Summary
질량 분광법 유도 게놈 마이닝 프로토콜이 확립되고 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 게놈 순서 정보 및 LC-MS/MS 분석을 기반으로 하고 복잡한 미생물 및 식물 추출물에서 분자의 식별을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.
Abstract
천연 제품으로 덮인 화학 공간은 엄청나고 널리 인식되지 않습니다. 따라서, 자연에서 그 기능및 잠재적인 인간 이익(예를 들면, 약물 발견 신청을 위한)의 광범위한 평가를 수행하는 편리한 방법론이 요구된다. 이 프로토콜은 게놈 채굴(GM)과 분자 네트워킹(MN)의 조합을 설명하며, 전체 게놈 시퀀싱에서 유전자 클러스터 인코딩 주석과 조잡한 대사 추출물의 화학 구조 시그니처와 일치하는 두 가지 현대적 접근법을 설명합니다. 이것은 새로운 자연 개체의 발견을 향한 첫 번째 단계입니다. 이러한 개념은 함께 적용될 때 MS 유도 게놈 마이닝으로 정의됩니다. 이 방법에서, 주요 성분은 이전에 지정 (MN을 사용하여), 구조적으로 관련된 새로운 후보는 게놈 서열 주석 (GM을 사용하여)와 연관된다. GM과 MN을 결합하는 것은 이미 알려진 화합물에서 유사체를 식별하기 위해 새로운 분자 백본을 대상으로하거나 신진 대사 프로파일을 수확하는 수익성있는 전략입니다.
Introduction
이차 물질 대사의 조사는 수시로 활성 분획에 속하는 성분의 정제, 식별 및 특성에 선행된 특정 생물학 활동에 대한 조추출물을 검열하는 것으로 구성됩니다. 이 과정은 여러 화학 물질의 격리를 촉진, 효율적인 것으로 입증되었습니다. 그러나 요즘에는 재발견비율이 높기 때문에 실현 불가능한 것으로 보입니다. 제약 산업이 전문 대사 산물의 역할과 기능에 대한 지식없이 혁명을 일으켰기 때문에 자연을 정확하게 나타내지 않은 실험실 조건에서 식별이 수행되었습니다1. 오늘날, 자연 신호 영향의 더 나은 이해가있다, 분비, 그리고 탐지 낮은 농도에서 대부분의 대상의 존재. 또한, 프로세스의 규제는 학계 와 제약 산업이 지식을 활용하는 데 도움이 될 것입니다. 그것은 또한 침묵 하는 생 합성 유전자 클러스터와 관련 된 대사 산물의 직접 적인 격리를 포함 하는 연구 혜택을 것입니다 (BGCs)2.
이러한 맥락에서, 게놈 염기서열 분석의 발전은 미생물 대사 산물 선별에 대한 관심을 새롭게 하고 있다. 이는 발견되지 않은 생합성 클러스터의 게놈 정보를 분석하면 실험실 조건하에서 관찰또는 생성되지 않은 새로운 화합물을 코딩하는 유전자가 밝혀지므로. 많은 미생물 전체 게놈 프로젝트 또는 초안은 오늘 유효하고, 수는 게놈광업을통해 새로운 생리 활성 분자를 밝히기위한 거대한 전망을 제공, 매년 증가하고있다3,4.
생합성 유전자 클러스터의 아틀라스는 공동 게놈 연구소 (JGI IMG-ABC)의 통합 미생물 게놈 플랫폼의 구성 요소로 자동으로 채굴 된 유전자 클러스터의 현재 가장 큰 컬렉션입니다2. 가장 최근에는 생합성 유전자 클러스터(MIBiG) 표준화 이니셔티브에 대한 최소 정보로 BGC의 수동 재분석이 촉진되어 고도로 선별된 기준 데이터 집합5를제공합니다. 요즘, 많은 도구는 유전 데이터의 계산 마이닝 및 알려진된 보조 대사 산물에 그들의 연결을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 다른 전략은 또한 새로운 생리 활성 천연 제품에 액세스하기 위해 개발되었습니다 (즉, 이종 발현, 대상 유전자 삭제, 체외 재구성, 게놈 서열, 동위원소 유도 스크리닝 [genomisotopic 접근], 지역 및 글로벌 규제 기관의 조작, 저항 표적 기반 광업, 문화 독립적 인 광업, 그리고, 최근에는 MS-유도 / 코드 접근,9, 법 2,8 ,,88,, 8 , 8 ,8, 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 , 8 10,11,1212,13,14,15).
단수 전략으로 게놈 채굴은 분자의 단일 또는 작은 그룹에 추가하는 노력이 필요합니다; 따라서, 프로세스의 간격은 새로운 화합물이 격리 및 구조 해명에 대한 우선 순위를 지정하는 남아있다. 원칙적으로, 이러한 접근법은 실험당 하나의 생합성 경로만을 표적으로 하여 발견 속도가 느려집니다. 이러한 의미에서, 분자 네트워킹 접근법과 함께 GM을 사용하는 것은 천연물 연구에 대한 중요한 진보를 나타낸다14,,15.
액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)의 다기능성, 정확도 및 고감도는 화합물 식별을 위한 좋은 방법입니다. 현재, 여러 플랫폼은 비 표적 대사체학16,,17,,18,19,,20에대한 알고리즘및소프트웨어 제품군을 투자했다. 이러한 프로그램의 핵심에는 피처 감지(피크 피킹)21 및 피크 정렬이 포함되어 있어 샘플 배치에서 동일한 피처를 일치시키고 패턴을 검색할 수 있습니다. MS 패턴 기반 알고리즘22,,23은 특징적인 단편화 패턴을 비교하고 구조적 특징을 공유하는 분자 패밀리를 생성하는 MS2 유사성을 일치시다. 이러한 특징은 강조되고 군집화될 수 있으며, MS2,,24,,25에의한 복잡한 생물학적 추출물로부터 알려진 및 알려지지 않은 분자를 빠르게 발견할 수 있는 능력을 부여한다. 따라서, 탠덤 MS는 다량의 데이터에 동시에 포함된 여러 화학유형의 구조적 정보를 동시에 얻을 수 있는 다목적 방법이다.
글로벌 천연물 사회 분자 네트워킹(GNPS)26 알고리즘은 정규화된 단편 이온 강도를 사용하여 코신 함수를 사용하여 유사성을 비교하는 다차원 벡터를 구성합니다. 서로 다른 상위 이온 간의 관계는 각 조각화가 노드(원)로 시각화되고 각 노드의 유사성이 모서리(선)로 정의되는 다이어그램 표현으로 플롯됩니다. 단일 소스에서 분자의 글로벌 시각화는 분자 네트워크로 정의됩니다. 구조적으로 서로 다른 분자는 고유하게 단편화하는 분자가 그들의 자신의 특정 클러스터 또는 별자리를 형성하는 반면, 관련 분자는 함께 클러스터됩니다. 군집 화학 형은 생합성 기원에 유사한 구조적 특징의 가상 연결을 할 수 있습니다.
BGCs와 그들의 소분자 제품 사이 생물 정보학 링크를 만들 때 화학형-유전자형 및 유전자형-화학형 접근을 둘 다 결합하는 것은 강력합니다27. 따라서 MS 유도 게놈 채굴은 신속한 방법과 낮은 물질 소비 전략이며, 다양한 대사 및 환경 조건 하에서 하나 이상의 균주의 WGS에 의해 밝혀진 모이온 및 생합성 경로를 연결하는 데 도움이 됩니다.
이 프로토콜의 워크플로우(도1)는AntiSMASH,28,29,30과같은 생합성 유전자 클러스터 분석 플랫폼에 WGS 데이터를 공급하는 것으로 구성됩니다., 그것은 게놈에 의해 인코딩된 화합물 및 종류 화합물의 다양성을 추정하는 것을 돕습니다. 관심 있는 화학적 개체를 코딩하는 생합성 유전자 클러스터를 표적으로 하는 전략이 채택되어야 하며, BGC를 함유하는 야생형 균주 및/또는 이종 균주에서 배양 추출물을 분석하여 GNPS26,,31을이용하여 유사성에 기초하여 클러스터된 이온을 생성할 수 있다. 따라서, 표적 BGC와 연관되고 데이터베이스에서 사용할 수 없는 새로운 분자를 식별할 수 있습니다(주로 알려지지 않은 유사체, 때로는 낮은 적규기에서 생성). 사용자가 이러한 플랫폼에 기여할 수 있고 생물 정보학 및 MS/MS 데이터의 가용성이 급속히 증가하고 있으며, 분자와 복잡한 추출물의 효율적인 연결을 안내하는 효과적인 계산 도구 및 알고리즘의 지속적인 개발 및 업그레이드가 가능해지고 있다는 점을 고려하는 것이 관련이 있습니다.
그림 1: 전체 워크플로에 대한 개요입니다. 도시된 것은 새로운 대사산물을 식별하기 위해 기재된 MS 유도 게놈 채굴 접근법에 관여하는 생물정보학, 복제 및 분자 네트워킹 단계의 예시이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜은 게놈 채굴과 분자 네트워킹을 천연 제품 발견 파이프라인의 시작점으로 결합하는 신속하고 효율적인 워크플로우를 설명합니다. 많은 응용 프로그램이 하나의 네트워크에서 MS 검출 가능한 분자의 조성 및 관련성을 시각화할 수 있지만, 구조적으로 유사한 클러스터된 분자를 시각화하기 위해 여러 가지가 여기에 채택되었습니다. 이 전략을 사용 하 여, 연쇄상 구균 sp. CBMAI 2042의 대사 추출물에서 관찰 된 새로운 사이클로데펩티드 제품 성공적으로 확인. 게놈 채굴에 의해 유도되는, valinomycins를 위한 전체 생합성 유전자 클러스터 인코딩은 생산자 균주 연쇄상 구균 Coelicolor M1146으로 인식되고 복제됩니다. 마지막으로, MS 패턴 기지를 둔 분자 네트워킹에 따라, MS에 의해 검출된 분자는 그들의 생물발생32를책임지는 BGCs와 상관됩니다.
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Protocol
1. 생합성 유전자 클러스터용 게놈 채굴
- MS 유도 게놈 채굴을 위한 생합성 유전자 클러스터(BCG)를 선출하는 첫 번째 단계로 전체 게놈 시퀀싱(WGS)을 수행합니다. 관심균(박테리아)의 전체 게놈 드래프트는 고품질 게놈 DNA를 이용한 일루미나 미세크 기술에 의해 얻어질 수 있다: 산탄총 TruSeq PCR-프리 라이브러리 준비 및 넥스트세라 메이트 페어 라이브러리 준비 키트33.
참고: 시퀀싱 후, 일루미나 산탄총 라이브러리와 일루미나 메이트 페어 라이브러리는 Newbler v3.0(로슈, 454) 어셈블러 프로그램 (에서 발견 - 완전한 시퀀싱 된 게놈에서 이차 대사 유전자 클러스터 주석에 대한 실리코 정보를 얻으려면 antiSMASH 플랫폼 (http://antismash.secondarymetabolites.org/>)에 시퀀스 파일 (GenBank/ EMBL 또는 FASTA 형식)을 제출하십시오.
- 가장 유사한 공지된 클러스터를 기반으로 출력데이터(도 2)에서관심 있는 유전자 클러스터를 선택한다.
참고: 첫째, 유전자별 탐구하고 개별적인 검색을 수행하는 것이 일상적입니다 (blastp) 어떤 기능이 원하는 생합성 유전자 그룹과 연관되어 있는지 평가합니다. 이 절차는 또한 BGC가 낮은 백분율인 경우에도 원하는 화합물의 생산과 관련이 있는 것을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. antiSMASH 예측은 목표된 BGC를 위한 유사성의 글로벌 낮은 백분율을 나타낼 수 있는 백분율 엄호를 만들기 위하여 클러스터 내의 모든 유전자를 고려합니다. 그러나, 유전자별 분석시, 가장 유사한 공지된 군집을 사용하여 보다 정확한 정보를 얻을 수 있다. 둘째, antiSMASH는 검색을 구체화하는 두 가지 옵션이 있습니다: 1) 검출 엄격성: 생합성 유전자 클러스터가 히트로 간주되어야 하는 엄격성의 정도. 이 옵션의 경우 사용자는 다음 매개 변수를 사용해야 합니다: a) 엄격한: 유전 정보에 대한 오류에 취약하게 필요한 모든 영역을 포함하는 독점적으로 잘 정의된 클러스터를 감지합니다. b) 완화: 하나 이상의 기능 영역이 누락된 부분 클러스터를 감지하여 엄격한 기능을 감지하는 데도 작동합니다. 또는 c) 느슨한: 거짓 긍정 또는 잘못 정의 된 BGCs의 모양으로 이어질 수 있는 기본 대사 산물일치 가능성이 잘못 정의 된 클러스터 및 클러스터를 감지 합니다. 다른 옵션은 2) 추가 기능: 플랫폼이 검색하고 출력에 표시해야 하는 정보의 유형입니다. 일반적으로 이러한 두 옵션은 예측 후 시간을 절약할 수 있습니다. 그러나 antiSMASH 작업에는 더 긴 기간이 필요합니다.
그림 2: antiSMASH 플랫폼에서 출력. 전체 게놈 서열 부순 의 실리코 분석에서 이차 대사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- BGC의 DNA 서열 정보에 기초하여, ESAC(대장균/연쇄상구균 인공 염색체)E. coli라이브러리 스크리닝을 위한 유전자 클러스터측면(20-25 nt)을 설계프라이머(20-25 nt)로 한다.Streptomyces
참고: 다른 방법35,,36은 DNA로부터 전체 생합성 유전자 클러스터를 포착하는데 사용될 수 있다. 여기서, 사용되는 방법은 연수생에서 대표적인 ESAC 라이브러리37,,38을 시공하여 평균 크기 단편을 가진 클론을 함유하는 CBMAI 2042 ~95 kb이다.
2. ESAC 라이브러리에서 전체 생합성 유전자 클러스터의 이종 발현
- ESAC 벡터를 대장균 DH10B에서 대장균 ET12567로 삼부모 연상32로이동합니다.
- E를 접종합니다. 대장균 ET12567 (CamR), TOPO10 /pR9604 (탄수화물), DH10B / ESAC4H (4 월) 루리아 - 베르타니 (LB) 5 mL에서 클로람페니콜 (25 μg / mL), 카르베니실린 (100 μg / mL), 및 아프레미신 (50 μg / mL)을 함유하고 있습니다.
- 37°C 및 250 rpm에서 밤새 배양배양한다.
- 항생제의 반 농도를 포함하는 LB 배지의 10 mL에서 하룻밤 배양의 500 μL을 접종한다.
- 0.4-0.6의 A600에 도달할 때까지 37°C 및 250 rpm에서 배양한다.
- 5 분 동안 2,200 x g에서 원심 분리하여 세포를 수확하십시오.
- LB 배지의 20 mL로 세포를 두 번 씻으하십시오.
- LB 배지의 500 μL에서 세포를 다시 중단시다.
- 각 균주의 20 μL을 미세 원심 분리튜브에 넣고 항생제가 부족한 LB 배지로 한천 판에 떨어뜨립니다.
- 플레이트를 밤새 37°C에서 배양합니다.
- 자란 세포를 항생제를 함유하는 신선한 LB 한천 플레이트 상에 줄무늬하고 밤새 37°C에서 배양한다.
3. 연쇄상 구균/대장균 컨쥬게이션
- 재조합 이종성 유기체를 얻으려면, ESAC 벡터, 헬퍼 플라스미드 pR9604 및 스트렙토마이스 coelicolor M1146 또는 다른 선택된 숙주 균주 39를 포함하는 대장균 ET12567 사이의 컨쥬게이션(32)을 수행한다.32 39
- 1일차: 250 mL 에를렌마이어 플라스크에서 TSBY 배지의 25 mL에서 S. coelicolor M1146의 고립된 콜로니를 30°C에서 이녹스-스프링과 48시간 동안 200 rpm으로 접종하였다.
- 2일/3일: 클로람페니콜(25 μg/mL), 카르베니실린(100 μg/mL), 아프라미신(50 μg/mL)을 함유한 LB 배지 5mL에서 37°C 및 250rpm에서 하룻밤 동안 ET12567/ESAC/pR9604를 접종합니다.
- 일 3/4: 항생제의 반 작업 농도를 포함하는 2TY (50 mL 원추형 튜브)의 10 mL에서 하룻밤 배양의 500 μL을 접종. 37°C및 250 rpm에서 배양하여 0.4-0.6의 A600에 도달할 때까지 배양합니다.
- 10 분 동안 2200 x g에서 배양 (ET12567 / ESAC / pR9604 및 M1146)을 원심 분리기.
- 펠릿을 2TY 배지의 20 mL에서 2x 로 세척하고 2TY의 500 μL에서 다시 중단하십시오.
- S. coelicolor M1146 현탁액의 알리쿼트 200 μL및 2TY(현탁액 A)의 500 μL에서 희석하였다.
- Aliquot 200 μL의 현탁액 A및 2TY(현탁액 B)의 500 μL에서 희석하였다.
- Aliquot 200 μL의 현탁액 B및 2TY(현탁액 C)의 500 μL에서 희석하였다.
- ET12567/ESAC/pR9604 서스펜션의 Aliquot 200 μL을 200 μL의 서스펜션 C와 혼합합니다.
- 항생제가 결여된 SFM 한천 판에 컨쥬게이션 혼합물의 플레이트 150 μL.
- 16 시간 동안 30 °C에서 배양하십시오.
- (플라스미드 저항에 따라) 항생제 용액 의 1 mL로 접시를 덮습니다. 건조 후, 4-7일 동안 30°C에서 배양한다.
참고: 여기서, 1.0 mg/mL 티오트레프톤 및 0.5 mg/mL 나리딕산을 함유하는 용액을 제조하였다. - 티오스트렙톤(50 mg/mL)과 나리딕산(25 mg/mL)을 함유한 SFM 한천 플레이트에 연속적으로 넣은 참을제. 30 °C에서 배양하십시오.
- Nalidixic 산만 을 포함하는 SFM 한천에 행진 exconjugants.
- 분리된 콜로니를 사용하여 PCR 분석을 수행하여 전체 유전자 클러스터가 S. coelicolor M1146 숙주로 옮겨졌는것을 확인합니다.
4. 균주 재배
- 신진 대사 프로파일을 얻으려면 적절한 발효 매체및 적절한 배양 조건 하에서 균주의 사전 배양1/100을 접종합니다.
- 원심분리기 배양분은 2200 x g에서 10분.
- 관심있는화합물(40)의클래스에 따라 추출을 수행한다.
5. GNPS 분석을 위한 질량 스펙트럼 및 준비 획득
- MS/MS 데이터를 수집하려면 제어 소프트웨어를 사용하여 적합한 HPLC 및 질량 분석 방법을 프로그래밍합니다. 고분해능 및 저분해능 데이터 의존질량분석분석(DDA)을 모두 분석할 수 있습니다.
참고: 일반적으로 복잡한 원유 추출물 샘플의 1 mg/mL 용액이 이상적입니다. 희석은 덜 복잡한 추출물에 필요합니다. MS/MS 네트워킹은 주어진 질량 분광 조건 하에서 검출 가능한 분자 네트워크라는 점에 유의해야 합니다. - Proteowizard에서 MSConvert를 사용하여 질량 스펙트럼을 .mzXML 형식으로 변환합니다(http://proteowizard.sourceforge.net/>)에서 찾을 수 있습니다. 변환을 위한 입력 매개변수는 그림 3에나와 있습니다. 거의 모든 회사의 소프트웨어에서 데이터는 호환됩니다.
그림 3: MsConvert를 사용하여 MS 파일을 mzXML 확장명으로 변환합니다. GNPS 분석에 대한 올바른 매개변수가 표시됩니다. 지침은 다음과 같습니다 : 상자 1에있는 모든 MS 파일을 추가하고 상자 2에 피크 따기 필터를 추가합니다. 이 필터의 경우 알고리즘 공급업체를 사용합니다. 시작을 누르면 변환 프로세스가 따를 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 변환된 LC-MS/MS 파일을 GNPS 데이터베이스에 업로드합니다. 파일 전송 프로토콜(FTP)을 사용하거나 온라인 플랫폼을 통해 브라우저에서 직접 사용할 수 있습니다.
참고: GNPS로 데이터를 설치하고 전송하는 방법에 대한 자세한 정보는
6. GNPS 분석
- GNPS에서 계정을 만든 후(https://gnps.ucsd.edu/>에서 있음) 생성된 계정에 로그인하여 분자 네트워크 만들기를선택합니다. 직책을 추가합니다.
- 기본 옵션: 분자 네트워크를 수행하려면 mzXML 파일을 선택합니다. 최대 6개의 그룹으로 구성할 수 있습니다. 복제 해제 루틴에 대한 라이브러리를 선택합니다(그림4).
참고: 이 그룹은 분자 네트워크 구성을 방해하지 않습니다. 이 정보는 그래픽 표현에만 사용됩니다.
그림 4: 온라인 GNPS 플랫폼을 사용하여 분자 네트워크 분석을 수행합니다. mzXML 파일 선택은 상자 1을 클릭하여 수행됩니다. 열려 있는 대화 상자에서 파일을 개인 폴더(상자 2)에서 선택하거나 끌어서 놓기 파일 업로더(20MB 미만)를 사용하여 두 번째 탭에 업로드할 수 있습니다. 파일을 최대 6개의 그룹으로 그룹화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 전구체 이온 질량 공차와 조각 이온 질량 공차는 각각 0.02Da 및 0.05Da를 선택합니다.
참고: GNPS는 1) MS/MS 데이터의 정확도와 2) 연결이 얼마나 정확한지에 따라 다양한 유형의 엄격성을 사용할 수 있습니다. 기본 옵션: 이 폴더에서 전구체 이온 질량 공차 및 조각 이온 질량 공차를설정할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 전구체 이온 및 조각 이온이 얼마나 정확한지 결정하는 가이드로 사용됩니다. 선택한 질량 공차는 사용되는 질량 분석기의 분해능과 정확도에 따라 달라집니다. - 고급 네트워크 옵션: 그림 5에따라 매개 변수를 선택합니다. 이러한 매개 변수는 네트워크 클러스터 크기 및 양식에 직접적인 영향을 미칩니다. 나머지 탭 섹션의 또 다른 매개 변수는 고급 사용자를 위한 것입니다. 따라서 기본값을 그대로 둡니다.
참고: 고급 매개 변수는 GNPS 설명서에서 읽을 수 있습니다(https://http://http-ucsd.github.io/GNPS문서/>)에서 찾을 수 있습니다.
그림 5: GNPS를 사용하여 분자 네트워크 분석(고급 옵션)을 수행합니다. Min Pair Cos는 높은 값이 밀접하게 관련된 화합물과 먼 관련 화합물을 결합하는 낮은 값을 결합하는 결과를 초래하기 때문에 클러스터의 크기에 직접적인 영향을 미칩니다. 너무 낮은 값을 사용하는 것은 피해야 합니다. 최소 일치하는 조각 이온은 네트워크에 링크되는 두 조각화 스펙트럼 사이의 공유 조각 수를 나타냅니다. 두 매개 변수가 함께 네트워크 형식을 안내합니다. 값이 낮을수록 더 먼 관련 화합물이 클러스터되고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 적절한 값을 사용하면 화합물 해명에 크게 도움이 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 작업이 완료되면 경고를 받을 전자 메일 주소를 선택하고 작업을 제출합니다.
7. GNPS 결과 분석
- GNPS에 로그인합니다. 작업을 엽니다. Published job Done 그림 6에나와 있는 대로 웹 페이지가 열립니다. 분자 네트워킹에서 얻은 모든 결과가 표시됩니다.
- 모든 네트워크 클러스터를 보려면 [브라우저 네트워크 시각화 도우미]에서 스펙트럼 패밀리 보기를 선택합니다(빨간색 상자, 그림 6).
그림 6: GNPS를 사용하여 분자 네트워크 결과를 시각화합니다. 모든 관련 화합물 클러스터는 뷰 스펙트럼 패밀리(빨간색 상자)에서 볼 수 있습니다. 라이브러리 조회수만 시각화하려면 "모든 라이브러리 조회수 보기"(파란색 상자)를 선택해야 합니다. 분자 네트워크 결과의 더 나은 그래픽 표현을 위해, "직접 Cytoscape 미리보기"(노란색 상자)를 다운로드해야하며, Cytoscape의 최신 버전을 사용해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 생성된 모든 분자 네트워킹 클러스터와 함께 목록이 표시됩니다. 라이브러리 검색을 선택하여 결과를 생성하면 임시 분자 식별이 ALLID에 표시됩니다. 표시를 선택하여 시각화합니다.
참고: 데이터 분석은 다른 결과(즉, 게놈 채굴, 생물학적 분석, 라이브러리 복제 분자 등)를 위해 구동될 수 있습니다. - 분자 네트워크 클러스터를 분석하려면 네트워크 시각화를선택합니다.
참고: 각 클러스터는 분자와 분자 유사성을 각각 나타내는 노드(원)와 가장자리로 구성됩니다. 복제되지 제거된 분자는 온라인 브라우저 네트워크 시각화 도우미에서 파란색 노드로 강조 표시됩니다. - 노드 레이블 상자에서 상위 질량을 선택합니다(빨간색 상자, 그림 7).
- 모서리 레이블 상자에서 Cosine 또는 DeltaMZ를 선택하여 노드 간의 노드 유사성 또는 질량 차이를 각각 관찰합니다(노란색 상자, 그림 7).
- 다중 그룹 분석의 경우 노드 색칠 상자에서 파이 그리기를 클릭하여 각 노드가 각 그룹에 나타나는 빈도를 관찰합니다(파란색 상자, 그림 7).
참고: 다른 선택도 가능하지만 위에서 제안한 것들은 클러스터 노드에 추가하고 해당 구조를 해명하는 데 최적입니다.
그림 7: GNPS를 사용하여 분자 클러스터 결과를 시각화합니다. 더 나은 데이터 시각화를 위해 분자 클러스터를 연 후 다음을 선택해야합니다: 노드 레이블 (빨간색 상자)으로 "부모 질량"; 가장자리 레이블 (노란색 상자)로 "DeltaMZ"; 노드 색소(파란색 상자)로 "파이 그리기"를 사용합니다. 분자 클러스터를 탐색하고 모든 노드에 추가를 시도합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 모든 라이브러리 조회수를 보려면 모든 라이브러리 조회수 보기를 선택합니다(파란색 상자, 그림 7).
참고: 또한 MNW는 "직접 Cytoscape 미리 보기/다운로드"(노란색 상자, 그림 7)에서다운로드할 수 있으며, 그래픽 구조에서 더 많은 옵션을 보려면 Cytoscape 플랫폼(http://cytoscape.org/>)에서 파일을 열 수 있습니다. - 복제되지 않는 화합물의 수동 확인 및 관련 화합물의 구조 해명이 필요합니다. GNPS 플랫폼 또는 원본 원시 파일에서 직접 조각화 스펙트럼을 엽니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 게놈 채굴, 이종 발현 및 MS-유도/코드 접근법의 조합을 사용하여 새로운 특수 발리노마이신 유사체 분자에 액세스하는 방법을 성공적으로 예시하였다. 표적에 대한 게놈-분자 간 워크플로우, valinomycin(VLM)은 도 8에나타내고 있다. 연쇄상 구균 sp. CBMAI 2042 초안 게놈은 실리코에서 분석되고, VLM 유전자 클러스터는 그 때 이종 호스트로 확인되고 옮겨졌다. 이종및 야생형 균주는 적절한 발효 조건을 이용하여 삼중항으로 경배되었고, 에틸 아세테이트로 분할하고, 조추출물을 생성하기 위해 농축되었다. 제품으로부터, MS/MS 데이터는 분자 네트워킹을 위한 탠덤 MS 대사산물 프로파일을 생성하기 위해 인수되었다. 도 9는 Streptomyces sp. CBMAI 2042 원유 추출물로부터 MS/MS 데이터로부터 수득된 클러스터된 이온을 나타내며, 이에 대한 특징적인 단편화 패턴 및 상응하는 MS 유사성은 구조적 특징을 공유하는 분자 패밀리의 발생을 시사한다2. 알려진 생합성 논리 및 생물정보학 통찰력에 이어, 패턴 기반 MS/MS 스펙트럼에 의해 지원되고, 원래 보고된 4개의 사이클로데펩티드의 구조는 해명되었고, 그 기원은 VLM 어셈블리32를담당하는 동일한 생합성 유전자 클러스터와 상관관계가 있었다.
분자 네트워킹 데이터(http://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=6f97aa4addfa4d20b505fdb4328b088c>)에서 발견됨) GNPS 플랫폼에서 처리되어 대규모 저장소(MSV0000)에 보관되었습니다. 복제를 위해 두 가지 전략은 이전에 설명된 화합물로 네트워크를 채우기 위해 선택되었습니다: 1) 복제기(에서 찾을 수 있습니다./gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=1a5 5e768d02649aaaaa09d78d0d478ef3>) 및 2) VarQuest라는 펩티드 천연물 식별 도구 (우리의 이전 간행물에서 발견)는 자세한 내용을 제공합니다32.
그림 8: 실리코 게놈 서열 분석에서 MS 데이터 수집에 이르는 워크플로우. (A) 스트렙토마이스 sp. CBMAI 2042 게놈으로부터의 초안은 일루미나 미세크 시퀀싱에 의해 수득된다. (B)발리노마이신 BGC 식별 및 어노미. (C)전체 유전자 클러스터를 적절한 숙주에 옮김을 옮김을 옮김을 배양한 후, 균주를 경작한다. 배양으로부터의 에틸 아세테이트 추출물은 LC에 의해 분석되어 생산된 이차 대사산물의 프로파일을 얻었다. 크로마토그램은 발리노마이신, 몬타타틴 및 5개의 유사체가 VLM BGC 발현에 의해 이종 호스트에 의해 생성된다는 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: 분자 네트워킹 결과. (A) 연쇄상 구균에서 분자 네트워킹 sp. CBMAI 2042 추출물. Valinomycin에 대응하는 분자 네트워킹 이온은, Streptomyces sp. CBMAI 2042 게놈에 추가된 상응하는 BGC를 가진 이미 알려진 화합물, VLM BGC를 위해 첫째로 기술된 유사체와 관련있는 이온으로 군집됩니다. (B)VALinomycin 및 관련 유사체에 대한 MS 스펙트럼 및 화학 구조가 도시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 가장 큰 장점은 새로운 분자, 특히 구조적 유사체2의구조를 해명하기 위해 MS 데이터와 함께 대사 프로파일및 브리지 게놈 정보를 신속하게 복제하는 능력입니다. 게놈 정보에 기초하여, 다른 천연물 화학형은 폴리케타이드 (PK), 비리보소몰 펩티드 (NRP), 글리코실화 천연물 (GNP)뿐만 아니라 비밀BGC. Metabolomic 스크리닝은 실험실 조건 하에서 특정 균주에 의해 생성된 활성화된 BGC 프로파일 및 화학적 다양성의 증거를 산출합니다. 따라서, BGC는 분자 네트워킹에 의해 발견된 유사성에 의해 촉진되는 이미 알려진 BGC와 관련된 새로운 화합물 또는 알려지지 않은 유사체의 직접 생산을 복제할 수 있다. 따라서 이 절차는 천연 공급원에서 생산되는 귀중한 화합물을 구별하는 데 도움이 되며 천연 제품 파이프라인에서 흔히 볼 수 있는 향후 격리 단계에 대한 가이드로 사용될 수 있습니다.
MS-유도 게놈 채굴은 펩티도게놈41 및글리코게놈(42)분야에서 최초로 기재되었다.41 펩티드 천연물 화학적 다양성의 정도를 추정하기 위해 Dorrestein과 동료들은 MS및 유전체학을 사용하여 발현된 천연물(화학물질)과 유전자 군집(유전자 형) 간의 연결을 시각화하는 자동화된 방법을 개발했습니다. MS 유도 게놈 광업의 개념은 펩티드 전문화한 대사 산물을 사용하는 동안 기술되었습니다. 여기서, GM 접근법및 탠덤 MS를 이용한 미생물 당화 천연물(GNP)의 식별방법을 당 발자국에 따른 해당 생합성 유전자형과 GNP 항형(미생물 메타볼로메에서)을 빠르게 연결하는 도구로 적용하였다.
펩티도게놈학의 개념은 플랫폼43으로GNPS의 광범위한 유틸리티에 대한 첫 번째 통찰력을 제공하는 연쇄상 구균 로즈포러스에서스테노트리신 유전자 클러스터를 밝히기 위해 적용되었습니다. 패턴 기반 게놈 채굴 및 분자 네트워킹은 최종적으로 GNPS 플랫폼26과 결합되어 새로운 화합물, 알려진 화합물의 복제, 새로운 유사체 의 검출 및 35개의 살리니스포라 균주의 구조 해명을 용이하게 한다. 이것은 레티미신 A, 퀴노마이신 형 데시펩티드44의격리 및 특성화로 이어졌다. GNPS의 도입 후, 통합 된 대사체학 및 게놈 마이닝 접근 방식은 생합성 기능45,,46,,47,48,49,50과분자 네트워크를 연결하는 가장 다양한 방법이되었습니다.
이 프로토콜은 저급 물질을 소비하면서 몇 단계로 알려지고 알려지지 않은 화학적으로 유사한 화합물의 생산을 조사하기 위해 게놈 및 대사체 분석을 사용하는 타당성을 강화합니다. 여기에 제시된 모델은 분자 네트워킹 복제를 통해 원유 추출물에서 발리노마이신 유사체 식별과 관련이 있습니다. 유사체의 구조는 MS/MS 단편화에 의해 추론되고 복제된 VLM BGCs의 생합성 논리를 따릅니다.
다른 소프트웨어는 이차 대사 산물 생합성 유전자클러스터(51)를 채굴하고 대사산물 해명에 사용할 수 있지만, 오픈 소스 옵션은 지속적인 업데이트로 인해 장점이 있으며 과학 커뮤니티에 열려 있습니다. 이러한 의미에서 antiSMASH 및 GNPS 플랫폼이 가장 인기 있는 선택입니다.
이 일반적인 절차는 탐색된 천연 소스에 기초한 다른 추출 방법론에 대해 수정될 수 있다. 하나 이상의 추출 방법은 또한 대사 산물 특성 (즉, 극성, 소수성, 미셀을 형성하는 능력)에 따라 결합 될 수 있으며, 심지어 유사한 특성, 상이한 용매, 또는 수지 가 향상된 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 추출물은 액체 배지 재배로부터 제조되지만 농축 된 추출물을 분리하고 관심있는 생물학적 샘플을 선별하는 데 사용할 수있는 추출 방법의 과다한있다.
MS 데이터를 수집할 때 데이터 종속 수집(DDA) 분석을 사용해야 합니다. 이 문제는 화합물의 큰 수 단일 주입에서 평가 되 고 때 중요 하다. DDA를 수행하는 동안 각 전구체 이온의 최대 MS/MS 스펙트럼 수와 다른 전구체 이온의 최대 수를 보정해야 합니다. 빠른 스캔 속도 장비를 사용하는 경우, 이는 더 높은 스캔 속도(주기당 ~6-10MS/MS 스캔)로 달성될 수 있습니다. 그러나 스캔 속도가 낮은 장비에서는 크로마토그래피 해상도가 향상되어 MN 성능을 높일 수 있습니다. 분자 네트워킹을 채우는 가장 포괄적인 데이터를 얻어야 합니다. MS 데이터 수집의 경우 고정 충돌 에너지가 가능하지만 램프 에너지는 개선된 결과를 산출하는 데 적합합니다. 모든 시료에 완벽하게 작동하는 최적의 조건은 없습니다. 다음 단계에서는 충분한 MS 분석을 달성하는 것이 중요합니다. 이제부터 는 절차에 따라 분자 네트워크 클러스터를 생성하고 복제해야 합니다.
빈번한 문제 해결 오류는 대량의 강도가 없습니다. 일반적으로 해석 중에 더 높은 충돌 에너지를 도입하여 이를 해결할 수 있습니다. 경우에 따라 스펙트럼과 GNPS 라이브러리 간에 상관 관계가 관찰되지 않으며 이는 매우 드물다. 이 경우 .mzXML 파일로 변환 하는 동안 오류가 생성될 수 있는 경우 사전 시각화 MS 소프트웨어에서 폴더가 제대로 열리는지 확인합니다.
게놈 채굴과 관련하여, 유전자 클러스터 분석 플랫폼에서 가장 정확한 출력은 둘 다, 단일 균주 또는 문화 독립적 인 채굴에 대한 고품질 전체 게놈 시퀀싱을 위해 제공 될 것입니다. 고품질 염기서열 분석으로 생합성 경로의 복제를 위한 고품질 생물 정보학 통찰력을 생성합니다. 대조적으로, BGC 예측 생물 정보학 소프트웨어는 급속하게 발전하고 있더라도, 유전자 기능 및 putative 제품의 정확한 예측은 실리코에서 예측될 수 없는 새로운 생합성 통로 및 특징을 조사할 때 특히, 아직도 어렵습니다. 또한 일부 생합성 기계는 현저하게 보존되며 하이브리드 시스템, 트랜스-AT 모듈형 PK 및 NPS에 관여하는 효소학은 동선성 규칙의 예외로 인식됩니다. 이러한 의미에서, 생물정보학 출력 소프트웨어의 이종발현 및 정제는 예측할 수 없는 효소 기능 및 특이한 생화학52,,53,,54를해명하는 데 도움이 될 수 있다. WGS에 대한 비용이 게놈 채굴에 대한 핸디캡을 나타내지 않기 때문에 공공 데이터베이스의 농축은 보다 정확한 예측과 새로운 전문 대사 산물의 발견으로 이어질 것입니다.
마지막으로, 통합 대사체 및 게놈 채굴 접근법의 가장 강력한 장점은 게놈, 전사체 및 유전체학을 연결하는 자동화되고 높은 처리량 분석을 통해 유전체형 및 화학형 복제를 수행하는 타당성과 관련이 있습니다. 유전자를 분자와 효율적으로 연결하는 대사체 데이터.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 재정 지원은 상파울루 연구 재단에 의해 제공되었다 - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 및 2014/50249-8~ L.G.O; 2013/12598-8 및 2015/01013-4~ R.S.; 및 2019/08853-9- C.F.F.A. B.S.P, C.F.F.A., 및 L.G.O.는 국가 과학 기술 개발위원회 - CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, 및 313492/2017-4)로부터 펠로우십을 받았습니다. L.G.O.는 또한 과학의 여성을 위한 프로그램(2008, 브라질 판)에서 제공하는 보조금 지원에 감사드립니다. 모든 저자는 CAPES (고등 교육 인력의 개선을위한 조정)가 브라질에서 졸업 후 프로그램을 지원하기위한 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | AA1120-048 | HPLC grade |
| Agar | Oxoid | LP0011 | NA |
| Apramycin | Sigma Aldrich | A2024 | NA |
| Carbenicillin | Sigma Aldrich | C9231 | NA |
| Centrifuge | Eppendorf | NA | 5804 |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C3175 | NA |
| Column C18 | Agilent Technologies | NA | ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902 |
| Kanamycin | Sigma Aldrich | K1377 | NA |
| Manitol P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Microcentrifuge | Eppendorf | NA | 5418 |
| Nalidixic acid | Sigma Aldrich | N4382 | NA |
| Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | F548S | NA |
| Q-TOF mass spectrometer | Agilent technologies | NA | 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS |
| Sacarose P.A.- A.C.S. | Synth | NA | NA |
| Shaker/Incubator | Marconi | MA420 | NA |
| Sodium Chloride | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Soy extract | NA | NA | NA |
| Sucrose | Synth | NA | P. A. - ACS |
| Thermal Cycles | Eppendorf | NA | Mastercycler Nexus Gradient |
| Thiostrepton | Sigma Aldrich | T8902 | NA |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | NA |
| Tryptone Soy Broth | Oxoid | CM0129 | NA |
| UPLC | Agilent Technologies | NA | 1290 Infinity LC System |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | NA |
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