14 kapsulær polysakkarid, er beskrevet i referanse 21. Teoretisk kan ethvert karbohydratantigen som inneholder en azidfunksjon brukes.
    3. Tilsett 25 μL av 100 mM aminoguanidhydroklorid.
    4. Tilsett 25 μL μL av 20 mg/ml ekstemporaneously forberedt vandig oppløsning av natriumaskorbat.
    5. Lukk røret, bland ved å invertere flere ganger og inkuber ved RT i løpet av 2 timer.
    6. Stopp reaksjonen ved å tilsette 50 μL på 0,5 M EDTA.
    7. Ta 15 μL prøver og analyser av SDS-PAGE.
  2. Gelfiltreringsrensing av glykokonjugatet
    1. Rens glykokonjugatet ved å bruke den på en sterisk eksklusjon agarose kolonne (15 x 600 seng dimensjoner, 3000-70,000 fraksjonering område), likevekt med 100 mM PBS buffer, pH 7,3 på en 0,8 ml / min flyt med deteksjon på 280 nm.
    2. Samle fraksjonene som inneholder glykokonjugatet.
      MERK: Ved langvarig lagring, dialyser glykokonjuter mot 1 L H2O to ganger i 2 timer og deretter over natten ved 4 °C ved hjelp av dialysemembran (cut-off Mw 6000-8000 Da), deretter fryse-tørke og oppbevar glykokonjugatet ved -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I dette prosjektet ble en homogen glykoconjugate vaksine utarbeidet ved hjelp av amber stop codon undertrykkelse strategi for å introdusere en UAA på et definert sted (Figur 1). Pneumoccocal overflateadhesin A ble valgt som bærer protein moiety. Dette proteinet er svært bevart og uttrykt av alle stammer av Streptococcus pneumoniae22. Det er svært immunogent og tidligere brukt som bærer i pneumokokkvaksineformuleringer21,23. Som et konseptbevis ble UAA propargyl-lysin effektivt belastet av villtypen pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) / tRNA-paret av arkaea Methanosarcina mazei undersøkt. Propargyllysinen er kommersielt tilgjengelig, men kan være fordelaktig utarbeidet fra Boc-L-lysin i bare to syntetiske trinn (figur 2). En ravkodon ble generert i en ønsket posisjon i en pET24d plasmid som inneholder mPsaA genet. Denne plasmiden ble forvandlet sammen med en pEVOL plasmid (en slags gave fra Edward Lemke (EMBL19) som inneholder ortogonale verktøy som er nødvendige for å innlemme propargyllysin, i kompetent E. coli BL21 (DE3) belastning. Positive co-transformerte kloner ble valgt ved hjelp av 25 μg / ml kanamycin og 30 μg / ml kloramfenikol. Plasmid pEVOL inneholder opprinnelig ikke en, men to kopier av genkodingen for MmPylRS for å innlemme propargyllysinrester: den første kopien er under kontroll av en konstitutiv promotor mens uttrykket til den andre er induserbar i nærvær av arabinose. Vi har imidlertid ikke lagt merke til noen dramatisk reduksjon av propargyllysinkorporering hvis MmPylRS-genet under kontroll av konstituerende promotor undertrykkes.

Propargyllysinet ble introdusert i posisjon 32 i erstatning av en lysin nær N-terminus av PsaA. Eventuelle rester med en overflate eksponert sidekjede kan nesten byttes i lys av å utføre ytterligere bøyning. Det muterte proteinet ble produsert i sin modne form (mPsaAK32PrK) med inkludering av en cleavable 6-histidine tag sekvens ved sin C-terminus. Effektiviteten av mPsaAK32PrK produksjonen ble kontrollert av SDS-PAGE og Western Blot analyse ved hjelp av en anti-Histidine tag antistoff, når veksten ble utført i nærvær eller fravær av UAA propargyl-lysin og i forhold til produksjonen av vill type mPsaA (Figur 3). Visualisering avslørte et proteinbånd med forventet molekylvekt (Lanes 4, Figur 3A & 3B). Tilstedeværelsen av et protein i full lengde indikerer sterkt vellykket inkorporering av PrK i mPsaA. Intensiteten er imidlertid lavere enn det som er observert for vill type mPsaA (Lanes 2, Figur 3A & 3B). Lekkasje (det vil at produksjonen av proteinet i full lengde uten inkorporering av UAA) og for tidlig frigjøring av proteinet av frigjøringsfaktor RF1 under oversettelsen er to hovedtrekk som ofte oppstår under denne prosessen. På den ene siden visualiseres ingen bånd ved forventet molekylvekt i fravær av propargyllysin, noe som betyr at det ikke oppsto noen lekkasje (Lanes 3, Figur 3A & 3B) og indirekte bekreftet at bandet observert på Lanes 4 tilsvarer mPsaAK32PrK. På den annen side kan ingen bånd ses ved lav molekylvekt som kan tilsvare den avkortede formen for mPsaA (Lane 4 på figur 3A). MPsaAK32PrK ble deretter renset av affinitetkromatografi, med et typisk utbytte på 8 mg / L (sammenlignet med 12-20 mg / L for vill type protein) og inkorporering av propargyl-lysinrester ble endelig bekreftet av massespektrometri (figur 4). Histidin-taggen ble fjernet ved proteolytisk spalting ved hjelp av TEV protease (figur 4). Stabiliteten til mPsaAK32PrK ble dermed vurdert ved sirkulær diktostikk, som viste at proteinets struktur ikke ble forstyrret av mutasjonen av Lysine 32 til en propargyllysin (data som ikke er vist).

Å ha mPsaAK32PrK, reaktiviteten til alkyne for klikkkjemi ble vurdert ved hjelp av en azido-funksjonalisert fluorescein og videre brukt til å konjugere et syntetisk oligosakkarid antigen β-2-azidoethyl d-Galp-(1 →4)-β-d-Glcp-(1→6)-[β-d-Galp-(1→4)]-β-d-GlcpNAc (Pn14TS) (figur 5). Dette tetrasakkarid er relatert til S. pneumoniae type 14 kapsulær polysakkarid og har tidligere blitt konjugert til mPsaA ved hjelp av forskjellige konjugering chemistries8,21,24. Eksperimenter her ble gjort i forhold til vill type mPsaA som en kontroll. Histidin-taggen ble først fjernet ved proteolytisk spalting ved hjelp av TEV-protease. Den fordøyde mPsaAK32PrK og mPsaA WT ble deretter konjugert til fluoroprobe (figur 6A) eller Pn14TS ( figur6B). Reaksjonen ble vurdert av SDS-PAGE. Den lille økningen i den molekylære vekten av prøven mellom kjørefelt 6 og 7 (figur 6B) indikerer en vellykket bøyning med tetrasakkarid Pn14TS. Til slutt ble glykokonjugatet renset av gelfiltrering og dens identitet bekreftet av massespektrometri (figur 6C). Bøyningen ved klikkkjemi er kvantitativ flertallet av parlamentsmedlemmeneK32PrK ble konjugert med Pn14TS-N3 som illustrert av massespektrometriresultatene (figur 6C).

Figure 1
Figur 1: Inkorporering av propargyllysin (PrK) i mPsaA under oversettelse ved hjelp av et ortogonal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA-par og TAG codon-omplassering25. Under oversettelsen katalyserer endogene koblingen mellom aminosyrer og tilsvarende tRNAer. Deretter brukes lastede tRNA-er av ribosomale maskiner for å generere det nysyntetiserte polypeptid. Ifølge amber stop codon undertrykkelse strategi, en ortogonal aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) (heri en pyrrolysyl-tRNA synthetase fra M. mazei),laster en UAA (heri PrK) på sin kognate tRNA som designet antikodon kan lese amber stop codon (TAG) på mRNA. Denne spesifikke anerkjennelsen leder inkorporeringen av UAA inn i det spesifikke stedet på målproteinet. Figur gjengitt fra Wang et al.25. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Propargyl-lysinsyntese. (A)Trinn av propargyl-lysin syntese. Sett inn: Overvåking av deprotection av Boc-l-Lys (prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH mellomliggende: tynnlags kromatografi på 0,25 mm silikagelplater med fluorescerende indikator (GF254) og visualisert ved forkulling med vanillin i svovelsyre /etanol (1,5:95 v/v); eluent: CH2Cl2/MeOH (9:1), venstre kjørefelt: Boc-l-Lys(prop-2-ynyloxycarbonyl)-OH (Rf 0,90), høyre kjørefelt: rå propargyl-lysin, (Rf 0,38). 400 MHz 1H (B) og 13C NMR spektra (C) av propargyl-lysin registrert i D2O. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Analyse av råoljecelleprøver. (A) SDS-PAGE analyse og (B) Western blot analyse på råolje celleprøver. Lane 1: uopphetet proteinmarkør; Lane 2: råolje celle ekstrakt av vill type mPsaA; Lane 3: råolje celle ekstrakt av mPsaAK32TAG dyrket i fravær av PrK; Lane 4: råolje celle utvinning av mPsaAK32TAG dyrket i nærvær av PrK. Forhold: 12% akrylamid gel, kjører på 100 V, 2 h. SDS-PAGE farget av Coomassie blå; Western Blot avslørte ved hjelp av anti-histidin tag antistoff og sekundært antistoff kombinert med AlexaFluor680. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fjerning av histidintag og massespektrometrianalyse. (A) SDS-SIDE analyse. Lane 1: uopphetet proteinmarkør; Lane 2: råolje celle ekstrakt; Kjørefelt 3: ubundet fraksjon; Lane 4: vaskfraksjon med 10 mM imidazol; Lane 5: vaskfraksjon med 20 mM imidazol; Forhold: 12% akrylamid gel kjører på 100 V i 2 timer, og farget av Coomassie blå; (B) MALDI-TOF-MS spectra av (topp) mPsaA WT, teoretisk MW 33 103 Da, fant 33 106 Da og (nederst) mPsaA K32PrK, teoretisk 33 184 Da, fant 33 192 Da. De funnet massene er innenfor den forventede marginfeilen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Skjematisk representasjon av konjugeringsstrategien ved å klikke kjemi. En enkelt tetrasakkarid bærer et azid er spesielt koplet til sin komplementære biorthogonal alkyne gruppe på mPsaA K32PrK (mPsaA representasjon basert på 1PSZ PDB-filen, med en oppløsning på 2.0 Å26). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Histidin-tag fordøyelse og bøyning av mPsaA med (A) fluorescein-N3 og med (B) Pn14TS. (A)SDS-SIDE Baner 1-3: WT mPsaA; Lane 4-6: mPsaAK32PrK; (B) Lane 1: uopphetet proteinmarkør; Lane 2-4: WT mPsaA; Lane 5-7: mPsaAK32PrK. 2 μg protein prøve / kjørefelt, 12% akrylamid, 100 V, 2 h; (C) MALDI-TOF-MS spectra av Pn14TS-mPsaAK32PrK teoretisk MW 34 091 Da, fant 34 088 Da. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å se denne filen (Høyreklikk for å laste ned).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stedsrettet mutagenese er en enkel strategi for å innlemme spesifikke aminosyrer i en definert posisjon av et protein som forblir knapt brukt med sikte på å forberede glykokonjugatvaksiner7,8,14. Klassisk mutagenese basert på 20 naturlige aminosyrer tilnærming er svært effektiv siden ingen endring av oversettelse maskiner er nødvendig. Cystein mutasjoner er vanligvis rettet mot å utforske den unike tiol reaktivitet enten direkte eller i to trinn (f.eks, ettersin endring i en dehydroalanine mellomliggende, en strategi som kalles post-translational mutagenesis)27,28. Genetisk kodeutvidelse er kanskje enda mer attraktiv og fleksibel siden det tillater direkte inkorporering av et bredt spekter av UAAer med ulikefunksjoner 9,10. Mens flere UAAer kan innlemmes samtidig i et protein29, er antall mutasjoner vanligvis mer begrenset. Vi brukte her den relaterte amber stop codon-strategien for å introdusere en enkelt propargyllysin i et bærerprotein. Inkorporeringen kan finne sted i hvilken som helst posisjon forutsatt at sideringen av den opprinnelige aminosyren ble overflateutsatte, et kriterium lett bestemmes av røntgenkrystallografiske strukturer eller i silicomodellering. Videre er det ikke begrenset til propargyl-lysin, men kan utvides til enhver UAA funksjonalisert med en biorthogonal funksjon som senere vil tjene som et anker for å pode innkommende karbohydratantigen og som et ortogonalt aaRS / tRNA-par eksisterer.

En av ulempene med strategien er mulig produksjon av avkortet protein, som følge av frigjøring av peptidylsidekjeden når du leser ravstoppkodonen, som et sideprodukt. Selv om vi ikke observerte noen avkortet form her (sannsynligvis degradert av bakteriene på grunn av det svært liten størrelse), har en histidin tag blitt lagt til ved C-terminus av proteinet for å lette rensingen av det forventede fulllengde muterte proteinet fra urenheter og merkbart fra det avkortede proteinet (som i hovedsak ikke uttrykker histidintagsekvensen). Dette kan bli avgjørende hvis UAA-inkorporeringen utføres i nærheten av proteinet C-terminus, siden rensing ikke kan forsøkes ved hjelp av alternative kromatografiteknikker som gelfiltrering.

For de fleste applikasjoner fjerning av histidin koden er ikke obligatorisk. Det kan imidlertid være nyttig med hensyn til utformingen av glykokonjugeringsvaksine som en del av immunsystemet kan avledes mot tagsekvensen. For dette konseptbeviset satte vi inn en aminosyrelengdesekvens spesielt spaltet av TEV-protease som etterlater fem ekstra aminosyrer på bærerproteinet etter fordøyelsen.

Konjugeringstrinnet mellom alkynen i propargyllysinen og en representativ syntetisk oligosakkarid Pn14TS relatert til en pneumokokkkapsel og bærer en komplementær azid ble utført i henhold til en klikkkjemiprotokoll rapportert av Presolski et al.20 Om nødvendig kan fullføring av reaksjonen lett nås ved å øke reaksjonstiden eller ved å endre forholdet mellom alkyne, azide og kobberreaktanter og reagenser. Kobbersalter elimineres ved behandling med overflødig EDTA etterfulgt av en kort rensing av sterisk eksklusjon kromatografi.

Glykokonjugatet oppnådd med teknikken som er beskrevet i det nåværende arbeidet, kan deretter brukes til å immunisere mus. Å ha en slik fullt definert og lett modulert glykokonjugat i hendene gir uvurderlige verktøy for å evaluere virkningen av hapten / protein carrier tilkobling på immunrespons8. Siden økende hapten / protein forholdet er ofte korrelert med forbedret anti-hapten humoral respons når du bruker korte haptens30, man kan være interessert i å teste konjugater med flere haptens. Inkorporering av flere UAAer trenger imidlertid noen justeringer av protokollen som inkorporering av en UAA i proteinet har en tendens til å redusere utbyttet av proteinproduksjon på grunn av RF1-aktiviteten.

I definitivt er denne metoden et kraftig verktøy for å få tilgang til homogene glykokonjutere vaksiner som letter deres fysikalske-kjemiske karakterisering og ytterligere karbohydratantigen / bærer tilkobling-immunogenitetsforholdsstudier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

E.C. anerkjenner takknemlig den økonomiske støtten fra La Région Pays de la Loire (Pari Scientifique Program "BioSynProt"), spesielt et doktorgradsfellesskap til T.V. Vi anerkjenner også Dr Robert B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, Toulouse, Frankrike) for hans dyrebare tekniske råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AIM (autoinductif medium) Formedium AIMLB0210 Solid powder
Boc-Lys-OH Alfa-Aesar H63859 Solid powder
BL21(DE3) Merck Novagen 69450 E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin Machery Nagel Protino Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH this study same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT this study pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19) plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate Sigma-Aldrich 460923 Liquid
Sonicator Thermo Fisher FB120-220

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. WIPO. Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids. , https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS)&maxRec=11858 (2018).
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. Oller-Salvia, B. Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019).
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Tags

Bioengineering Utgave 166 syntetisk biologi homogen glykokonjugat stedselektiv biokonjugering unaturlig aminosyre genetisk kodeutvidelse klikkkjemi propargyl-l-Lysin karbohydrat
Homogen glykokonjugat produsert av kombinert unaturlig aminosyre inkorporering og klikk-kjemi for vaksineformål
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., … More

Violo, T., Dussouy, C., Tellier, C., Grandjean, C., Camberlein, E. Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes. J. Vis. Exp. (166), e60821, doi:10.3791/60821 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter