Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Massespektrometristyrt genomgruvedrift som et verktøy for å avdekke nye naturlige produkter

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60825
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), 2Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

Summary

En massespektrometristyrt genomgruveprotokoll er etablert og beskrevet her. Den er basert på informasjon om genomsekvens og LC-MS/MS-analyse og har som mål å lette identifiseringen av molekyler fra komplekse mikrobielle og planteekstrakter.

Abstract

Det kjemiske rommet dekket av naturlige produkter er enormt og allment ukjent. Derfor er praktiske metoder for å utføre omfattende evaluering av sine funksjoner i naturen og potensielle menneskelige fordeler (f.eks. for narkotikaoppdagelsesapplikasjoner) ønsket. Denne protokollen beskriver kombinasjonen av genomgruvedrift (GM) og molekylært nettverk (MN), to samtidige tilnærminger som samsvarer med genklyngekodet merknader i hele genomsekvensering med kjemiskstruktursignaturer fra rå metabolske ekstrakter. Dette er det første skrittet mot oppdagelsen av nye naturenheter. Disse begrepene, når de brukes sammen, er definert her som MS-guidet genomgruvedrift. I denne metoden er hovedkomponentene tidligere utpekt (ved hjelp av MN), og strukturelt relaterte nye kandidater er forbundet med genomsekvensmerknader (ved hjelp av GM). Kombinere GM og MN er en lønnsom strategi for å målrette nye molekyl ryggbein eller høste metabolske profiler for å identifisere analoger fra allerede kjente forbindelser.

Introduction

Undersøkelser av sekundær metabolisme består ofte av screening av råoljeekstrakter for spesifikke biologiske aktiviteter etterfulgt av rensing, identifikasjon og karakterisering av bestanddelene som tilhører aktive fraksjoner. Denne prosessen har vist seg å være effektiv, fremme isolasjon av flere kjemiske enheter. Men i dag er dette sett på som umulig, hovedsakelig på grunn av de høye gjenoppdagelsene. Som den farmasøytiske industrien revolusjonert uten kunnskap om rollene og funksjonene til spesialiserte metabolitter, ble deres identifikasjon utført under laboratorieforhold som ikke nøyaktig representerer natur1. I dag er det en bedre forståelse av naturlige signalpåvirkninger, sekresjon og tilstedeværelsen av de fleste mål ved undetectably lave konsentrasjoner. I tillegg vil regulering av prosessen hjelpe fagmiljøet og farmasøytisk industri til å dra nytte av denne kunnskapen. Det vil også være til nytte for forskning som involverer direkte isolering av metabolitter relatert til stille biosyntetiske genklynger (BGCs)2.

I denne sammenheng har fremskritt i genomisk sekvensering fornyet interessen for screening av mikroorganismemetabolitter. Dette er fordi analyse av genomisk informasjon om avdekkede biosyntetiske klynger kan avsløre gener koding nye forbindelser som ikke er observert eller produsert under laboratorieforhold. Mange mikrobielle hele genomprosjekter eller utkast er tilgjengelige i dag, og antallet vokser hvert år, noe som gir massive utsikter for å avdekke nye bioaktive molekyler gjennom genomgruvedrift3,4.

Atlas of Biosynthetic Gene Clusters er den nåværende største samlingen av automatisk utvunnet genklynger som en del av den integrerte mikrobielle genomer plattformen til Joint Genome Institute (JGI IMG-ABC)2. Senest har minimumsinformasjonen for biosyntetiske genklynger (MIBiG) standardiseringsinitiativ fremmet manuell reannotasjon av BGCer, noe som gir et svært kuratert referansedatasett5. I dag er mange verktøy tilgjengelig for å muliggjøre beregningsmessig gruvedrift av genetiske data og deres forbindelse til kjente sekundære metabolitter. Ulike strategier har også blitt utviklet for å få tilgang til nye bioaktive naturlige produkter (dvs. heterologøst uttrykk, mål gensletting, in vitro rekonstituering, genomsekvens, isotop-guidet screening [genomisotopisk tilnærming], manipulering av lokale og globale regulatorer, resistens målbasert gruvedrift, kulturuavhengig gruvedrift, og, mer nylig, MS-guidet / kode tilnærminger2,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15).

Genomgruvedrift som en enestående strategi krever innsats for å kommentere en enkelt eller liten gruppe molekyler; Dermed forblir hull i prosessen der nye forbindelser prioriteres for isolasjon og strukturbelysning. I prinsippet retter disse tilnærmingene seg bare mot én biosyntetisk vei per eksperiment, og resulterer dermed i en langsom oppdagelsesfrekvens. I denne forstand, ved hjelp av GM sammen med en molekylær nettverk tilnærming representerer et viktig fremskritt for naturlig produktforskning14,15.

Allsidigheten, nøyaktigheten og den høye følsomheten til flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) gjør det til en god metode for sammensatt identifikasjon. Foreløpig har flere plattformer investert algoritmer og programvaresuiter for umålrettede metabolomikk16,17,18,19,20. Kjernen i disse programmene inkluderer funksjonsdeteksjon (toppplukking)21 og toppjustering, noe som gjør det mulig å matche identiske funksjoner på tvers av en gruppe prøver og søke etter mønstre. MS mønsterbaserte algoritmer22,23 sammenligner karakteristiske fragmenteringsmønstre og samsvarer med MS2-likheter som genererer molekylære familier som deler strukturelle funksjoner. Disse funksjonene kan deretter fremheves og grupperes, og gir muligheten til raskt å oppdage kjente2og ukjente molekyler fra et komplekst biologisk ekstrakt av tandem MS2,24,,25. Derfor er tandem MS en allsidig metode for å få strukturell informasjon om flere kjemotyper som finnes i en stor mengde data samtidig.

Den globale naturlige produkter social molecular networking (GNPS)26 algoritmen bruker normalisert fragment ioner intensitet for å konstruere flerdimensjonale vektorer, der likheter sammenlignes ved hjelp av en cosinusfunksjon. Forholdet mellom ulike overordnede ioner tegnes inn i en diagramrepresentasjon, der hver fragmentering visualiseres som en node (sirkler), og sammenhengen til hver node defineres av en kant (linjer). Den globale visualiseringen av molekyler fra en enkelt kilde er definert som et molekylært nettverk. Strukturelt divergerende molekyler som fragmenterer unikt vil danne sin egen spesifikke klynge eller konstellasjon, mens relaterte molekyler klynger seg sammen. Clustering kjemotyper tillater hypotetisk tilkobling av lignende strukturelle funksjoner til deres biosyntetiske opprinnelse.

Kombinere både kjemotype-til-genotype og genotype-til-kjemotype tilnærminger er kraftig når du oppretter bioinformatikk koblinger mellom BGCs og deres små molekylprodukter27. Derfor er MS-guidet genomgruvedrift en rask metode og lav materialkrevende strategi, og det bidrar til å bygge bro over foreldreioner og biosyntetiske veier avslørt av WGS av en eller flere stammer under ulike metabolske og miljømessige forhold.

Arbeidsflyten til denne protokollen (Figur 1) består av fôring AV WGS-data til en biosyntetisk genklyngemerknadsplattform som antiSMASH28,,29,30. Det bidrar til å estimere mangfoldet av forbindelser og klasse av forbindelser kodet av genomet. En strategi for å målrette en biosyntetisk genklynge som koding en kjemisk enhet av interesse må vedtas, og kulturekstrakter fra en vill type stamme og / eller heterologous stamme som inneholder BGC kan analyseres for å generere grupperte ioner basert på likheter ved hjelp av GNPS26,31. Følgelig er det mulig å identifisere nye molekyler som forbinder med målrettet BGC og er utilgjengeligi databasen (hovedsakelig ukjente analoger, noen ganger produsert i lave titers). Det er relevant å vurdere at brukerne kan bidra til disse plattformene, og at tilgjengeligheten av bioinformatikk og MS/ MS-data øker raskt, og driver til en konstant utvikling og oppgradering av effektive beregningsverktøy og algoritmer for å veilede effektive forbindelser av komplekse ekstrakter med molekyler.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over hele arbeidsflyten. Vist er en illustrasjon av bioinformatikk, kloning og molekylære nettverkstrinn involvert i den beskrevne MS-guidede genomgruvetilnærmingen for å identifisere nye metabolitter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne protokollen beskriver en rask og effektiv arbeidsflyt for å kombinere genomgruvedrift og molekylært nettverk som utgangspunkt for den naturlige produktoppdagelsesrørledningen. Selv om mange applikasjoner er i stand til å visualisere sammensetningen og sammenhengen til MS-påviselige molekyler i ett nettverk, er flere vedtatt her for å visualisere strukturelt lignende grupperte molekyler. Ved hjelp av denne strategien, romanen cyclodepsipeptid produkter observert i metabolske ekstrakter av Streptomyces sp. CBMAI 2042 er vellykket identifisert. Guidet av genom gruvedrift, hele biosyntetiske genklynge koding for valinomycins er anerkjent og klonet inn i produsenten stamme Streptomyces coelicolor M1146. Til slutt, etter et MS-mønsterbasert molekylært nettverk, er molekylene som oppdages av MS korrelert med BGCs ansvarlig for deres biogenesis32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Genomgruvedrift for biosyntetiske genklynger

  1. Utfør hele genomsekvensering (WGS) som det første trinnet for å velge en biosyntetisk genklynge (BCG) for MS-styrt genomgruvedrift. Hele genomutkastet av belastningen av interesse (bakterier) kan oppnås av Illumina MiSeq-teknologi ved hjelp av følgende med genomisk DNA av høy kvalitet: hagle TruSeq PCR-Free library prep og Nextera Mate Pair Library Preparation Kit33.
    MERK: Etter sekvensering kan Illumina haglebibliotek og Illumina mate parbibliotek monteres ved hjelp av Newbler v3.0 (Roche, 454) assembler program (funnet på ) og kommentert ved hjelp av en rørledning basert på FgeneSB (funnet på ), som beskrevet tidligere33. Mikrobiologi Resource Announcements (MRA) er en fullstendig åpen tilgangsjournal med artikler som publiserer tilgjengeligheten av mikrobiologisk ressurs som deponeektes i et tilgjengelig repositorium (finnes på ). Kandidaten protein-koding gener identifiseres ved hjelp av RAST server merknad34, og Hele Genome Shotgun (WGS) prosjektet er deponert i DDBJ/ENA/GenBank (funnet på ) og Gold (funnet på ) sekvens databaser.
  2. For å få i silico informasjon om sekundær metabolisme genklynger merknader fra en fullstendig sekvensert genom, send sekvensfilen (GenBank / EMBL eller FASTA-format) til en antiSMASH plattform (funnet på ).
  3. Velg genklyngen av interesse fra utgangsdata (figur 2) basert på den mest kjente klyngen.
    MERK: For det første er det rutine å utforske gen for gen og gjennomføre individuelle søk (blastp) for å vurdere hvilke funksjoner som er forbundet med de ønskede biosyntetiske gengruppene. Denne fremgangsmåten kan også bidra til å avgjøre hvilke BGC som sannsynligvis er forbundet med produksjonen av en ønsket forbindelse, selv om det er en lav prosentandel. En antiSMASH prediksjon vurderer alle gener i en klynge for å gjøre prosentvis dekning, noe som kan representere en global lav prosentandel av likhet for den siktede BGC. Men når du analyserer gen-for-gen, er det mulig å få mer nøyaktig informasjon ved hjelp av den mest lignende kjente klyngen. For det andre har antiSMASH to alternativer for å avgrense et søk: 1) deteksjonsstrenghet: graden av strenghet som den biosyntetiske genklyngen må betraktes som en hit. For dette alternativet bør brukeren bruke følgende parametere: a) strenge: oppdager utelukkende veldefinerte klynger som inneholder alle nødvendige regioner, uutsatt for feil om genetisk informasjon; b) avslappet: oppdager delvise klynger mangler en eller flere funksjonelle regionen, som også fungerer for å oppdage den strenge funksjonen; eller c) løs: oppdager dårlig definerte klynger og klynger som sannsynligvis samsvarer med primære metabolitter, noe som kan føre til utseende av falske positiver eller dårlig definerte BGCer. Det andre alternativet er 2) ekstra funksjoner: typen informasjon plattformen må søke etter og vise i utdataene. Generelt kan disse to alternativene spare tid etter forutsigelsen. AntiSMASH-jobben krever imidlertid en lengre tidsperiode.

Figure 2
Figur 2: Utgang fra antiSMASH-plattformen. Sekundær metabolisme i silico analyse fra hele genom sekvens merknad. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Basert på DNA-sekvensinformasjon fra BGC, design primere (20–25 nt) flankerer genklyngen for ESAC (E. coli/Streptomyces Kunstig kromosom) bibliotekscreening.
    MERK: Ulike metoder35,36 kan brukes til å fange hele biosyntetisk genklynge fra DNA. Her er metoden som brukes bygging av et representativt ESAC-bibliotek37,38 fra Streptomyces sp. CBMAI 2042 som inneholder kloner med gjennomsnittlig størrelse fragmenter på ~ 95 kb.

2. Heterologous uttrykk for hele biosyntetiske genklynge fra ESAC biblioteket

  1. Flytt ESAC-vektoren fra E. coli DH10B til E. coli ET12567 ved triparental konjugering32.
    1. Inokulere E. coli ET12567 (CamR), TOPO10/pR9604 (CarbR), DH10B/ESAC4H (AprR) i 5 ml Luria-Bertani (LB) medium som inneholder kloramfenikol (25 μg/ml), karbenicillin (100 μg/ml) og pramycin (50 μg/ml).
    2. Inkuber kulturen over natten ved 37 °C og 250 o/min.
    3. Inokulere 500 μL av overnattingskulturen i 10 ml LB-medium som inneholder en halv konsentrasjon av antibiotika.
    4. Inkuber kulturen ved 37 °C og 250 o/min til en A600 på 0,4–0,6.
    5. Høst cellene ved sentrifugering på 2200 x g i 5 min.
    6. Vask cellene to ganger med 20 ml LB medium.
    7. Resuspender cellene i 500 μL lb medium.
    8. Bland 20 μL av hver stamme i et mikrocentrifugerør og drypp inn i en agarplate med LB medium som mangler antibiotika.
    9. Inkuber platene ved 37 °C over natten.
    10. Streak de dyrkede cellene på en frisk LB agar plate som inneholder antibiotika og inkubere ved 37 °C over natten.

3. Streptomyces/E. coli bøyning

  1. For å få den rekombinante heterologøse organismen, utfør bøyning32 mellom E. coli ET12567 som inneholder ESAC-vektoren, hjelperen plasmid pR9604 og Streptomyces koelicolor M1146 eller en annen valgt vertsstamme39.
  2. Dag 1: Inokulere isolerte kolonier av S. koelicolor M1146 i 25 ml TSBY medium i en 250 ml Erlenmeyer kolbe utstyrt med en inox-våren ved 30 °C og 200 rpm i 48 timer.
  3. Dag 2/3: Inokulere ET12567/ESAC/pR9604 i 5 ml LB-medium som inneholder kloramfenin (25 μg/ml), karbenicillin (100 μg/ml) og apramycin (50 μg/ml) over natten ved 37 °C og 250 o/min.
  4. Dag 3/4: Inokuler500 μL av overnattingskulturen i 10 ml 2TY (i et 50 ml konisk rør) som inneholder halvekonsentrasjoner av antibiotika. Inkuber ved 37 °C og 250 o/min til enA 600 på 0,4–0,6.
  5. Sentrifugerkulturene (ET12567/ESAC/pR9604 og M1146) ved 2200 x g i 10 min.
  6. Vask pellets 2x i 20 ml 2TY medium og resuspend i 500 μL av 2TY.
  7. Aliquot 200 μL av S. koelicolor M1146 suspensjon og fortynn i 500 μL av 2TY (suspensjon A).
  8. Aliquot 200 μL suspensjon A og fortynn i 500 μL 2TY (suspensjon B).
  9. Aliquot 200 μL suspensjon B og fortynn i 500 μL 2TY (suspensjon C).
  10. Aliquot 200 μL av ET12567/ESAC/pR9604 suspensjon og bland med 200 μL suspensjon C.
  11. Plate 150 μL av konjugeringsblandingen på en SFM agarplate som mangler antibiotika.
  12. Inkuber ved 30 °C i 16 timer.
  13. Dekkplater med 1 ml antibiotikaløsning (i henhold til plasmidresistens). Etter tørking, inkuber ved 30 °C i 4–7 dager.
    MERK: Her ble det utarbeidet en løsning som inneholder 1,0 mg/ml tiostrepton og 0,5 mg/ml nalidiksicsyre.
  14. Strekputative ekskonjuganter på SFM agarplater som inneholder tiostrepton (50 mg/ml) og nalidiksik syre (25 mg/ml). Inkuber ved 30 °C.
  15. Strekeksonianter på en SFM-agar som bare inneholder nalidikssyre.
  16. Utfør PCR-analyse med isolerte kolonier for å bekrefte at hele genklyngen er overført til S. coelicolor M1146-verten.

4. Stamme dyrking

  1. For å oppnå metabolsk profil, inokulere 1/100 av stammens pre-kultur i passende gjæringsmedier og under de riktige kulturforholdene.
  2. Sentrifugekulturer på 2200 x g i 10 min.
  3. Utfør utvinningen i henhold til klassen av sammensatt av interesse40.

5. Anskaffe massespektra og forberedelse til GNPS analyse

  1. For å skaffe MS / MS-data, program egnet HPLC og massespektrometri metoder ved hjelp av kontrollprogramvare. Både høy og lav oppløsning dataavhengig massespektrometrianalyse (DDA) kan analyseres.
    MERK: Vanligvis er en 1 mg/ml løsning av komplekse råekstraktprøver ideell. Fortynninger er nødvendig for mindre komplekse ekstrakter. Det bør bemerkes at MS / MS-nettverk er det påviselige molekylære nettverket under de gitte massespektrometriske forholdene.
  2. Konverter massespektra til MZXML-format ved hjelp av MSConvert fra Proteowizard (funnet på ). Inndataparameterne for konverteringen er illustrert i figur 3. Data fra programvare fra nesten alle selskaper er kompatible.

Figure 3
Figur 3: Bruke MsConvert til å konvertere MS-filer til mzXML-utvidelse. Den riktige parameteren for GNPS-analyse vises. Instruksjonene er som følger: Legg til alle MS-filer i boks 1 og legg til filteret Peak Picking i boks 2; for dette filteret, bruker du algoritmeleverandøren. trykk start og prosessene for konvertering vil følge. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Last opp de konverterte LC-MS/MS-filene til GNPS-databasen. To alternativer er tilgjengelige: ved hjelp av en filoverføringsprotokoll (FTP) eller direkte i en nettleser via den elektroniske plattformen.
    MERK: Detaljert informasjon om hvordan du installerer og overfører data til GNPS er tilgjengelig på .

6. GNPS-analyse

  1. Når du har opprettet en konto i GNPS (funnet på ), logger du på den opprettede kontoen, opprett molekylært nettverk. Legg til en stillingstittel.
  2. Grunnleggende alternativer: Velg mzXML-filene for å utføre det molekylære nettverket. De kan organiseres i opptil seks grupper. Velg bibliotekene for dereplication-rutinen (Figur 4).
    MERK: Disse gruppene forstyrrer ikke molekylær nettverksbygging. Denne informasjonen vil kun bli brukt til den grafiske representasjonen.

Figure 4
Figur 4: Bruke online GNPS-plattform til å utføre molekylær nettverksanalyse. Valg av mzXML-filer gjøres ved å klikke i boks 1. I dialogboksen Åpne kan filene velges fra personlig mappe (boks 2) eller lastes opp i den andre kategorien ved hjelp av dra-og-slipp-filopplasteren (mindre enn 20 MB). Filene kan grupperes i opptil seks grupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Velg forløperen ion massetoleranse og fragment ion massetoleranse av 0,02 Da og 0,05 Da, henholdsvis.
    MERK: GNPS har ulike typer strenghet tilgjengelig basert på 1) hvor nøyaktig MS / MS-dataene er og 2) hvor nøyaktig tilknytningen må være. Grunnleggende alternativer: i denne mappen er det mulig å sette Forløper Ion Mass Tolerance og Fragment Ion Mass Tolerance. Disse parametrene brukes som en veiledning for å finne ut hvor nøyaktig forløperen ion og fragmentering må være. De valgte massetoleransene avhenger av oppløsningen og nøyaktigheten til massespektrometeret som brukes.
  2. Avanserte nettverksalternativer: Velg parameterne i henhold til figur 5. Disse parameterne påvirker direkte nettverksklyngestørrelsen og -skjemaet. En annen parameter i delen gjenværende faner er for avanserte brukere. dermed forlate standardverdiene.
    MERK: Avanserte parametere kan leses i GNPS-dokumentasjon (funnet på ).

Figure 5
Figur 5: Bruke GNPS til å utføre molekylær nettverksanalyse (avanserte alternativer). Min Pair Cos vil direkte påvirke størrelsen på klynger, da høye verdier vil resultere i å kombinere nært beslektede forbindelser og lave verdier i å kombinere fjernt-relaterte forbindelser. Bruk av verdier som er for lave bør unngås. Minimum matchet fragment ioner representerer antall delte fragmenter mellom to fragmenteringsspektra som skal kobles i nettverket. Sammen fører begge parametrene nettverksformatet; lavere verdier vil klynge mer fjernt-relaterte forbindelser og omvendt. Ved hjelp av de riktige verdiene vil i stor grad hjelpe sammensatt elucidation. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Velg en e-postadresse for å motta et varsel når arbeidet er utført, og send inn jobben.

7. Analyse av GNPS resultater

  1. Logg inn på GNPS. Velg Jobber > Publisert jobb > Ferdig for å åpne jobben. En nettside åpnes som vist i figur 6. Alle resultater fra molekylært nettverk vil bli vist.
  2. Velg Vis spektrale familier (I Browser Network Visualizer) for å se alle nettverksklynger (rød boks, Figur 6).

Figure 6
Figur 6: Bruke GNPS til å visualisere molekylære nettverksresultater. Alle relaterte sammensatte klynger kan sees i sikte spektrale familier (rød boks). Hvis du vil visualisere bare bibliotektreff, bør du velge "Vis alle bibliotektreff" (blå boks). For bedre grafisk representasjon av molekylære nettverksresultater, bør "Direct Cytoscape Preview" (gul boks) lastes ned, og den nyeste versjonen av Cytoscape bør brukes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. En liste vises med alle genererte molekylære nettverksklynger. Hvis et biblioteksøk ble valgt for å generere funnene, vises foreløpige molekylidentifikasjon i AllIDer. Velg Vis for å visualisere dem.
    MERK: Dataanalysene kan kjøres for andre resultater (dvs. genomgruvedrift, biologiske analyser, bibliotekdereplikeringsmolekyler osv.).
  2. Hvis du vil analysere den molekylære nettverksklyngen, velger du Visualiser nettverk.
    MERK: Hver klynge består av noder (sirkler) og kanter, som representerer henholdsvis molekyler og molekylær likhet. Dereplikerte molekyler vil bli fremhevet som en blå node i nettleserens nettverksvisualisator.
  3. Velg overordnet masse (rød boks, figur 7)i boksen nodeetiketter (rød boks, figur 7).
  4. I boksen kantetiketter velger du Cosine eller DeltaMZ for å observere nodelikhet eller masseforskjell mellom noder (gul boks, figur 7).
  5. Når det gjelder analyser av flere grupper, klikker du Tegn paier i nodefargeboksen for å observere frekvensen som hver node vises i hver gruppe (blå boks, figur 7).
    MERK: Andre valg er mulige, men de som foreslås ovenfor er optimale for å kommentere klyngenoder og løse strukturene sine.

Figure 7
Figur 7: Bruke GNPS til å visualisere molekylære klyngeresultater. Etter å ha åpnet molekylære klynger for bedre datavisualisering, bør følgende velges: "Overordnet masse" som nodeetiketter (rød boks); "DeltaMZ" som kantetiketter (gul boks); og "Tegn paier" som node farging (blå boks). Naviger gjennom den molekylære klyngen og prøv å kommentere alle noder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Hvis du vil se alle bibliotektreff, velger du Vis alle bibliotektreff (blå boks, Figur 7).
    MERK: MNW kan også lastes ned i "Direct Cytoscape Preview/Download" (gul boks, figur 7),og filen kan åpnes i Cytoscape-plattformen (finnes på ) for flere alternativer i grafisk struktur.
  2. Manuell bekreftelse av dereplikerte forbindelser og strukturbelysning av relaterte forbindelser er nødvendig. Åpne fragmenteringsspektra direkte i GNPS-plattformen eller i originale raw-filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen ble vellykket eksemplifisert ved hjelp av en kombinasjon av genomgruvedrift, heterologous uttrykk, og MS-guidede / kode tilnærminger for å få tilgang til nye spesialiserte valinomycin analoger molekyler. Genom-til-molekyl arbeidsflyt for målet, valinomycin (VLM), er representert i figur 8. Streptomyces sp. CBMAI 2042 utkast genom ble analysert i silico, og VLM genklyngen ble deretter identifisert og overført til en heterologous vert. Heterologous og vill type stammer ble dyrket i triplicate ved hjelp av riktig gjæringsforhold, partisjonert med etylacetat, og konsentrert for å generere råolje ekstrakt. Fra produktet ble MS/MS-data anskaffet for å generere en tandem MS-metabolittprofil for molekylært nettverk. Figur 9 representerer de grupperte ionene hentet fra MS/MS-data fra Streptomyces sp. CBMAI 2042 råoljeekstrakt, der karakteristiske fragmenteringsmønstre og tilsvarende MS-likheter antyder forekomsten av en molekylær familiedeling av strukturelle funksjoner2. Etter kjent biosyntetisk logikk og bioinformatikk innsikt, og støttet av mønsterbasert MS / MS spectra, strukturen av fire opprinnelig rapporterte cyklodepsipeptider var belyst, og deres opprinnelse var korrelert med de samme biosyntetiske genklynger ansvarlig for VLM montering32.

Molekylære nettverksdata (funnet på ) ble behandlet i en GNPS-plattform og deponert i et MASSIVt repositorium (MSV000083709). For dereplikering, to strategier ble valgt for å fylle ut nettverket med tidligere beskrevne forbindelser: 1) Dereplicator (funnet på ) og 2) et peptid naturlig produktidentifikasjonsverktøy kalt VarQuest (funnet ved Vår forrige publikasjon gir ytterligere detaljer32.

Figure 8
Figur 8: Arbeidsflyt fra i silico genom sekvensanalyse til MS datainnsamling. (A) Et utkast fra Streptomyces sp. CBMAI 2042 genom er oppnådd ved Illumina MiSeq sekvensering. (B) Valinomycin BGC identifikasjon og merknad. (C) Etter overføring av hele genklyngen til en passende vert, dyrkes belastningen. Etylacetatekstraktet fra kulturen analyseres av LC for å oppnå en profil av produserte sekundære metabolitter. Kromatogram viser at valinomycin, montanastatin og fem analoger er produsert av VLM BGC uttrykk i en heterologous vert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Molekylære nettverksresultater. (A) Molekylært nettverk fra Streptomyces sp. CBMAI 2042 ekstrakt. Molekylære nettverksioner som tilsvarer valinomycin, en allerede kjent forbindelse med tilsvarende BGC kommentert i Streptomyces sp. CBMAI 2042 genom, er gruppert med ioner relatert til analoger først beskrevet for VLM BGC. (B) MS-spektra og kjemiske strukturer for valinomycin og relaterte analoger vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den sterkeste fordelen med denne protokollen er dens evne til raskt å degjenskape metabolske profiler og bygge bro genominformasjon med MS-data for å belyse strukturene til nye molekyler, spesielt strukturelle analoger2. Basert på genominformasjon kan ulike fysiske produkter kjemotyper undersøkes, for eksempel polyketider (PK), ikke-ribosomale peptider (NRP) og glykoerte naturlige produkter (GNP), samt kryptiske BGCs. Metabolomic screening bevis på aktiverte BGC-profiler og kjemisk mangfold produsert av en bestemt belastning under laboratorieforhold. Dermed kan en BGC klones for å lede produksjonen av en ny sammensatt eller ukjent analoger relatert til en allerede kjent BGC, tilrettelagt av likheter oppdaget av molekylært nettverk. Derfor bidrar denne prosedyren til å skille verdifulle forbindelser produsert av naturlige kilder og kan brukes som en guide for fremtidige isolasjonstrinn, som er vanlige i naturlige produktrørledninger.

MS-guidet genom gruvedrift ble først beskrevet innen peptidogenomics41 og glykogenomics42. For å estimere omfanget av peptid naturlig produkt kjemisk mangfold, Utviklet Dorrestein og kolleger en automatisert metode ved hjelp av MS og genomikk for å visualisere sammenhengen mellom uttrykte naturlige produkter (kjemotype) og deres genklynger (genotype). Begrepet MS-guidet genomgruvedrift ble deretter beskrevet mens du bruker peptid spesialiserte metabolitter. Her ble en metode for identifisering av mikrobielle glykolære naturlige produkter (GNP) ved hjelp av en GM-tilnærming og tandem MS brukt som verktøy for raskt å koble GNP kjemotyper (fra mikrobielle metabolomer) med sine tilsvarende biosyntetiske genotyper etter sukkeravtrykk.

Begrepet peptidogenomikk har blitt brukt til å avsløre stenothricin genklynger i Streptomyces roseosporus, og gir den første innsikti den brede nytte av GNPS som en plattform43. Mønsterbasert genomgruvedrift og molekylært nettverk ble endelig kombinert med GNPS-plattformen26 for å lette dereplikering av nye forbindelser, kjente forbindelser, påvisning av nye analoger og strukturbelysning av 35 Salinispora stammer. Dette førte til isolasjon og karakterisering av retimycin A, en kinomycin-type depsipeptide44. Etter innføringen av GNPS, integrertmetabolomikk og genom gruvedrift tilnærminger har blitt den mest allsidige avenue å koble molekylære nettverk med biosyntetiske evner45,46,47,48,49,50.

Denne protokollen forsterker muligheten for å bruke genomiske og metabolomiske analyser for å undersøke produksjonen av kjente og ukjente kjemisk analoge forbindelser i noen få trinn mens forbruker lave nivåer av materialer. Modellen som presenteres her er relatert til valinomycin analog identifikasjon fra råoljeekstrakter gjennom molekylær nettverk dereplication. Strukturen av analoger utledes av MS / MS fragmentering og følger den biosyntetiske logikken til klonet VLM BGCs.

Forskjellig programvare er tilgjengelig for gruvedrift sekundær metabolitt biosyntetiske genklynger51 og for metabolittbelysning, men åpen kildekode alternativer har fordelene på grunn av konstante oppdateringer, og de er åpne for det vitenskapelige samfunnet. I denne forstand er antiSMASH og GNPS-plattformen de mest populære valgene.

Denne generelle prosedyren kan endres for andre utvinningsmetoder basert på den naturlige kilden som utforskes. Mer enn én metode for ekstraksjon kan også kombineres i henhold til metabolittegenskaper (dvs. polaritet, hydrofobiitet, evnen til å danne micelles), og til og med lignende egenskaper, forskjellige løsemidler eller harpiks kan oppnå forbedrede resultater. Vanligvis er ekstrakter utarbeidet fra flytende middels dyrking, men det er en mengde ekstraksjonsmetoder tilgjengelig for å isolere berikede ekstrakter og screene enhver biologisk prøve av interesse.

Ved innhenting av MS-data bør dataavhengig innhentingsanalyse (DDA) brukes. Dette problemet er viktig når et større antall forbindelser blir evaluert i en enkelt injeksjon. Mens du utfører DDA, bør maksimalt antall MS/MS-spektra for hver forløperion og maksimalt antall forskjellige forløperion kompenseres. Ved bruk av utstyr for rask skannehastighet kan dette oppnås med høyere skannehastigheter (~6–10 MS/MS-skanninger per syklus). I lavere skannehastighetsutstyr kan imidlertid MN-ytelsen bare økes med bedre kromatografisk oppløsning. De mest omfattende dataene for å fylle det molekylære nettverket bør innhentes. For MS-datainnhenting er fast kollisjonsenergi mulig, men rampeenergier er egnet til å gi bedre resultater. Det er ingen optimale forhold som perfekt vil fungere for alle prøver. Å oppnå tilstrekkelig MS-analyse er avgjørende for følgende trinn. Heretter bør de molekylære nettverksklyngene genereres og dereplikeres i henhold til prosedyren.

En hyppig feilsøkingsfeil mangler intensiteter for massene. Normalt kan dette løses ved å innføre høyere kollisjonsenergi under analysen. Noen ganger observeres ingen korrelasjoner mellom spektra- og GNPS-biblioteket, noe som er svært uvanlig. I dette tilfellet må du kontrollere at mappen åpnes riktig i previsualisering ms-programvaren, da feil noen ganger kan opprettes under konverteringstrinnet til MZXML-filer.

Når det gjelder genomgruvedrift, vil den mest presise produksjonen fra genklyngeannotasjonsplattformer gis for høyere kvalitet hele genomsekvensering for både, enkelt stamme eller kulturuavhengig gruvedrift. Sekvensering av høy kvalitet vil generere bioinformatikk av høy kvalitet for dereplikering av biosyntetiske veier. I motsetning, selv om BGC prediksjon bioinformatikk programvare har vært raskt utvikle, eksakte spådommer om genfunksjon og antatte produkter er fortsatt vanskelig, spesielt når du undersøker nye biosyntetiske veier og funksjoner som ikke kan forutsies i silico. Også noen biosyntetiske maskiner er påfallende bevart, mens enzymologi som er involvert i hybridsystemer, trans-AT modulære PKs, og NRPSs er anerkjent som unntak av colinearity regelen. I denne forstand kan heterologous uttrykk og forbedringer i bioinformatikk utgangsprogramvare bidra til å belyse uforutsigbare enzymfunksjoner og uvanlig biokjemi52,53,54. Berikelsen av offentlige databaser vil føre til mer presise spådommer og oppdagelse av nye spesialiserte metabolitter, da kostnaden for WGS ikke representerer handikap for genomgruvedrift.

Til slutt er de sterkeste fordelene med integrerte metabolomiske og genomgruvedrift tilnærminger knyttet til deres gjennomførbarhet til å utføre genotype og kjemotype dereplication via automatisert og høy gjennomstrømningsanalyse som forbinder genomiske, transkripsjonsmessige og metabolomiske data for å effektivt koble gener med molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Den økonomiske støtten til denne studien ble gitt av São Paulo Research Foundation - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 og 2014/50249-8 til L.G.O; 2013/12598-8 og 2015/01013-4 til R.S.; og 2019/08853-9 til C.F.F.A). B.S.P, C.F.F.A., og L.G.O. mottok stipend fra National Council for Scientific and Technological Development - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, og 313492/2017-4). L.G.O. er også takknemlig for tilskuddsstøtten fra programmet For Women in Science (2008, Brazilian Edition). Alle forfattere anerkjenner CAPES (Koordinering for forbedring av høyere utdanning personell) for å støtte ettereksamen programmer i Brasil.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Tedia AA1120-048 HPLC grade
Agar Oxoid LP0011 NA
Apramycin Sigma Aldrich A2024 NA
Carbenicillin Sigma Aldrich C9231 NA
Centrifuge Eppendorf NA 5804
Chloramphenicol Sigma Aldrich C3175 NA
Column C18 Agilent Technologies NA ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin Sigma Aldrich K1377 NA
Manitol P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Microcentrifuge Eppendorf NA 5418
Nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix ThermoFisher Scientific F548S NA
Q-TOF mass spectrometer Agilent technologies NA 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Shaker/Incubator Marconi MA420 NA
Sodium Chloride Synth NA P. A. - ACS
Soy extract NA NA NA
Sucrose Synth NA P. A. - ACS
Thermal Cycles Eppendorf NA Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton Sigma Aldrich T8902 NA
Tryptone Oxoid LP0042 NA
Tryptone Soy Broth Oxoid CM0129 NA
UPLC Agilent Technologies NA 1290 Infinity LC System
Yeast extract Oxoid LP0021 NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davies, J. Specialized microbial metabolites: functions and origins. The Journal of Antibiotics. 66 (7), Tokyo. 361-364 (2013).
  2. Ziemert, N., Alanjary, M., Weber, T. The evolution of genome mining in microbes - a review. Natural Product Reports. 33 (8), 988-1005 (2016).
  3. Zerikly, M., Challis, G. L. Strategies for the Discovery of New Natural Products by Genome Mining. ChemBioChem. 10 (4), 625-633 (2009).
  4. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Heterologous expression of natural product biosynthetic gene clusters in Streptomyces coelicolor: from genome mining to manipulation of biosynthetic pathways. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 41 (2), 425-431 (2014).
  5. Medema, M. H., et al. Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster. Nature Chemical Biology. 11 (9), 625-631 (2015).
  6. Lautru, S., Deeth, R. J., Bailey, L. M., Challis, G. L. Discovery of a new peptide natural product by Streptomyces coelicolor genome mining. Nature Chemical Biology. 1 (5), 265-269 (2005).
  7. Chiang, Y. -M., et al. Molecular Genetic Mining of the Aspergillus Secondary Metabolome: Discovery of the Emericellamide Biosynthetic Pathway. Chemistry & Biology. 15 (6), 527-532 (2008).
  8. Huang, T., et al. Identification and Characterization of the Pyridomycin Biosynthetic Gene Cluster of Streptomyces pyridomyceticus NRRL B-2517. Journal of Biological Chemistry. 286 (23), 20648-20657 (2011).
  9. Udwary, D. W., et al. Genome sequencing reveals complex secondary metabolome in the marine actinomycete Salinispora tropica. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (25), 10376-10381 (2007).
  10. Gross, H., et al. The Genomisotopic Approach: A Systematic Method to Isolate Products of Orphan Biosynthetic Gene Clusters. Chemistry & Biology. 14 (1), 53-63 (2007).
  11. Spohn, M., Wohlleben, W., Stegmann, E. Elucidation of the zinc-dependent regulation in Amycolatopsis japonicum enabled the identification of the ethylenediamine-disuccinate ([S,S ]-EDDS) genes. Environmental Microbiology. 18 (4), 1249-1263 (2016).
  12. Thaker, M. N., Waglechner, N., Wright, G. D. Antibiotic resistance-mediated isolation of scaffold-specific natural product producers. Nature Protocols. 9 (6), 1469-1479 (2014).
  13. Katz, M., Hover, B. M., Brady, S. F. Culture-independent discovery of natural products from soil metagenomes. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 43, 129-141 (2016).
  14. Quinn, R. A., et al. Molecular Networking as a Drug Discovery, Drug Metabolism, and Precision Medicine Strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (2), 143-154 (2017).
  15. Yang, J. Y., et al. Molecular Networking as a Dereplication Strategy. Journal of Natural Products. 76 (9), 1686-1699 (2013).
  16. Lommen, A. MetAlign: Interface-Driven, Versatile Metabolomics Tool for Hyphenated Full-Scan Mass Spectrometry Data Preprocessing. Analytical Chemistry. 81 (8), 3079-3086 (2009).
  17. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
  18. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
  19. Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
  20. Kuhl, C., Tautenhahn, R., Böttcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
  21. Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158, 318-328 (2007).
  22. Liu, W. -T., et al. Interpretation of Tandem Mass Spectra Obtained from Cyclic Nonribosomal Peptides. Analytical Chemistry. 81 (11), 4200-4209 (2009).
  23. Ng, J., et al. Dereplication and de novo sequencing of nonribosomal peptides. Nature Methods. 6 (8), 596-599 (2009).
  24. Liaw, C., et al. Vitroprocines, new antibiotics against Acinetobacter baumannii, discovered from marine Vibrio sp. QWI-06 using mass-spectrometry-based metabolomics approach. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  25. Kang, K. B., et al. Targeted Isolation of Neuroprotective Dicoumaroyl Neolignans and Lignans from Sageretia theezans Using in Silico Molecular Network Annotation Propagation-Based Dereplication. Journal of Natural Products. 81 (8), 1819-1828 (2018).
  26. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  27. Doroghazi, J. R., et al. A roadmap for natural product discovery based on large-scale genomics and metabolomics. Nature Chemical Biology. 10 (11), 963-968 (2014).
  28. Medema, M. H., et al. antiSMASH: rapid identification, annotation and analysis of secondary metabolite biosynthesis gene clusters in bacterial and fungal genome sequences. Nucleic Acids Research. 39, 339-346 (2011).
  29. Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43, 237-243 (2015).
  30. Blin, K., et al. antiSMASH 5.0: updates to the secondary metabolite genome mining pipeline. Nucleic Acids Research. 47, 81-87 (2019).
  31. Watrous, J., et al. Mass spectral molecular networking of living microbial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (26), 1743-1752 (2012).
  32. Paulo, B. S., Sigrist, R., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. New Cyclodepsipeptide Derivatives Revealed by Genome Mining and Molecular Networking. ChemistrySelect. 4 (27), 7785-7790 (2019).
  33. Gonzaga de Oliveira, L., Sigrist, R., Sachetto Paulo, B., Samborskyy, M. Whole-Genome Sequence of the Endophytic Streptomyces sp. Strain CBMAI 2042, Isolated from Citrus sinensis. Microbiology Resource Announcements. 8 (2), 1-2 (2019).
  34. Aziz, R. K., et al. The RAST Server: Rapid Annotations using Subsystems Technology. BMC Genomics. 9 (1), 75 (2008).
  35. Nah, H. -J., Pyeon, H. -R., Kang, S. -H., Choi, S. -S., Kim, E. -S. Cloning and Heterologous Expression of a Large-sized Natural Product Biosynthetic Gene Cluster in Streptomyces Species. Frontiers in Microbiology. 8, 1-10 (2017).
  36. Zhang, J. J., Tang, X., Moore, B. S. Genetic platforms for heterologous expression of microbial natural products. Natural Product Reports. 36 (9), 1313-1332 (2019).
  37. Alduina, R., et al. Artificial chromosome libraries of Streptomyces coelicolor A3(2) and Planobispora rosea. FEMS Microbiology Letters. 218 (1), 181-186 (2003).
  38. Jones, A. C., et al. Phage P1-Derived Artificial Chromosomes Facilitate Heterologous Expression of the FK506 Gene Cluster. PLoS One. 8 (7), 69319 (2013).
  39. Gomez-Escribano, J. P., Bibb, M. J. Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microbial Biotechnology. 4 (2), 207-215 (2011).
  40. Cannell, R. J. P. Natural Products Isolation. , Humana Press. Totowa, NJ. (1998).
  41. Kersten, R. D., et al. A mass spectrometry-guided genome mining approach for natural product peptidogenomics. Nature Chemical Biology. 7 (11), 794-802 (2011).
  42. Kersten, R. D., et al. Glycogenomics as a mass spectrometry-guided genome-mining method for microbial glycosylated molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (47), 4407-4416 (2013).
  43. Liu, W., et al. MS/MS-based networking and peptidogenomics guided genome mining revealed the stenothricin gene cluster in Streptomyces roseosporus. The Journal of Antibiotics. 67 (1), Tokyo. 99-104 (2014).
  44. Duncan, K. R., et al. Molecular Networking and Pattern-Based Genome Mining Improves Discovery of Biosynthetic Gene Clusters and their Products from Salinispora Species. Chemistry & Biology. 22 (4), 460-471 (2015).
  45. Cao, L., et al. MetaMiner: A Scalable Peptidogenomics Approach for Discovery of Ribosomal Peptide Natural Products with Blind Modifications from Microbial Communities. Cell Systems. , (2019).
  46. Chen, L. -Y., Cui, H. -T., Su, C., Bai, F. -W., Zhao, X. -Q. Analysis of the complete genome sequence of a marine-derived strain Streptomyces sp. S063 CGMCC 14582 reveals its biosynthetic potential to produce novel anti-complement agents and peptides. PeerJ. 7 (1), 6122 (2019).
  47. Kim Tiam, S., et al. Insights into the Diversity of Secondary Metabolites of Planktothrix Using a Biphasic Approach Combining Global Genomics and Metabolomics. Toxins. 11 (9), 498 (2019).
  48. Özakin, S., Ince, E. Genome and metabolome mining of marine obligate Salinispora strains to discover new natural products. Turkish Journal of Biology. 43 (1), 28-36 (2019).
  49. Trivella, D. B. B., de Felicio, R. The Tripod for Bacterial Natural Product Discovery: Genome Mining, Silent Pathway Induction, and Mass Spectrometry-Based Molecular Networking. mSystems. 3 (2), 00160 (2018).
  50. Maansson, M., et al. An Integrated Metabolomic and Genomic Mining Workflow To Uncover the Biosynthetic Potential of Bacteria. mSystems. 1 (3), 1-14 (2016).
  51. Blin, K., Kim, H. U., Medema, M. H., Weber, T. Recent development of antiSMASH and other computational approaches to mine secondary metabolite biosynthetic gene clusters. Briefings in Bioinformatics. 20 (4), 1103-1113 (2019).
  52. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS-NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  53. Tatsuno, S., Arakawa, K., Kinashi, H. Analysis of Modular-iterative Mixed Biosynthesis of Lankacidin by Heterologous Expression and Gene Fusion. The Journal of Antibiotics. 60 (11), Tokyo. 700-708 (2007).
  54. Helfrich, E. J. N., Piel, J. Biosynthesis of polyketides by trans-AT polyketide synthases. Natural Product Reports. 33 (2), 231-316 (2016).

Tags

Tilbaketrekking genomgruvedrift molekylært nettverk massespektrometristyrt genomgruvedrift naturlige produkter Streptomyces,målmolekylært nettverk hele genomsekvensering
Massespektrometristyrt genomgruvedrift som et verktøy for å avdekke nye naturlige produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, … More

Sigrist, R., Paulo, B. S., Angolini, C. F. F., De Oliveira, L. G. Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products. J. Vis. Exp. (157), e60825, doi:10.3791/60825 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter